Extracto
Antecedentes
La multirresistencia (MDR) en el cáncer gástrico sigue siendo un reto importante para el tratamiento clínico. La activación del factor de transcripción 4 (ATF4) es un gen de respuesta al estrés que participan en la homeostasis y la protección celular. Sin embargo, la expresión y función de ATF4 en el cáncer gástrico MDR sigue siendo desconocido. En este estudio, investigamos si ATF4 jugar un papel en el cáncer gástrico MDR y sus mecanismos potenciales.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos demostrado que la sobreexpresión ATF4 confered el fenotipo MDR en las células de cáncer gástrico, mientras que desmontables de ATF4 en el MDR variantes induce re-sensibilización. En este estudio también mostró que el NAD
+ - se requiere dependiente de SIRT1 de la histona desacetilasa para el efecto MDR ATF4-inducida en células de cáncer gástrico. Hemos demostrado que ATF4 facilitó MDR en células de cáncer gástrico a través de la unión directa al promotor SIRT1, lo que resulta en la SIRT1 sobre regulación. De manera significativa, la inhibición de
SIRT1 fotos: por pequeños ARN de interferencia (siRNA) o un inhibidor específico (EX-527) reintrodujo la sensibilidad terapéutica. Además, un mayor /relación de Bax y Bcl-2 nivel de expresión de MDR1 se encuentran en las células que sobreexpresan ATF4.
Conclusiones /Importancia
Nos mostró que ATF4 tuvo un papel clave en la regulación de la MDR en células de cáncer gástrico en respuesta a la quimioterapia y estos resultados sugieren que la orientación ATF4 podría aliviar la resistencia terapéutica en el cáncer gástrico
Visto:. Zhu H, L Xia, Zhang y, Wang H, W Xu, Hu H, et Alabama. (2012) Activación del factor de transcripción 4 confiere una resistencia a múltiples fármacos fenotipo de células de cáncer gástrico a través de transactivación de la expresión de SIRT1. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10.1371 /journal.pone.0031431
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 5 Septiembre, 2011; Aceptó 8 de enero de 2012; Publicado: 17 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas combinadas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (NO.81090270, NO.81090273, y NO.81000864), la Fundación de Ciencias de china Postdoctoral (NO.20100471776), la tecla Programa Nacional de Investigación básica de Desarrollo de china ( NO. 2010CB529302), y el Proyecto Nacional de Ciencia y Tecnología Municipal (2009ZX09103-667 y 2009ZX09301-009-RC06). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
resistencia a múltiples fármacos es normalmente la causa principal de fracaso de la quimioterapia contra los tumores malignos, incluyendo el cáncer gástrico [1] .La resistencia a múltiples fármacos término se utiliza clásicamente para definir un fenotipo de resistencia a la que las células se vuelven resistentes simultáneamente a diferentes fármacos sin parecido estructural obvio y con diferentes objetivos celulares [2]. MDR se produce con más frecuencia con nuevos fármacos que tienen eficacia más significativa después de su primera aplicación en el tratamiento del cáncer. La utilidad clínica de múltiples fármacos está limitado tanto por la resistencia de las células tumorales natural y adquirida, que casi siempre es multifactorial en la naturaleza [3]. Los factores que pueden afectar la sensibilidad de drogas incluyen: aceleración de flujo de salida de drogas, la activación e inactivación de drogas, las alteraciones en el objetivo de drogas, la metilación del ADN, el procesamiento del daño inducido por fármacos, y la evasión de la apoptosis [4]
El cáncer gástrico. es relativamente insensible a agentes quimioterapéuticos. Los mecanismos resistentes a múltiples fármacos en células de cáncer gástrico han sido ampliamente investigados en nuestro laboratorio y en otros lugares [1], [4], [5], sin embargo, no han sido completamente aclarada, lo que indica que otras moléculas o vías desconocidas pueden estar implicados en el desarrollo de MDR
.
