Extracto
Antecedentes
análisis mutacional Oncogénicos predictivo proporciona orientación para la terapéutica como la lucha contra -EGFR anticuerpos, pero es posible sólo para un subconjunto de cáncer colorrectal (CCR).
Método
un perfil molecular completa de 120 pacientes con CRC, incluyendo 116 primaria, 15 metástasis hepáticas, y 1 muestras de tejido de siembra peritoneal se realizó para identificar la relación entre v-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rata homólogo de oncogén viral (
KRAS)
tumores WT y mutante CRC y los resultados clínicos. Esto incluye la determinación de los patrones de activación de la proteína de receptor epidérmico humano 1 (HER1), HER2, HER3, c-MET, factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF1R), phosphatidylinositide 3-quinasa (PI3K), Src homología 2 dominio que contiene ( SHC), proteína quinasa B (AKT), y la señal extracelular regulada quinasa (ERK) quinasas utilizando la enzima de colaboración mejorada multiplexado inmunoensayo reactiva (CEER).
resultados
KRAS
WT y mutantes CRCs no fueron diferentes con respecto a la expresión de las diversas moléculas de señalización. Mal pronóstico en términos de recaída temprana (& lt; 2 años) y más corto de supervivencia libre de enfermedad (DFS) se correlacionó con una mayor activación de PI3K señalización en relación con la vía de señalización HER-quinasa, pero no con el
KRAS
estado mutacional .
KRAS WT
CRC fueron identificados como una población mixta pronóstico en función de su nivel de señalización de PI3K.
KRAS WT
CRC con /relación de alto índice de HER1 c-MET demostraron una mejor DFS después de la cirugía. c-MET y IGF1R actividades relativas a la actividad del eje HER fueron considerablemente más altos en los primeros CRC recaída, lo que sugiere un papel para estos receptores tirosina quinasas alternativos (RTK) en la conducción de señalización PI3K alta.
Conclusiones
los datos presentados subclasifican CRCs sobre la base de sus vías de señalización activadas e identificar el papel de c-MET y la señalización de PI3K IGF1R impulsada en CRC, que es superior a KRAS pruebas mutacionales solo. Los resultados de este estudio pueden ser utilizados para identificar los CRC agresivos, explicar el fracaso de la terapéutica actualmente aprobados en subconjuntos específicos de CRC, y, lo más importante, generar hipótesis para las estrategias terapéuticas de la ruta guiada que pueden ser probados clínicamente.
Visto : Lee J, Jain A, Kim P, Lee T, Kuller A, Princen F, et al. (2014) Activado CMET y IGF1R-Driven PI3K señalización predice la baja supervivencia en el cáncer colorrectal independientes de KRAS mutacional de estado. PLoS ONE 9 (8): e103551. doi: 10.1371 /journal.pone.0103551
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 25 de abril, 2014; Aceptado: 30 de junio de 2014; Publicado: 4 Agosto 2014
Copyright: © 2014 Lee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por Samsung Instituto de Investigación Biomédica de subvención#SS1-B3-011-1. Esta investigación fue suppoorted por una subvención de la tecnología de amplificador de Corea Salud I +; D Proyecto a través del Instituto Coreano de Desarrollo de la Industria de la Salud (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea. (Número de concesión: HI13C1951). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Mientras AJ, PK, TL, FP y SS se emplean por Prometheus Laboratories, esta no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
los anticuerpos monoclonales, como cetuximab y panitumumab que se dirigen al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un miembro de la familia del receptor epidérmico humano (HER), han demostrado ser eficaces en términos de tasa de respuesta y la supervivencia libre de progresión en combinación con quimioterapia citotóxica estándar en cáncer colorrectal metastásico (CRC) [1] - [4]. El EGFR orientación anticuerpos se unen a el dominio extracelular de EGFR, lo que lleva a la inhibición de sus vías de señalización aguas abajo, incluyendo el 1 (MAPK1) eje RAS-RAF-activada por mitógenos proteína quinasa que participa principalmente en la proliferación celular y el v- akt timoma murino oncogén viral homólogo 1 (AKT1) vía, la cual se centra principalmente en la supervivencia celular y la invasión tumoral [5]. AKT1 está regulada por la fosfatidilinositol 3-quinasa aguas arriba (PI3K) vía de señalización
.
