Extracto
La homeostasis en los tejidos eucariotas está estrechamente regulada por un intrincado equilibrio del prosupervivencia y señales antisurvival. El supresor de tumores PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma 10), una fosfatasa de especificidad dual, juega un papel funcional en la detención del ciclo celular y la apoptosis. NF-kappa B y sus reguladores aguas abajo (tales como VEGF) desempeñan un papel central en la prevención de la apoptosis, la promoción del crecimiento de la inflamación y tumor. Por lo tanto, pensamos que para estimar la expresión de PTEN polimerasa, poli-ADP-ribosa (PARP), NF-κBp50, NF-κBp65 y VEGF para evaluar el efecto de los suplementos de aceite de pescado en la señalización de apoptosis e inflamatoria en el carcinoma de colon. Ratas Wistar machos en el grupo que recibía la dieta purificada mientras que el Grupo II y III recibió modificados dieta suplementada con FO:CO (1:01) & amp; FO:CO (2.5:1), respectivamente. Estos se subdividen en los controles que reciben etilendiamina tetra-acético-ácido y los grupos tratados recibieron dimetilhidracina dihidrocloruro (DMH) /semana durante 4 semanas. Los animales se sacrificaron 48 horas después de la última inyección constituido fase de iniciación y que sacrificó después de 16 semanas constituyeron fase posterior a la iniciación. Hemos analizado la expresión de PTEN, NF-κBp50, NF-κBp65 por citómetro de flujo y la localización nuclear de NF-kB por inmunofluorescencia. PARP y VEGF se evaluaron por inmunohistoquímica. En la fase inicial, los animales que recibieron el DMH han demostrado una mayor% de las células apoptóticas, PTEN, PARP, la NF-κBp50, NF-κBp65 y VEGF sin embargo, en la fase posterior a la iniciación de alteración significativa en la apoptosis con una disminución de PTEN y el aumento de la PARP, la NF-κBp50 , se observaron NF-κBp65 y VEGF en comparación con los animales control. El tratamiento con ambas proporciones de aceite de pescado en las fases tanto, el aumento en el% de células apoptóticas, disminuyó PTEN, PARP, la NF-κBp50, NF-κBp65 y VEGF fueron documentados con respecto a animales tratados con DMH con efecto de ser más ejercida con una mayor ración en la fase posterior a la iniciación. Por lo tanto, el aceite de pescado se activa la apoptosis, disminuye el daño del ADN e inhibe la señalización inflamatoria de una manera dependiente de la dosis y el tiempo con el fin de inhibir la progresión de cáncer de colon
Visto:. Kansal S, Bhatnagar A, Agnihotri N (2014) Fish aceite suprime el crecimiento celular y el potencial metastásico mediante el control de PTEN y señalización NF-kB en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (1): e84627. doi: 10.1371 /journal.pone.0084627
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2013; Aceptado: 25 Noviembre 2013; Publicado: 8 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Kansal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una beca del Consejo indio de Investigación médica (Inmuno /18/27/11 /2008- ECD-I). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
informes epidemiológicos han demostrado que la incidencia de cáncer está aumentando en todo el mundo [1]. El cáncer es la enfermedad en la que hay una desregulación de la proliferación celular y la muerte celular. En las células cancerosas, las vías de transducción de señales endógenas quedan perturbados para redirigir las decisiones celulares de la diferenciación y la apoptosis de proliferación y, después, la invasión [2]. Fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) vía de señalización tiene un papel crucial en la promoción de la supervivencia celular mediante la inhibición de la apoptosis. PI3K convierte la membrana plasmática de lípidos de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP
2) para fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP
3), que después recluta proteínas que contienen una homología de pleckstrin (PH) de dominio a membranas celulares [3] como quinasa-1 fosfo dependiente (PDK1) y Akt. Activado Akt es el mediador predominante y esencial para la regulación de la apoptosis y la proliferación mediante dirigidos a diferentes sustratos aguas abajo: I? B quinasa, Bcl-2, el citocromo c y otros [4], [5]. Actividad de la vía PI3K /Akt está regulada negativamente por la fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma 10 (PTEN). PTEN desfosforila el grupo OH 3 'y convierte PIP
3 en PIP
2, lo que lleva a la activación de la apoptosis y por lo tanto funciona como un supresor de tumores [6]. Los informes han demostrado que la expresión de
PTEN
ha sido suprimida transcripcionalmente a través de la activación de NF-kB. El NF-kappa B se compone de transactivación relación subunidad /p65 y la unión al ADN subunidades p50 y p52, que se procesa a partir de p105 y p100 del precursoras, respectivamente [7]. NF-kappa B está secuestrado en el citoplasma por la I? B inhibidor para prevenir su activación transcripcional en condiciones no estimuladas. Las citoquinas inflamatorias causan la fosforilación de I? B, que a su vez libera NF-kappa B, que se transloca a continuación en el núcleo y afecta a la expresión de genes diana que tienen un papel clave en la inhibición de la apoptosis, la promoción del crecimiento del tumor, y la activación de respuestas inflamatorias que promueve aún más la metástasis mediante el aumento de la expresión del factor de crecimiento endotelial vasucular (VEGF) [8]. La modificación covalente de proteínas por Poli ación (ADP-ribosil) es una respuesta bioquímica inmediato y dramático al daño del ADN. Es una modificación proteína ubicua que se encuentra en células de mamífero que modula muchas respuestas celulares, incluyendo la reparación del ADN. Poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP) cataliza la polimerización de unidades de ADP-ribosa de NAD donante
+ moléculas en proteínas diana, dando como resultado la unión de polímeros lineales o ramificados [9]. PARP presentan funciones celulares pleiotrópicos que van desde el mantenimiento de la estabilidad genómica y remodelación de la cromatina a la regulación de la muerte celular de tal manera, los homólogos de PARP como objetivos prometedores en la terapia del cáncer [10].
informes epidemiológicos han demostrado que el cáncer colorrectal ( CCR) es el tercer cáncer más común en los hombres (después del cáncer de próstata y el cáncer de pulmón) y las mujeres (después del cáncer de mama y el cáncer de pulmón) [1]. Los estudios experimentales han demostrado que una variedad de factores están relacionados con el desarrollo de CRC [11]. Los experimentos previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la administración de aceite de pescado (n-3 PUFA) /aceite de maíz (n-6 PUFA) en la relación de 2,5 /1 tiene una mejor eficacia en comparación con 1/1 para la quimioprevención del experimentalmente cáncer colorrectal inducido por [12]. Otro estudio ha demostrado que la acción quimiopreventivo de diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz podría estar mediada por Ras vía [13] señalización. Uno de los otro estudio de nuestro laboratorio han demostrado que el aceite de pescado (FO) y aceite de maíz (CO) en relación 2.5:1 alterado los parámetros de la membrana mitocondrial, ROS, y Ca
2 + de tal manera a fin de aumentar apoptosis en ambas fases, mientras que FO:CO en relación 1:01 aumento de la apoptosis sólo en la fase posterior a la iniciación [14]. Se ha demostrado que los principios de EPA y DHA aumentó el nivel de PTEN que a su vez inhibe la transcripción de genes anti-apoptóticos, por lo tanto, la demostración de los efectos beneficiosos del aceite de pescado sobre el crecimiento de células tumorales de mama [15]. Por lo tanto, el presente estudio se realizó para comprender el papel de diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz en las vías de apoptosis y el potencial metastásico mediadas por PTEN y NF-kB en el cáncer de colon inducida experimentalmente.