en células de mamíferos, la traducción eucariótica factor de iniciación 2 α subunidad (eIF2α) es fosforilada por quinasas diferentes eIF2α en respuesta a diferentes señales de estrés, incluyendo anoxia /hipoxia, estrés del retículo endoplásmico, la privación de aminoácidos, y oxidativa estrés. Este evento de fosforilación conduce a una rápida disminución de la biosíntesis de proteínas concurrente mundial con inducción de la expresión de la traducción de los genes, incluyendo
ATF4
que funcionan para aliviar el daño celular de estrés [6], [7]. Aunque ATF4 puede jugar un papel pro-apoptótica en condiciones de estrés severo o prolongado,
ATF4
es un gen de respuesta al estrés potente cree que desempeñan un papel protector mediante la regulación de adaptación celular a las circunstancias adversas en la respuesta al estrés integrado ( ISR) [8], [9], [10]. Recientemente, se informó de la sobreexpresión de ATF4 a ser prominente en una amplia variedad de tumores y para proteger las células tumorales contra múltiples tensiones, así como una amplia gama de agentes terapéuticos del cáncer [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Los posibles mecanismos responsables de esta protección incluyen la inducción de la autofagia, la promoción de la reparación de daños en el ADN, y sobre regulación de glutatión intracelular [12], [13], [14], [17]. Sin embargo, la expresión y función de ATF4 en el cáncer gástrico MDR sigue siendo desconocido.
En este estudio, se informó de que ATF4 fue significativamente hasta reguladas en la respuesta MDR de células de cáncer gástrico en comparación con las células de control parental. Desmontables de
ATF4 fotos: por siRNA significativamente sensibilizado células con MDR a una variedad de agentes quimioterapéuticos, mientras que la sobre regulación de ATF4 en SGC7901 y las células AGS los hacía resistentes a múltiples fármacos. También demostramos que ATF4 promueve el cáncer gástrico MDR en parte a través hasta la regulación de la expresión de SIRT1. Y la inhibición de SIRT1 podría revertir en parte el cáncer MDR fenotipo gástrico mediada por ATF4. Estos datos sugieren que la orientación ATF4 puede proporcionar una opción terapéutica para revertir el cáncer gástrico de MDR.
Resultados
ATF4 modula el fenotipo MDR de células de cáncer gástrico
Para determinar si ATF4 está implicado en el desarrollo de la MDR en células de cáncer gástrico, los niveles de ATF4 se detectaron por transferencia de Western y qPCR en la línea celular SGC7901 y su MDR variantes, SGC7901 /VCR y SGC7901 /ADR. Ambos niveles de proteína y ARNm de ATF4 eran mucho más altos en las líneas celulares resistentes que en las células parentales (Fig. 1A).
(A) la proteína y los niveles de ARNm de ATF4 en células de cáncer gástrico MDR (SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR) y las células SGC7901 parentales fueron examinados por Western Blot y qPCR. β-actina y GAPDH fueron utilizados como control interno, respectivamente. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. (B) La respuesta de LV-Vector y LV-ATF4 transfectadas establemente SGC7901 y AGS a cisplatino se ensayó mediante el ensayo de formación de colonias. Las líneas celulares se trataron continuamente con 0 ó 0,25 mg /ml de cisplatino durante 14 días; medio se cambió cada 3 d. Las células se sembraron por triplicado, y el experimento se repitió tres veces. se muestran pozos representativos. Los gráficos proporcionan la cuantificación promedio como porcentaje de las células no tratadas. (C) LV-LV-SCR y siATF4 transfectadas de forma estable células SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR se trataron continuamente con 0 ó 0,5 mg /ml de cisplatino durante 14 días; medio se cambió cada 3 d. (D) y (E) SGC7901 LV-vector y LV-ATF4 transfectadas de forma estable líneas celulares SGC7901 y LV-SCR y LV-siATF4 transfectadas de forma estable /ADR células fueron tratadas con dosis indicadas de diferentes fármacos para 72 h.
in vitro
sensibilidad a los fármacos se ensayó en el ensayo de MTT. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. (F) y (G) LV-vector y LV-ATF4 transfectadas de forma estable líneas celulares SGC7901, LV-SCR y LV-siATF4 células SGC7901 transfectadas establemente /ADR y sus respectivos homólogos no tratados (NC) se cultivaron en medio fresco en presencia de cisplatino a las concentraciones indicadas (por SGC7901-NC, SGC7901-Vector, y SGC7901-ATF4, 5 mg /ml; para SGC7901 /ADR-NC, SGC7901 /ADR-SCR, y SGC7901 /ADR-siATF4, 10 g /ml) durante 36 h. A continuación, se realizaron Hoechst 33258 tinción nuclear y el ensayo de fragmentación del ADN. (H) SGC7901 y estables transfectadas líneas celulares SGC7901 /ADR que arriba se incubaron durante 6-24 horas más en medio fresco con las concentraciones indicadas de cisplatino (por SGC7901-vector y SGC7901-ATF4, 10 mg /ml; para SGC7901 /ADR- SCR y SGC7901 /ADR-siATF4, 20 g /ml). En el momento indicado, se recogieron los extractos de proteínas y se sometieron a análisis de inmunotransferencia para la caspasa-3 (formas no escindidas y escindidas). β-actina se utilizó como control interno.