Las mutaciones en el v-Ki-ras2 Kirsten sarcoma de rata homólogo de oncogén viral (
KRAS
), detectaron con más frecuencia en los codones 12, 13 y 61, se presentan en aproximadamente el 40% de los pacientes con CCR [6], [7].
KRAS
mutaciones se han convertido en el factor predictivo negativo clave para la respuesta al tratamiento en pacientes que reciben cetuximab [8], [9]. Estos estudios han sugerido que
KRAS de tipo salvaje
tumores (WT) CRC serían sensibles a cetuximab; sin embargo, hasta un 65% de los pacientes con tumores
KRAS
WT son todavía resistente a los anticuerpos monoclonales anti-EGFR [10]. La resistencia a los anticuerpos anti-EGFR en un subconjunto de
KRAS WT
CRC se puede explicar por la presencia de una mutación en el
BRAF oncogén
[8], que está aguas abajo de
KRAS
. La razón de la falta de respuesta cetuximab en el restante
KRAS WT
CRC sigue siendo poco clara. Por otra parte, aunque
KRAS
mutaciones son típicamente asociados con la falta de respuesta a los anticuerpos anti-EGFR, datos recientes indican que
KRAS mutaciones
G13D puede ser un predictor de la respuesta positiva cetuximab [8]. Las mutaciones dentro de la
PIK3CA
de genes [10], que es un importante regulador de la señalización de PI3K, también están presentes en algunos CRC tumores que pueden co-ocurrir con
KRAS
o
BRAF
mutaciones [8], [11], lo que sugiere su posible influencia en la capacidad de respuesta a terapias dirigidas, tales como anticuerpos anti-EGFR, pero una clara demostración de dicha correlación es deficiente [12], [13].
a partir de los estudios descritos anteriormente y dado que una gran proporción de pacientes con CRC tumores
KRAS
WT no responden al cetuximab o panitumumab, está claro que un simple análisis mutacional es insuficiente para predecir la respuesta a este tipo de terapias. Además, ya que los estudios recientes sugieren que las respuestas terapéuticas a inhibidores de PI3K se no se limitan a líneas de células colorrectales con la activación de mutaciones o en pacientes con mutaciones [14] - [16], es imperativo al perfil tumores para su predominante, así como potencial los conductores de la vía de señalización alternativos en Además del análisis mutacional oncogénico. Por lo tanto, nos propusimos al perfil tejidos CRC para investigar la correlación entre el estado mutacional y expresiones de proteínas diferentes tirosina quinasa del receptor (RTK), tales como HER1, HER2, HER3, c-MET, y el factor de crecimiento insulínico tipo 1 del receptor (IGF1R). Además, las quinasas corriente abajo PI3K, Src homología 2 dominio que contiene (Shc), proteína quinasa B (AKT), y regulada por señal extracelular quinasa (ERK) se determinaron utilizando el immunomicroarray multiplexada basa Collaborative Enzyme Enhanced reactiva (CEER) inmunoensayo [17] - [19] en 120 pacientes con CCR de fase I a IV, que incluyó 116 primaria, 15 metástasis hepáticas y peritoneales 1 muestras de tejido de la siembra. En paralelo, el análisis mutacional somática anotó por mutaciones en el
KRAS Opiniones y
BRAF
oncogenes. CRC tumores con mutaciones oncogénicas similares demostraron heterogeneidad en sus perfiles vía de señalización.
Pacientes y métodos
cohorte de pacientes y la muestra de tejido de adquisiciones
El estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional (IRB) de Samsung Medical Center. Toda la investigación clínica se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El consentimiento informado escrito fue cortado por la IRB debido a un análisis retrospectivo y los datos anónimos. tejidos congelados frescos (n = 120) recogidos de tumores resecados quirúrgicamente (73 de colon, el recto 47), 15 de los tumores metastásicos del hígado y uno de los nódulos siembra peritoneal, estaban disponibles para el análisis final. Todos los tejidos congelados frescos se recogieron dentro de 30 min en el campo quirúrgico por un cirujano, fueron inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. las muestras de tumor se confirmó la presencia de un tumor & gt; 70% área por un patólogo. Para el análisis, pequeños trozos de tejidos congelados (10 micras secciones × 3) se prepararon usando hojas de afeitar previamente enfriado y luego se lisaron en 100 l de tampón de lisis. Los lisados resultantes fueron almacenadas a -80 ° C hasta su posterior análisis.