Materiales y Métodos
Químicos
N, N '
-Dimethylhydrazine dihidrocloruro (DMH), PARAFORMALDEHÍDO (PFA), yoduro de propidio (PI), Hoechst 33342 (H342) y albúmina de suero bovino (BSA ) se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU.. El anticuerpo monoclonal contra PTEN se adquirió de genescript, Piscataway, NJ, EE.UU.. Los anticuerpos monoclonales contra la PARP, VEGF, p50 NF-kB y p65 NF-kB se adquirieron de Santacruz, CA, EE.UU. y BD Biosciences, MD, EE.UU., respectivamente. isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado de cabra anti-ratón IgG
1 se adquirió de Bangalore Genei, Bangalore, India. aceite de pescado Maxepa [que contiene 180 mg de ácido eicosapentaenoico (EPA) y 120 mg de ácido docosahexaenoico (DHA) /ml] se obtuvo de Merck Chemicals Limited, Goa, India y aceite de maíz que contiene ácido 58,8% linoleico, 26,4% oleico, 1,3% linolénico y ácidos grasos saturados 12,8% se adquirió de Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU.. La mezcla mineral (Agrimin) se obtuvo de Virbac Animal salud India Pvt. Ltd., Mumbai, India. Todos los demás productos químicos utilizados en el estudio fueron de grado analítico.
Animales y dieta
ratas Wistar machos con un peso de 100-200 g se obtuvieron a partir y se alojaron en la Casa Central Animal, Universidad de Panjab, Chandigarh . Los protocolos experimentales fueron aprobados por el "Comité Institucional de Ética Animal, Universidad de Panjab, Chandigarh" (Ref. No. 1-12 /AICE 3/9/2009) y llevado a cabo de acuerdo con las directrices de la "Academia Nacional de Ciencias de la India" para el uso y cuidado de animales de experimentación. Los animales se alojaron en jaulas de polipropileno en la casa de los animales y se aclimataron antes de ser utilizado en el estudio experimental. se le dio agua
ad libitum
. Después de una semana de aclimatación, los animales se dividieron aleatoriamente en los diferentes grupos y se alimentaron con la dieta experimental durante cuatro semanas. La composición de la dieta experimental se ha dado en la Tabla 1. Las dietas fueron preparados sobre la base del Instituto Americano de Nutrición dieta de referencia estándar de AIN-76A [16]. La composición de todas las dietas experimentales se ajustó de manera que los animales en todos los grupos podrían consumir la misma cantidad de calorías [12].
Diseño Experimental
El diseño experimental se representa en la figura . 1. ratas Wistar machos (N = 96) fueron divididos en los siguientes grupos experimentales:
Los colonocitos aisladas se incubaron con Hoechst 342 (H342) de tinte y PI. Las microfotografías fueron adquiridas mediante microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 80
i
) grupo de control A, B tratados con DMH, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. de color azul oscuro representa las células vivas normales, débil azul o rosa representa células apoptóticas (magnificación × 400). E) Representación gráfica de% de células vivas y de apoptosis en diferentes grupos. Los resultados se expresan como media ± S.D.. para n = 4 (
** p & lt; 0,01 de control WRT,
### p & lt; 0,001 WRT DMH).
grupo de control)
- Estos animales recibido dieta purificada y una inyección intraperitoneal semanal de ácido tetra-acético etilendiamina 1 mM (EDTA), pH 6,5, durante un período de 4 semanas
DMH tratada
-. Los animales de este grupo se les dio la dieta purificada junto con una inyección intraperitoneal semanal de DMH (20 mg /kg de peso corporal) durante 4 semanas.
FO + CO (01:01) + EDTA
Los animales recibieron una dieta modificada complementa con una relación 01:01 de FO y CO. una inyección intraperitoneal semanal de EDTA también fue dado por un período de 4 semanas.
FO + CO (01:01) + DMH
una dieta modificada complementado con una relación 01:01 de FO y CO fue dado a los animales de este grupo y una inyección intraperitoneal semanal de DMH por un período de 4 semanas.
FO + CO (2.5 :1) + EDTA
los animales de este grupo se les dio la dieta suplementada con modificada FO + CO en la relación de 2.5:1 y recibió una inyección intraperitoneal semanal de EDTA durante un periodo de 4 semanas.
FO + CO (2.5:1) + DMH
una dieta modificada complementado con FO + CO en la relación de 2.5:1 fue dado a los animales de este grupo y una inyección intraperitoneal semanal de DMH por un período de 4 semanas.