Para investigar si la sobreexpresión ATF4 es suficiente para inducir un fenotipo MDR en células de cáncer gástrico,
ATF4
ADNc expresión se transfectó de forma estable en SGC7901 y células AGS. En primer lugar, la sensibilidad CDDP se ensayó usando un ensayo de formación de colonias. Como se muestra por la cuantificación del ensayo de formación de colonias, ATF4 sobreexpresión resultó en un aumento de casi 3 veces en el número de colonias en comparación con las células que expresan vector vacío (Fig. 1B). ensayos de MTT también indicaron que el CI
50 valores de SGC7901-ATF4 de ADR, VCR, CDDP, y 5-FU se incrementaron significativamente en comparación con las células transfectadas con vector vacío (Fig. 1D).
ATF4 niveles están elevados en las células de cáncer gástrico MDR, queríamos además para determinar si la orientación ATF4 podría volver a sensibilizar a las líneas celulares resistentes a múltiples fármacos. Desmontables de
ATF4
por siRNA en las células SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR llevado a una de 2 a 3 veces de reducción en el número de células cuando se utiliza en combinación con CDDP (Fig. 1C). Los datos en la Fig. 1E también sugieren que la baja regulación de
ATF4
invierte significativamente la resistencia de las células SGC7901 /ADR en respuesta a la quimioterapia.
A medida que la inhibición de la apoptosis es uno de los mecanismos importantes de la MDR, que también investigó la capacidad de las células SGC7901 /ADR transfectadas con el específico
ATF4
siRNA a someterse a la apoptosis inducida por CDDP por tinción y la fragmentación de ADN ensayos de Hoechst. El tratamiento de SGC7901-ATF4 y células SGC7901 /ADR-SCR con las concentraciones indicadas de CDDP durante 36 horas no indujo ninguna apoptosis, según la evaluación de Hoechst tinción nuclear (Fig. 1F) y los ensayos de fragmentación de ADN (Fig. 1G). Por el contrario, SGC7901-vector y SGC7901 /ADR-siATF4 células muestran la apoptosis significativa, con la aparición más frecuente de núcleos condensados y fragmentados y la formación de escalera de ADN. Además, se observó escisión más evidente de procaspasa-3 después del tratamiento con CDDP en células SGC7901 /ADR-siATF4 SGC7901-Vector y en comparación con células SGC7901-ATF4 y SGC7901 /ADR-SCR, respectivamente (Fig. 1H).
Tomados en conjunto, estos resultados indican que ATF4 confiere un fenotipo MDR en células de cáncer gástrico y que la orientación ATF4 proporciona un método de sensibilización de las células resistentes a los tratamientos químicos.
ATF4 hasta regula la expresión de SIRT1, MDR1 , Bcl-2 y Bax en células de cáncer gástrico
estudios previos han informado de que las células que sobreexpresan la SIRT1 está representada disminución de la sensibilidad a la quimioterapia por múltiples mecanismos [18], [19], [20], [21]. Teníamos curiosidad para determinar si
SIRT1
, que es un gen relacionado con el estrés crítico para el desarrollo MDR, podría ser el blanco de abajo ATF4 responsable de mediar MDR ATF4 inducida en células de cáncer gástrico.
los niveles de SIRT1 en LV-LV-vector y ATF4 células transfectadas de forma estable SGC7901 se ensayaron mediante qPCR y Western blot. La sobreexpresión de ATF4 se asoció con el aumento de expresión de SIRT1 tanto en la transcripción (Fig. 2A, izquierda) y los niveles de la traducción (Fig. 2B, izquierda). Por el contrario, siRNA desmontables de
ATF4 Hoteles en células SGC7901 /ADR resultó en una reducción significativa de endógena de
SIRT1
expresión (Fig. 2A y 2B, derecha). Estos resultados sugieren que ATF4 hasta regula
SIRT1
expresión en células de cáncer gástrico.