Colaboración mejorada de la enzima reactiva-inmunoensayo (CEER)
CEER utiliza una plataforma basada en microarrays de anticuerpos que puede medir la expresión y activación los niveles de proteínas de transducción de señales en los tejidos tumorales y tejidos sustituto. El objetivo seleccionada se captura primero por un anticuerpo de captura específico de diana, seguido de co-localización de dos anticuerpos detectores adicionales contra el mismo objetivo, resultando eventualmente en la detección de diana específica y cuantificación. Métodos detallados de esta tecnología se han descrito anteriormente [17] - [19] y se puede encontrar en la S2 de archivos. experimentos representativos se muestran en la Fig.S1 en S1 Archivo.
análisis de la mutación
ADN genómico fue extraído a partir de tejidos de CRC utilizando el Tissue Kit de Qiagen. Las muestras fueron seleccionadas para las mutaciones en
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
genes: G12A /C /D /S /V, G13C /D, y en Q61H
KRAS Opiniones y V600E en
BRAF
. El ensayo de mutación se basa en la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real TaqMan (PCR) en combinación con cebadores específicos de alelo (ASP), bloqueador, y la sonda utilizando una modificación del tiempo real Alelo método de detección de PCR específica [20]. Brevemente, ASP se utiliza para detectar específicamente el alelo mutante. Un oligonucleótido de bloqueo (bloqueador) complementaria a la secuencia de tipo salvaje se utilizó para suprimir cualquier amplificación no específica del alelo de tipo salvaje. La mezcla de PCR utilizado para todos los ensayos fue GTXpress Master Mix de Life Technologies. Todos los ensayos se realizaron en placas de 384 pocillos ABI 7900HT en tiempo real del instrumento PCR (Life Technologies).
El porcentaje de la variante alélica presente en muestras desconocidas se calculó utilizando una curva estándar. La curva estándar se genera para cada mutación del ADN extraído de una línea celular positiva para que la mutación usando una serie de diluciones de ADN (100, 10, 1, 0,1, y 0,01 ng). Una lista de las líneas de células positivas utilizadas para la generación de las curvas de calibración se muestra en la siguiente tabla. El ADN de las líneas celulares respectivas se extrajo usando el Qiagen DNeasy Blood & amp; Kit de tejidos.
Uso de la curva estándar, la cantidad de la mutación correspondiente en la muestra de ADN desconocido se calculó a partir del valor Ct que podría ser utilizado para el cálculo de la variante alélica por ciento basado en el supuesto de que la célula estándar la línea es 100% positivo para que la mutación específica. La varianza alélica de las líneas celulares se determinó usando cebadores específicos para el alelo de tipo salvaje. A continuación se presentan las líneas celulares utilizadas para las mutaciones de genes: SW1116 (KRASG12A), NCI-H23 (KRASG12C), LS174T (KRASG12D), PSN1 (KRASG12R), A549 (KRASG12S), SW403 (G12V), H1734 (KRASG13C), T84 (KRASG13D ), H460 (KRASQ61H), y HT29 (BRAFV600E).
El análisis estadístico
Mann-Whitney
t
-pruebas, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, y el análisis de correlación de Pearson se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5 para Mac OS X (GraphPad Software, La Jolla, California EE.UU., www.graphpad.com). DFS se determinó utilizando el método de Kaplan-Meier y las curvas de supervivencia se compararon mediante el método del índice de registro. La supervivencia se midió a partir de la fecha de la cirugía. Todas las pruebas fueron de dos caras, y valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 20 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
Características de los pacientes
se proporcionan las características de los 120 pacientes con CRC en la Tabla 1. el setenta y tres pacientes presentaron una primaria de colon, mientras que 47 pacientes tenían primaria recto. Aproximadamente el 70% de los pacientes fueron sometidos a quimioterapia adyuvante o radioterapia, dependiendo de la localización del tumor primario. Diez pares de metástasis de colon de hígado y un par de siembra de colon-peritoneal se incluyeron en el análisis. Todos los tejidos, incluyendo muestras pareadas, se adquirieron en el momento de la cirugía e inmediatamente se congelaron en el campo quirúrgico para el análisis molecular futuro.