Cada grupo se subdividió para los estudios sobre el inicio y fase posterior a la iniciación y los animales se distribuyeron por igual entre las dos fases. Los animales que se sacrificaron 48 h después de la última EDTA /inyecciones de DMH constituyeron la fase de iniciación [17] y de los animales en las 12 semanas después de que el régimen de tratamiento constituye el estudio fase posterior a la iniciación. Todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical.
El aislamiento de los colonocitos
Los colonocitos se aislaron por el método de Sanders [18]. todo el colon se corta longitudinalmente para exponer lumen y se coloca en caliente Ca
2 + y Mg
2 + solución salina tamponada de Hank libre (HBSS), 30 mmol /l de EDTA, 5 mmol /l de ditiotreitol (DTT) , 0,1% de BSA (albúmina de suero bovino). Después de una incubación de 15 min agitando a 37 ° C, el lado de la mucosa se raspó con cuidado para eliminar las criptas intactas. Las células aisladas se centrifugaron a 2200 rpm y se lavaron dos veces en HBSS que contiene CaCl caliente 1,3 mM
2, mM MgSO 1
4 y 0,1% de BSA. Las células se contaron usando un hemocitómetro y su viabilidad se verificó mediante el método de exclusión con azul de tripano [19].
Estimación de las células apoptóticas en vivo y
El porcentaje de células apoptóticas en vivo y fueron evaluadas por inmunofluorescencia . colonocitos aislados (1-2 x 10
6) se resuspendieron en 1 ml de PBS y se incubaron con 10 l de Hoechst 342 (H342) colorante (1 mM) a 37 ° C durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS. A continuación, las células se incubaron con 10 l de PI (1 mg /ml) a 37 ° C durante 10 min. Las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron en PBS. Las microfotografías fueron adquiridas mediante el microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 80
i
) y analizados mediante formación de imágenes del Norte Eclipse Elementos-D (NIS-D) de software. se fusionaron microfotografías de células con H342 y PI. En microfotografías fusionadas, células con células de color rosa y las células con color azul oscuro en la periferia representan células apoptóticas haber condensan /ADN fragmentado mientras que se desmayó azul todo fueron consideradas como las células normales.
Análisis de PTEN, NF p50 y p65 kappa B NF-kB por el citómetro de flujo
Las proteínas intracelulares se estimaron por citómetro de flujo. Los colonocitos se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS dos veces, los colonocitos se permeabilizaron con 100% metanol enfriado en hielo (añadió gota a gota) y se dejan durante 15 min a -20 ° C. Las células se lavaron de nuevo en PBS frío dos veces. Aproximadamente 1 × 10
se añadieron 6 células a un tubo de FACS, se resuspendieron en tampón de saponina (PBS que contiene 0,1% de saponina y 2% de BSA) y se incubó durante 30 min a 4 ° C. Las diferentes alícuotas de colonocitos fueron incubadas con diluido PTEN, p50 NF-kB y p65 NF-kappa B (1:100) anticuerpos monoclonales para 30 min a temperatura ambiente y después se lavaron una vez con tampón de saponina. Los colonocitos se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC diluido durante 45 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con tampón de saponina y después con PBS. Las células se resuspendieron en PBS. La adquisición de cada muestra se llevó a cabo en FACS Canto (BD Biosciences, EE.UU.) y se analizó los datos recogidos mediante el software de la diva BD FACS. Los controles posteriores para PTEN, p50 NF-kB y p65 NF-kB también se llevaron a cabo de forma simultánea. Los resultados de PTEN, p50 NF-kappa B y NF-kB p65 fueron representados como la media de Net MFI (MFI de las células tratadas con Ab - MFI de las células solamente)
La localización de p50 NF-kappa B y NF. -κB p65 mediante inmunofluorescencia
Los colonocitos fijos aislados se lavaron con PBS frío dos veces. Las células se secaron al aire sobre portaobjetos de vidrio (VWR Scientific, Thane, Maharashtra, India) y se dejaron adherir durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 y la unión no específica fue bloqueada con 2% (w /v) de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, antes de la incubación con el anticuerpo monoclonal diluido contra p50 NF-kappa B (1 :50) y p65 NF-kappa B (01:50) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron con PBS, se incubaron con diluido conjugado con FITC anti-IgG de ratón
1 durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron de nuevo con PBS. Las secciones se contratiñeron con PI durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron con PBS. Las secciones fueron montadas y selladas con la pintura de uñas transparente. Las imágenes fueron adquiridas mediante un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 80
i
) y se analizaron con los elementos de D-Norte Eclipse de imagen (NIS-D) de software. se fusionaron microfotografías de células con p50 NF-kB /p65 y PI. Después de la fusión de las fotomicrografías, color verde indica que la expresión de NF-kB p50 /p65 en el citoplasma de la célula, el color rojo representa la tinción nuclear con PI y color amarillo indica la localización de p50 NF-kB /p65 en el núcleo de la célula .