(A) los niveles de ARNm de SIRT1 en líneas celulares transfectadas de forma estable SGC7901 LV-Vector y LV-ATF4 (izquierda) y las células de ADR (derecha) LV-LV-SCR y siATF4 SGC7901 transfectadas establemente /se sometieron a qPCR. GAPDH se usa como control interno. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. lisados (B) celulares a partir de células de la sección A y sus respectivos homólogos no tratados (NC) se transfirieron con los anticuerpos indicados. β-actina se utilizó como control interno.
Para investigar más a fondo los mecanismos moleculares implicados en la MDR-relacionados ATF4 de cáncer gástrico, que también examinó MDR1, MRP, Bcl-2, Bax y los niveles de expresión en las células de cáncer gástrico utilizadas anteriormente. Como se muestra en la Fig. 2B, las células ATF4-competente expresó más MDR1 en comparación con las células de control. Mientras tanto, no hay diferencia evidente en la expresión de MRP se encontró en ninguna de estas líneas celulares. Curiosamente, ambos Bcl-2 y Bax niveles de expresión fueron reguladas en las células ATF4-competente, en comparación con las líneas celulares de control, mientras que la expresión de Bax mostró sólo cambios leves, lo que indica que una sobre regulación de la Bcl-2 y Bax relación podría suprimir la apoptosis inducida por fármacos en células de cáncer gástrico ATF4 sobreexpresan.
Estos resultados indican que ATF4 promueve MDR capacidad de las células de cáncer gástrico a través de múltiples mecanismos.
ATF4 transactivates la actividad del promotor y SIRT1 se une directamente al promotor de SIRT1
para determinar si media la ATF4
SIRT1
la transcripción de genes, células 293T fueron co-transfectadas con los 1,2 kb
SIRT1
plásmido informador promotor y el
ATF4
plásmido de expresión. El ensayo indicador de luciferasa mostró que el
SIRT1
la actividad del promotor fue marcadamente activado por ATF4 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3A).
(A) Las células 293T se cotransfectaron con el 1,2 kb
SIRT1
plásmido informador promotor y el
ATF4
plásmido de expresión. Después de 48 horas, se usó un ensayo indicador de luciferasa para detectar la
SIRT1
actividad promotora. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. (B) una representación esquemática del promotor del gen SIRT1 humano que muestra las posiciones de los cebadores de RT-PCR "para el análisis de chip. (C) chip de ensayo se utilizó para detectar la unión directa de ATF4 a la
SIRT1
promotor. células SGC7901-ATF4 fueron procesados para su chip usando anticuerpo anti-ATF4. A1 representa el sitio de unión distal putativo y A2 representan el sitio de unión proximal putativo. Los promotores cebadores las ADN se utilizaron como control positivo, y los cebadores GAPDH se utilizaron como control negativo.
En un intento de ganar la penetración específica sobre los mecanismos de
SIRT1
inducción, se analizaron las posibles vías de inducción de ATF4. Mediante el análisis de la secuencia flanqueante 5 'de la
SIRT1
gen con softwares de bioinformática (servicio Tfsitescan, TESS, y Genomatix), dos sitios de unión putativos ATF4 fueron identificados dentro de la región -950 a -600 pb de la
SIRT1
promotor (Fig. 3B).
Para determinar si
SIRT1
es un objetivo directo de ATF4, chip con el anticuerpo ATF4 utilizando células SGC7901-ATF4 mostró el enriquecimiento de ambos sitios dentro de la
SIRT1
región promotora de unión, lo que indica que el ARN y el posterior nivel de proteína aumenta de
SIRT1 Hoteles en líneas celulares que expresan ATF4 son probablemente debido a una interacción directa de ATF4 con el
promotor de SIRT1
gen (Fig. 3C).
para investigar el papel de los dos sitios de unión ATF4 en la regulación de la SIRT1 transactivación, se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para mutar estos sitios. ensayo de indicador de luciferasa mostró que, o bien la mutación del sitio de unión 1 o el sitio 2 de unión reduce la actividad del promotor inducida por SIRT1 ATF4. Además, la mutación de ambos sitios de unión abolió la actividad del promotor de SIRT1. Estos resultados sugieren que los sitios de unión tanto ATF4 están involucrados en la transactivación del promotor de SIRT1 (Fig. S1).