diferenciales activaciones vía de señalización predichos escasa supervivencia mejor que las mutaciones KRAS
KRAS mutaciones
, con
KRAS mutaciones
G12D G13D y siendo el más frecuente, se observaron en el 39% (45/115) de las muestras en nuestra cohorte de pacientes de CRC. En particular, 28/115 pacientes llevaron a los
KRAS mutaciones
G12 y 17/115 pacientes llevaron a los
KRAS mutaciones
G13D. Las mutaciones en
BRAF
, que está aguas abajo de
KRAS
, se encontraron en el 4% (5/115) de los pacientes. Aunque
KRAS mutado
CRC-G12 están generalmente asociados con un mal pronóstico, un porcentaje considerable de
KRAS WT
CRC mostró baja DFS y algunos
KRAS mutado
G12 CRC mostró alta DFS independientemente de su etapa de tumor (Fig. 1A). Los tumores en cada
KRAS
subtipo mutacional demostró una mediana de expresión similar de ERK fosforilado (pERK), que está aguas abajo de
KRAS
(Fig. S1). Un porcentaje equivalente de los tumores CRC expresado Perk por encima de la media (51,8% en
KRAS
WT, 48,5% en G12 mutado, y el 44,4% en los tumores mutados G13D).
(A) Parcela de supervivencia libre de enfermedad (DFS) frente al estadio del tumor en
KRAS
WT y G12mut CRC primarias. Cada punto representa un paciente individual y los puntos marrones y azules indican los pacientes que recibieron o no recibieron quimioterapia adyuvante, respectivamente. (B) Curvas comparativo DFS de muestras CRC segregadas por sus tiempos de recurrencia después de la cirugía. DFS para los pacientes recaída temprana (recurrencia ≤ 2 años) se muestra en rojo y DFS para los pacientes de recaídas tardías (recurrencia & gt; 2 años) se muestra en azul. P-valores se indican. La tabla debajo del gráfico muestra el porcentaje de pacientes con una determinada
KRAS
genotipo en cada grupo. análisis de correlación (C) de los primeros Pearson vs. CRCs recidiva tardía a la expresión de pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, y pPI3K /pHER3 en toda la cohorte CRC. correlaciones significativas están resaltados en amarillo. La trama en el cuadro muestra la diferencia en las proporciones pPI3K /pHER3 en recaída temprana frente a los CRC de recaídas tardías.
Como era de esperar, las curvas de supervivencia para las dos cohortes fueron significativamente diferentes (Fig. 1B) , con los respectivos tiempos de supervivencia media de 19,8 meses para la recaída temprana (2 años a partir de la cirugía) e indefinido de recidiva tardía (razón de riesgo = 117,5). Como se muestra en la Fig. 1C, una mayor expresión de PI3K activada correlacionado con recaída temprana y, específicamente, el aumento de la expresión de las relaciones /PHER pPI3K se asoció significativamente con una recaída temprana. PI3K es un importante efector de señalización corriente abajo de los ejes de HER-quinasa con sitios de unión directa sobre HER3. Se determinó el valor de corte para la relación de pPIK3 /HER3 como se muestra en Fig.S2 en S1 Archivo. Además, la expresión pPI3K /pHER3 fue significativamente mayor en tumores que recayeron CRC dentro de los 2 años (Fig. 1C). Por lo tanto, se observó la señalización de PI3K mejorado en los CRC con una SSE más cortos o peor pronóstico.