estimación inmunohistoquímica de VEGF y PARP
Las secciones de tejido (2-3 m de espesor) fueron montados en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Los portaobjetos se calentaron a 65 ° C antes de la desparafinación en xileno. Los portaobjetos se rehidrataron con soluciones de alcohol en serie (100%, 90%, 70%, 50%, 30%). La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante la incubación de los portaobjetos con 3% de H
2O
2 (en metanol) durante 20 min a 4 ° C. Las secciones se bloquearon usando 2% de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. La recuperación del antígeno se realizó con tampón de recuperación (pH 6,0) utilizando el horno de microondas (microondas 5 min para VEGF y 5 min × 2 para PARP). Los portaobjetos se dejaron enfriar durante 20 minutos. Tras la recuperación de antígenos, las secciones se incubaron con VEGF (1:100) y PARP (01:50) para anticuerpos durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se lavaron en PBS y seguido de incubación de 2 horas con anticuerpo conjugado con HRP anti-ratón (1:100) para el VEGF y el anticuerpo conjugado con HRP anti-conejo (1:100) para PARP a 37 ° C en una cámara húmeda. Los portaobjetos se visualizaron utilizando DAB y H
2O
2. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina durante 2 min, seguido de lavado en agua desionizada H
2O. Los portaobjetos se deshidrataron y se montó con DPX para su análisis. Las imágenes fueron adquiridas y analizadas usando la Nikon Eclipse 80
i
microscopio (Japón) y el norte de Eclipse de imagen Elementos-D (NIS-D) de software.
Análisis estadístico
La Los resultados se expresaron como media ± SD Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA después de comprobar la normalidad por parcela Q-Q. El software utilizado para el análisis estadístico fue el SPSS 18,0 paquete de software para Windows. La significación estadística se determinó por ANOVA de una vía con las pruebas de Bonferroni de comparación múltiple post hoc, y se consideraron significativas para p & lt diferencias;. 0.05
Resultados
Efecto de la suplementación de aceite de pescado sobre la apoptosis /necrosis en el inducido experimentalmente cáncer de colon
en el presente estudio,% de las células apoptóticas se calculó utilizando la inmunofluorescencia y los resultados se representan en la Fig. 1 y 2. En la fase de iniciación, los animales que recibieron DMH han mostrado un aumento significativo en% de células apoptóticas en comparación con los animales de control (Figura 1). Sin embargo, el tratamiento con FO + CO (01:01) + DMH y FO + CO (2.5:1) + DMH, una disminución significativa en% de células vivas y un aumento significativo en el% de células apoptóticas fueron observados en comparación con DMH animales tratados. Se ha observado que en la fase post-iniciación, en el tratamiento con DMH, no hubo alteración significativa en el% de células apoptóticas en comparación con los animales de control (Figura 2). Al recibir tanto las proporciones, de aceite de pescado y aceite de maíz, se ha demostrado que una disminución significativa en% de células vivas y una mejora significativa en% de células apoptóticas en comparación con los animales tratados con DMH.