En conjunto, estos resultados indican que SIRT1 es una diana transcripcional directa de ATF4.
SIRT1
la inhibición de siRNA revierte parcialmente el fenotipo MDR de células de cáncer gástrico ATF4 sobreexpresan
la identificación de ATF4 mediada por
nivel de expresión de SIRT1
aumentos en células de cáncer gástrico, incitó nos permite analizar el papel de esta vía en la MDR cáncer gástrico. Para hacer frente a esto, se comparó la
in vitro
sensibilidad a los fármacos en ATF4 transfectadas de forma estable en células de cáncer gástrico después de la transfección de
SIRT1
siRNA o revueltos siRNA por la formación de colonias y ensayos de MTT. Desmontables de
SIRT1
por siRNA en células SGC7901-ATF4 llevado a a & gt; 40% de reducción en el número de colonias cuando se utiliza en combinación con CDDP (Fig. 4A, parte superior). Este efecto también se observó en células AGS-ATF4 (Fig. 4A, inferior). Por otra parte, los datos del ensayo de MTT también indicaron que desmontables de
SIRT1
podría volver a sensibilizar a las células SGC7901-ATF4 a las drogas químicas, pero esto no se produjo en las células transfectadas siRNA revueltos (Fig. 4B).
(A) SGC7901-ATF4 y las células AGS-ATF4 fueron transfectadas con siRNA revueltos (SCR) o SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta y dos horas más tarde, las líneas celulares se trataron continuamente con 0 o 0,25 mg /ml de cisplatino para 14 d; medio se cambió cada 3 d. Las células se sembraron por triplicado, y el experimento se repitió tres veces. se muestran pozos representativos. Los gráficos proporcionan la cuantificación promedio como porcentaje de las células no tratadas. Inserción, relativa expresión de la proteína SIRT1 por Western blot. células SGC7901-ATF4 (B) fueron transfectadas con siRNA revueltos (SCR) o SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta y dos horas más tarde, las dos líneas celulares se trataron con las dosis indicadas de diferentes fármacos para adicional 72 h.
in vitro
sensibilidad a los fármacos se ensayó en el ensayo de MTT. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes.
Para determinar si SIRT1 protege las células de la apoptosis inducida por CDDP, células SGC7901-ATF4 transfectadas con
SIRT1
siRNA o revueltos siRNA fueron tratados con CDDP y etiquetado con anexina V y PI. Las células apoptóticas se identificaron mediante marcaje con anexina V. El porcentaje de apoptosis de SIRT1 siRNA transfectadas las células SGC7901-ATF4 fue significativamente mayor que la de las células control (Fig. 5A, 72,8% vs. 25,9%). La aparición de núcleos condensados y fragmentados también se incrementó en las células transfectadas SIRT1 siRNA en comparación con las células de control (Fig. 5B). Además, se observó escisión de procaspasa-3 tan pronto como 12 h después del tratamiento con 10 mg /ml de CDDP en SIRT1 siRNA transfectaron células SGC7901-ATF4, pero no en células siRNA tratados revueltos, incluso después de 24 h de tratamiento CDDP (Fig. 5C ). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de SIRT1 suprime la apoptosis inducida por CDDP.
células SGC7901-ATF4 (A) fueron transfectadas con siRNA revueltos (SCR) o SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta y dos horas más tarde, las células se incubaron durante 36 h adicionales en medio fresco en ausencia o presencia de cisplatino a 5 mg /ml. Después de tratamiento con fármacos, las células se marcaron con anexina V y PI. El patrón de distribución de células vivas y de apoptosis se determinó mediante análisis FACS. células SGC7901-ATF4 (B) se transfectaron por el mismo camino en la sección A y luego tratados con 5 mg /ml de cisplatino durante 36 h. A continuación, se realizó Hoechst 33258 tinción nuclear para detectar células apoptóticas. las células (C) SGC7901-ATF4 fueron transfectadas por el mismo camino en la sección A y se incubaron durante 6-24 h adicional en medio fresco con 10 g /ml de cisplatino. En el momento indicado, se recogieron los extractos de proteínas y se sometieron a análisis de inmunotransferencia para la caspasa-3 (formas no escindidas y escindidas). β-actina se utilizó como control interno. (D) células SGC7901-ATF4 fueron transfectadas por el mismo camino en la sección A. Setenta y dos horas más tarde, los lisados de células se transfirieron con los anticuerpos indicados. β-actina se utilizó como control interno.
Para estudiar el efecto de la baja regulación de SIRT1 de siRNA en las moléculas de MDR asociada, hemos examinado MDR1, MRP, Bcl-2, Bax y los niveles de expresión en las células SGC7901-ATF4 después de la transfección con siRNA SIRT1 o revueltos siRNA. Baja regulación de MDR1 se observó en las células tratadas con siRNA SIRT1 (Fig. 5D) en comparación con las células control. En contraste, no se encontraron diferencia obvia de MRP, Bcl-2, y los niveles de expresión entre las muestras de Bax.
Estas observaciones indican que SIRT1 media el efecto MDR ATF4-inducida en células de cáncer gástrico.
la inhibición de la actividad de SIRT1 re-sensibiliza a las células transfectadas ATF4 a agentes que dañan el ADN
para proporcionar evidencia de que la actividad catalítica SIRT1 también es responsable de las células MDR, SGC7901-ATF4 ATF4 inducida fueron pretratadas con EX-527 , una novela, potente y específico inhibidor de molécula pequeña de SIRT1, y seguido de tratamiento con diferentes fármacos químicos. En primer lugar, se determinó la citotoxicidad basal de EX-527 en el LV-LV-vector y ATF4 células SGC7901 transfectadas de forma estable. El ensayo MTT reveló que EX-527 a concentraciones de hasta 10 mM no inhibió, sino más bien aumenta ligeramente, la viabilidad de las dos líneas celulares (Fig. 6A). A continuación, examinó la SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, Bax y los niveles de expresión después de 24 horas de incubación con o sin las dosis indicadas de EX-527 en las células de cáncer gástrico utilizadas anteriormente. Sólo la expresión de MDR1 se redujeron regulado por EX-527 de una manera dependiente de la concentración (Fig. 6B). Luego preincubaron células SGC7901-ATF4 con vehículo o EX-527 (0,5, 1, 2, 4, y 10 mM) durante 24 h, y luego CDDP- y la muerte celular mediada por 5-FU se controló. Como se muestra en la Fig. 6C, EX-527 mejora significativamente la citotoxicidad de los dos fármacos en una forma dependiente de la dosis. También se determinó el posible efecto sinérgico de EX-527 en diferentes dosis de CDDP- y la inhibición mediada por 5-FU de la proliferación celular en las células SGC7901-ATF4. Como se esperaba, 10 mM EX-527 es suficiente para potenciar la citotoxicidad de ambos fármacos (Fig. 6D).
(A) LV-vector y LV-ATF4 líneas celulares transfectadas de forma estable SGC7901 se incubaron con o sin el dosis indicadas de EX-527. Noventa y seis horas más tarde, las viabilidades de células se determinaron por el ensayo de MTT. (B) transfectadas de manera estable líneas celulares SGC7901 en la sección A se incubaron con o sin EX-527 (1-10 mM) durante 24 h, y los lisados celulares totales se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. β-actina se utilizó como control interno. células (C) SGC7901-ATF4 se preincubaron con las dosis indicadas de EX-527 durante 24 h. Luego, las células SGC7901-vector y SGC7901-ATF4 fueron expuestos a cisplatino (1 mg /ml) o 5-fluorouracilo (1,25 g /ml) para adicional 72 h. viabilidades de células se determinó mediante el ensayo de MTT. (D) células SGC7901-ATF4 se preincubaron con o sin EX-527 (10 M) durante 24 h. A continuación, las células se expusieron a las dosis indicadas de cisplatino o 5-fluorouracilo para adicionales 72 h. viabilidades de células se determinó mediante el ensayo de MTT. Todos los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. Los gráficos proporcionan la cuantificación promedio como porcentaje de las células no tratadas.
Estos resultados sugieren que la actividad de SIRT1 también juega un papel crítico en la MDR cáncer gástrico inducida por ATF4 y este papel podría ser mediada en parte a través de la expresión de MDR1 .