El aislado colonocitos se incubaron con 342 Hoechst tinte y PI (H342). Las microfotografías fueron adquiridas mediante microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 80
i
) grupo de control A, B tratados con DMH, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. de color azul oscuro representa las células vivas normales, débil azul o rosa representa células apoptóticas (magnificación × 400). E) Representación gráfica de% de células vivas y de apoptosis en diferentes grupos. Los resultados se expresan como media ± S.D.. para n = 4 (
### P & lt; 0,001 WRT DMH).
alteraciones La alteración en la expresión de PTEN en el tratamiento con diferentes proporciones de aceite de pescado
Después de evaluar en% de células apoptóticas en la recepción de estos PUFAs, entonces pensamos para examinar la expresión del regulador de la apoptosis. El supresor de tumores PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina) es el regulador más importante vía de señalización apoptótica. Por lo tanto, en el estudio actual, se estima la expresión de PTEN y los resultados de PTEN se dan en la Tabla 1. En la fase de inicio, los datos de citometría de flujo se ha representado que la expresión de PTEN fue significativamente elevado en DMH animales tratados en comparación con los animales control, mientras que en el tratamiento de los animales con diferentes proporciones de FO + CO, PTEN se incrementó considerablemente con respecto a los animales control, pero el incremento fue menor en comparación con los animales tratados con DMH. Los datos de la fase post-iniciación ha demostrado que la expresión de PTEN se redujo significativamente en el tratamiento con DMH con respecto a los animales control. Sin embargo, el tratamiento con ambos las proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz, la expresión de PTEN se aumentó considerablemente. El aumento fue más significativo con FO + CO (2.5:1) + DMH en la fase posterior a la iniciación.
Efecto de la suplementación de aceite de pescado y aceite de maíz en la actividad de PARP
PARP es una abundantes enzimas de unión al ADN que detecta las roturas de la cadena de ADN. enzima PARP desempeña un papel importante en diferentes funciones celulares, haciendo así PARP como un objetivo prometedor en la terapia del cáncer [10]. Por lo tanto, en el presente estudio, se analizó la actividad de PARP para examinar el efecto de diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz en la enzima de reparación del ADN. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica de PARP se muestran en la fig. 3. La mucosa del colon de los animales de control se ha representado muy moderada o débil expresión de PARP. En el tratamiento con DMH, la expresión de PARP se aumentó tanto en la fase en comparación con los animales control. Las células fueron fuertemente positivas para la PARP en la fase posterior a la iniciación en comparación con la fase de iniciación. Sin embargo, en la recepción de las diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz, la expresión de PARP se redujo en comparación con los animales tratados con DMH el efecto se manifiesta con FO + CO (2.5:1) + DMH en la fase posterior a la iniciación.
La tinción inmunohistoquímica de la PARP en formol fija parafina secciones embebidas de tejido del colon. A-D muestra las microfotografías representativas de fase de iniciación y E-H representa la fase posterior a la iniciación ( "flecha" representa la expresión de PARP). (A y E) de control, (B y F) DMH tratada, (C y G) FO + CO (01:01) + DMH, (D y H) FO + CO (2.5:1) + DMH (400 aumentos) .
regulación a la baja de las subunidades de NF-kB en la administración de suplementos de aceite de pescado
La activación de NF-kB es un evento crucial en el crecimiento tumoral inducido por la inflamación y la progresión [20]. NF-kappa B es un factor de transcripción ubicuo que desempeña un papel fundamental en la supervivencia celular y la muerte celular [21]. NF-kappa B está presente en el citosol en forma ligada con I? B. La fosforilación de residuos de serina de las proteínas quinasas I? B por I? B (IKK), se dirige a la I? B para la degradación proteasomal. Las subunidades de NF-kB libres (p50 y p65) se transportan al núcleo como un dímero y se dirigen a los promotores que conducen a la activación de genes que están involucrados en la proliferación celular, la invasión y la muerte celular. NF-kappa B está regulada negativamente por PTEN y otros objetivos muchos genes anti-apoptóticos tales como Bcl-2 y Bcl-XL [15]. Por lo tanto, después de evaluar la expresión de PTEN, entonces pensamos analizar la expresión, así como la localización de las dos subunidades de NF-kB en el cáncer de colon inducida experimentalmente.
expresión y localización de NF-kB p65
la expresión de p65 NF-kB se ha medido por citómetro de flujo y la localización se examinó mediante microscopio de fluorescencia. Los resultados de citometría de flujo de la fase de iniciación representan que la expresión de p65 NF-kB se ha aumentado de manera significativa en el tratamiento con DMH en comparación con los animales de control. El tratamiento con FO + CO (01:01) + DMH, p65 NF-kB se aumentó aún más significativamente, sin embargo, al recibir FO + CO (2.5:1) + DMH, la expresión de p65 NF-kB se redujo significativamente en comparación con el DMH los animales tratados (Tabla 2). Los datos de fase de post-iniciación ha revelado que en dar DMH, la expresión de NF-kB p65 se incrementó significativamente en comparación con los animales control. En el tratamiento con tanto las proporciones de FO + CO + DMH, la expresión se redujo significativamente con respecto al grupo tratado DMH. La disminución fue más significativa con FO + CO (2.5:1) + DMH en comparación con FO + CO (01:01) + DMH.
A medida que las subunidades NF-kB activado translocan desde el citoplasma al núcleo, por lo tanto, en el presente estudio, se evaluó también la localización nuclear de NF-kB. Los resultados de la localización de p65 NF-kappa B se resumen en la fig. 4. Los datos de inmunofluorescencia ha revelado que en el tratamiento con DMH, el% de células que tienen p65 NF-kappa B en el núcleo y el citoplasma, fue significativamente superior en las dos fases en comparación con los animales control (Figura 4B & amp;. 4F). Sin embargo, el tratamiento con diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz, la localización de NF-kappa B p65 del citoplasma al núcleo se redujo con el efecto de ser más marcadas con FO + CO (2.5:1) + DMH en la fase posterior a la iniciación .
Los colonocitos fijos aislados se permeabilizaron y se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra p65 NF-kappa B y el anticuerpo secundario conjugado con FITC correspondiente Las secciones se counterstained con PI para visualizar la localización nuclear. fluorescencia roja representa la tinción nuclear por PI sin expresión de NF-kB (representado por "flecha de puntos") y la fluorescencia verde indica que la expresión de p65 NF-kB. El color amarillo indica la localización de NF-kB p65 del citoplasma al núcleo (representado por "flecha"). A-D representa la fase de iniciación y E-H representa la fase posterior a la iniciación. (A y E) de control, (B y F) DMH tratada, (C y G) FO + CO (01:01) + DMH, (D y H) FO + CO (2.5:1) + DMH (400 aumentos) .
expresión y localización de NF-kB p50
el análisis de citometría de flujo se ha demostrado que el tratamiento con carcinógeno, la expresión de p50 NF-kB se incrementó significativamente (p & lt; 0,001) tanto en la fase en comparación con los animales control (Tabla 3). Sin embargo, el tratamiento con FO + CO (01:01) + DMH y FO + CO (2.5:1) + DMH, la expresión de p50 NF-kB se redujo significativamente (p & lt; 0,001) en comparación con animales tratados con DMH en tanto la iniciación, así como la fase posterior a la iniciación.
En el presente estudio, la localización de p50 NF-kB del citoplasma al núcleo hecho por el doble etiquetado. datos de inmunofluorescencia ha revelado que en el tratamiento con DMH, el% de células con NF-kB p50
+ en el núcleo y el citoplasma se aumentaron significativamente tanto en la fase en comparación con los animales control (figura 5B & amp;. 5F). Sin embargo, el tratamiento con diferentes proporciones de aceite de pescado y aceite de maíz, la localización de NF-kB p50 del citoplasma al núcleo que se ha rechazado siendo el efecto más pronunciado con FO + CO (2.5:1) + DMH en el post-iniciación fase.