Discusión
MDR plantea desafíos clínicos significativos a la quimioterapia eficaz de muchos tumores malignos humanos. Los mecanismos por los que las células adquieren resistencia son múltiples y complejas, de modo más amplio conocimiento de ellos, así como la identificación de nuevos mecanismos para la quimio-resistencia, serán particularmente útiles para proporcionar mejores opciones terapéuticas. Este estudio es el primer informe de que los altos niveles de ATF4, comúnmente observada en las células tumorales en circunstancias de estrés, confiere células de cáncer gástrico con un fenotipo MDR, y se identifica que este efecto es mediado en parte por la transactivación de la expresión de SIRT1.
ATF4
y
SIRT1 ¿Cuáles son evolutivamente conservados genes de la respuesta de estrés que participan en un amplio espectro de procesos biológicos, muchos de los cuales son saludables para la homeostasis y la protección celular [22], [23], [ ,,,0],24]. Ambos genes son inducidos en respuesta a una variedad de tensiones, incluyendo la falta de oxígeno (hipoxia /anoxia), el estrés oxidativo, el daño del ADN, la privación nutricional, y el estrés quimiotóxico. Levenson VV
et al.
Informó por primera vez que los cambios en la expresión de ATF4 podrían desempeñar un papel en la resistencia pleiotrópica a diferentes clases de ADN de metas de drogas [16]. En los últimos años, se habían encontrado varios estudios que ATF4 estuvo involucrado directa o indirectamente en el desarrollo de resistencia a los medicamentos a través de la autofagia, el sistema dependiente de glutatión redox, y daños de reparación del ADN [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Aquí mostramos que la capacidad de protección de ATF4 de hecho interviene en un fenotipo MDR en líneas celulares de cáncer gástrico ATF4 sobreexpresa en respuesta a la quimioterapia. Nuestros resultados muestran claramente que la sobreexpresión de ATF4 en células de cáncer gástrico se asoció con más resistencia, mientras que desmontables de ATF4 inducida re-sensibilización. Estos datos sugieren que ATF4 es probablemente un importante mediador aguas abajo de la resistencia causada por múltiples mecanismos y por lo tanto es una diana terapéutica valiosa. Sin embargo, como uno de los mediadores de la transcripción más importantes de la ISR que activa una variedad de genes diana que promueven la restauración de la homeostasis, ATF4 puede también mediar resistencia por otros mecanismos. En nuestro estudio, la SIRT1 se encontró que era hasta reguladas en las células que sobreexpresan ATF4 comparación con las células transfectadas con vector. Por el contrario, desmontables de
ATF4
con ATF4 siRNA llevó a una baja regulación de SIRT1 en células de cáncer gástrico MDR. Nuestros resultados sugieren que la SIRT1 podría ser un mediador aguas abajo del cáncer gástrico inducida por ATF4 MDR.
Como miembro de la subfamilia de ATF de la cremallera de leucina-región básica (bzip) factores de transcripción [22], tiene el ATF4 potencial para actuar ya sea como un activador de la transcripción o un represor transcripcional a través de ATF o elemento de respuesta cAMP (CRE) sitios de unión [22]. El sitio de unión consenso para ATF se definió como TGACGT (C /A) (G /A) [27], que es una secuencia idéntica al elemento CRE consenso (TGACGTCA) [28]. Además, el motivo de núcleo altamente conservada - ACGT - en la mayoría de CREs [29] se puede unir a diferentes factores bZIP, dependiendo de las bases flanqueantes del motivo central [22], [30], [31]. En nuestro estudio se encontraron dos sitios de unión putativos ATF-CRE en los 1,2 kb
SIRT1
región promotora, y ATF4 activadas directamente
SIRT1
la transcripción mediante la unión de ambos elementos de unión. Sin embargo, como los dos sitios de unión desempeñan sus funciones en circunstancias detalladas de estrés sigue siendo desconocido y requiere más investigación.
Mamíferos
SIRT1
es el más cercano homólogo de la levadura
Sir2 y
el miembro de la familia más ampliamente estudiado SIRT. Está muy implicado en la regulación de procesos celulares que determinan la longevidad, incluyendo anti-apoptosis, la protección neuronal, y la senescencia celular o envejecimiento [32]. Recientemente, un número creciente de estudios han implicado una mayor expresión de SIRT1 con la resistencia a la quimioterapia y la radiación [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36] ionizante. Por ejemplo, la sobreexpresión de SIRT1 se ha encontrado en neuroblastoma resistente a los medicamentos, osteosarcoma, mamaria, ovario, próstata, colon, y líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con sus contrapartes sensibles a fármacos. Todos estos efectos resistentes a los fármacos de SIRT1 podría ser debido a su efecto anti-apoptótica [37], [38] y el silenciamiento de genes supresores de tumores [39]. Finalmente, podríamos predecir que, si SIRT1 está implicado en la MDR ATF4 inducida, la inhibición de SIRT1 debe afectar a la sensibilidad de las células ATF4 sobreexpresan en respuesta a la quimioterapia. Como era de esperar, tanto siRNA y la inhibición farmacológica de SIRT1 podría volver a sensibilizar a las células que sobreexpresan ATF4 a las drogas químicas. Además, nuestro estudio indica que la SIRT1 protege las células de la muerte parte a través de un efecto anti-apoptótica.
Se ha informado de que MDR1 fue hasta reguladas en las células con una mayor expresión de SIRT1 [18], [36]. En este estudio, también hemos demostrado que MDR1 está regulado en las células ATF4 sobreexpresan y desmontables de SIRT1 con SIRT1 siRNA o inhibir su actividad con la EX-527 podría conducir a la baja regulación de MDR1, lo cual es consistente con un medicamento -resistant papel de SIRT1. Sin embargo, la relación /Bax Bcl-2, que fue hasta reguladas en las células ATF4 sobreexpresan, era SIRT1-independiente, lo que sugiere que los mecanismos de SIRT1 independiente también juegan un papel en la MDR ATF4 inducida en células de cáncer gástrico.
En resumen, hemos demostrado que ATF4 confiere un fenotipo MDR en las células de cáncer gástrico, y este efecto es mediado en parte por la transactivación de SIRT1 sobreexpresión. Por otra parte, ATF4 es un blanco válido en tumores gástricos resistentes a los fármacos, y el desarrollo de inhibidores eficaces de ATF4 debe ser tomado en consideración en el futuro. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el papel de ATF4 en el control de la expresión de SIRT1 y en sus características de tensión-resistencia en la tumorigénesis y la quimioterapia. Esto es especialmente importante para la consideración clínica, como ATF4 puede ser hasta reguladas por la privación de oxígeno, el estrés oxidativo, la privación nutricional y casi todos los factores estresantes adversos en un microambiente del tumor, lo que podría ser secuestrada por las células cancerosas para evadir inhibición de la proliferación y la muerte celular en respuesta a la quimioterapia. Por lo tanto, las intervenciones predicados sobre la interrupción de la expresión ATF4 inducida por el estrés en las células cancerosas pueden ser eficaces para eludir o revertir la resistencia a los medicamentos en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Para los métodos detallados, consulte el texto S1 .
cultivo de células y reactivos
las líneas celulares de adenocarcinoma gástrico humano SGC7901 (obtenido de la Academia Militar de Ciencias Médicas, Beijing, china) y la MDR variantes, SGC7901 /ADR y SGC7901 /VCR (establecidas y mantenidas en nuestro laboratorio), y AGS (obtenidos del banco de células de la Academia de Ciencias de china, Shanghai, china) se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) y penicilina /estreptomicina. Las células 293T (también obtenidos a partir del banco de células de la Academia China de Ciencias) se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%. Para mantener el fenotipo MDR, adriamicina (con una concentración final de 0,5 mg /ml) y vincristina (con una concentración final de 1 mg /ml) se añadieron al medio de cultivo para SGC7901 /ADR y las células SGC7901 /VCR, respectivamente. EX-527 (Sigma) se disolvió en DMSO a las concentraciones indicadas. Adriamicina (ADR), vincristina (VCR), cisplatino (CDDP), y 5-fluorouracilo (5-FU) se disolvieron en solución salina normal a las concentraciones indicadas.
transfección de células y de células estables líneas
El humano
ATF4
plásmido de expresión (pCMV5-ATF4) fue proporcionado amablemente por el profesor Amy S. Lee [25]. Lentiviral vector de codificación siRNA específico a
ATF4
y siRNA de control fueron generados con el uso de PLKO.1-TRC (Addgene) y fueron designados como LV-siATF4 y control LV-SCR, respectivamente. ATF4 gen humano que codifica vector lentiviral se construyeron en FUW-teto (Addgene), designado como LV-ATF4. El vector vacío se utilizó como control negativo, designado como LV-Vector.