Los colonocitos fijos aislados se permeabilizaron y se incubaron con un anticuerpo monoclonal contra p65 NF-kappa B y el anticuerpo secundario conjugado con FITC correspondiente Las secciones se counterstained con PI para visualizar la localización nuclear. fluorescencia roja representa la tinción nuclear por PI sin expresión de NF-kB (representado por "flecha de puntos") y la fluorescencia verde indica que la expresión de p65 NF-kB. El color amarillo indica la localización de NF-kB p65 del citoplasma al núcleo (representado por "flecha"). A-D representa la fase de iniciación y E-H representa la fase posterior a la iniciación. (A y E) de control, (B y F) DMH tratada, (C y G) FO + CO (01:01) + DMH, (D y H) FO + CO (2.5:1) + DMH (400 aumentos) .
Efecto del aceite de pescado sobre el VEGF, tanto en el inicio y la fase posterior a la iniciación del cáncer de colon
la angiogénesis es un componente esencial del desarrollo embrionario normal, que requieren interacciones complejas entre las células endoteliales y las células en el tejido circundante. La señalización de VEGF y VEGFR sus receptores desempeñan papeles clave en estas interacciones [22]. VEGF se une a estos receptores y estimula la proliferación endotelial celular, la migración y la supervivencia. Por lo tanto, en el presente estudio, se estimó el efecto de los suplementos de aceite de pescado y aceite de maíz en la expresión de VEGF. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica de VEGF para el estudio actual se representan en la fig. 6. La mucosa del colon de animales de control se ha representado una débil expresión de VEGF en las células endoteliales. En el tratamiento con DMH, la expresión de VEGF fue elevada en las células endoteliales de los dos puntos, tanto en las fases en comparación con los animales control. El aumento en la expresión de VEGF fue más pronunciado en la fase de post-iniciación en comparación con la fase de iniciación. Al recibir el FO + CO (01:01) + DMH, no hubo diferencia significativa en la expresión de VEGF en la fase de iniciación en comparación con el DMH los animales tratados, sin embargo, el tratamiento con FO + CO (01:01) + DMH en la fase posterior a la iniciación, se disminuyó la expresión de VEGF. Al recibir FO + CO (2.5:1) + DMH, la expresión de VEGF se redujo en las fases en comparación con los animales tratados con DMH.
La expresión de VEGF se analizó mediante inmunohistoquímica en secciones embebidas en parafina fijadas con formalina de tejido del colon. A-D muestra las microfotografías representativas de fase de iniciación y E-H representa la fase posterior a la iniciación (→ representa la expresión de VEGF). (A y E) de control, (B y F) DMH tratada, (C y G) FO + CO (01:01) + DMH, (D y H) FO + CO (2.5:1) + DMH (400 aumentos) .
Discusión
se ha demostrado por los informes anteriores de que DHA y EPA, dos componentes activos del aceite de pescado, impiden la transcripción de genes dependientes de NF-kB y aumenta la expresión de PTEN en las células pancreáticas, de mama y cáncer de colon. Los estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que FO + CO (2.5:1) tiene mejor eficacia quimiopreventivo en comparación con FO + CO (01:01) en el cáncer de colon inducida experimentalmente [12]. Por lo tanto, el presente estudio se llevó a cabo para entender el mecanismo de acción de estos AGPI quimiopreventivo de la dieta sobre las vías de apoptosis. Los resultados de nuestro estudio han demostrado que la adición de aceite de pescado y aceite de maíz en la dieta ejerce efecto quimiopreventivo diferencial mediante el aumento de la apoptosis que puede ser mediada a través de la alteración en la expresión de PTEN y la señalización de NF-kappa B
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A principal regulador de la apoptosis es la vía de PTEN. PTEN antagoniza la actividad de PI3K mediante la conversión de PIP3 de nuevo a PIP2, y por lo tanto, la reducción de la piscina celular de PIP3 [23], [24]. La pérdida de la función de supresor de tumores PTEN gen, es la aberración genética más común en el cáncer [25].