señalización de PI3K alta está asociada con la recurrencia precoz en el CCR
Para obtener una mayor comprensión de la alta versus baja pPI3K señalización cohortes CRC, nos centramos en los CRC sub-cohortes segregadas por la relación pPI3K /pHER3 (Fig. 2A). Características de los pacientes en la alta versus baja de señalización cohortes CRC pPI3K estaban bien equilibrados en términos de su estadio tumoral, los tratamientos de quimioterapia, y el estado mutacional de los oncogenes
KRAS
y
BRAF gratis (Fig. 2B ). DFS de
KRAS WT
CRC con mayor expresión pPI3K /pHER3 fue significativamente peor que la de
KRAS WT
CRC con una menor expresión pPI3K /pHER3 (figura 2C.); Sin embargo,
KRAS
tumores G12mut demostraron pobres DFS independientemente de su nivel de expresión pPI3K. Curiosamente, las comparaciones DFS de
KRAS
WT, G13Dmut, y G12mut CRC dentro del grupo pPI3K baja mostraron diferencias considerables, con
KRAS
WT y
KRAS
tumores G13D tener una mejor la supervivencia de la
tumores KRAS
G12mut (Fig. 2D). A pesar de las grandes diferencias en la supervivencia observada en los grupos de alto y bajo pPI3K /pHER3 en función de su
KRAS
WT o G12 mutados genotipo, los dos grupos fueron muy similares en términos de sus diferencias de expresión de los marcadores relevantes. En otras palabras, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, y pPI3K /pHER3 se expresaron a niveles considerablemente más altos en el grupo alto pPI3K /pHER3 tanto en
KRAS
WT y G12 mutados CRC (Fig. S1 S3 en Archivo ). Tenga en cuenta que la expresión pPI3K no era considerablemente más alto, pero era la expresión pPI3K relativa a la activó su eje que fue mayor en los grupos que muestran una baja supervivencia
.
Los valores p respectivos se indican. (A) Los diagramas de caja de la U de Mann-Whitney
t-test
que muestra la diferencia en la expresión de pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, y pPI3K /pHER3 entre el grupo alto pPI3K /pHER3 y baja pPI3K /grupos pHER3. Los valores p respectivos se indican. (B) La tabla lista las características de los CRC primarias de alta PI3K (alta pPI3K /pHER3) versus baja PI3K (bajo pPI3K /pHER3) cohortes de señalización. Las características incluyen segregaciones basados en la etapa del tumor, estado del tratamiento de quimioterapia, y el estado mutacional de
KRAS
y
BRAF
. En total, 67/115 muestras se incluyen en la cohorte de alta PI3K y 48/115 muestras se incluyeron en la cohorte de baja PI3K. Los números indican el porcentaje de muestras dentro de cada cohorte en base a cada indicó característica. (C) DFS de acuerdo a las relaciones de pPI3K /pHER3 en
KRAS
WT y
KRAS
G12mut CRC. (D) las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de alta PI3K (pPI3K /pHER3) y las cohortes de baja PI3K que comparan la DFS de
KRAS
WT, G13Dmut, y las muestras G12mut. (E) de alta PI3K (alta pPI3K /pHER3) y baja PI3K (bajo pPI3K /pHER3) grupos en muestras de CRC primarios y metastásicos pareadas.
Estos datos proporcionaron evidencia de que una señalización de alta pPI3K, que pueden posiblemente ser impulsado por señales ascendentes distintos de o además de la HER eje, está asociada con CRC agresivos con recurrencia temprana. Además, estos datos demuestran claramente la heterogeneidad dentro de la población
KRAS
WT basado en el nivel de expresión pPI3K en estos tumores. Por otro lado,
KRAS mutado
G12-CRC que suelen demostrarse por la mala supervivencia, independientemente del nivel de la señalización pPI3K.
CRC agresivos PI3K impulsada, incluyendo CCR metastásico, muestran mayor c-MET y la señalización de IGF1R que el eje HER señalización
Desde proporciones más altas /PHER pPI3K correlacionados con los primeros CRC de recaída, la hipótesis de que también debería haber una diferencia significativa en PHER /pMET y relaciones PHER /pIGF1R si pMET y pIGF1R son responsables para la señalización de alta pPI3K. A continuación, examinó estas redes de señalización en 10 pares de muestras primarias sincrónicas-metastásico coincidentes disponibles en nuestra cohorte de estudio. Los pares primarios CRC metastásico fueron separados en dos grupos en función de la relación de la expresión pPI3K /pHER3 de la muestra CRC primaria en cada par. Hubo un aumento significativo en la proporción pPI3K /pHER3 para las muestras metastásicas emparejados en el grupo de baja relación pPI3K /pHER3 (Fig. 2E), mientras que se mantuvo sin cambios entre muestras primarios y metastásicos en el grupo de alta relación de pPI3K /pHER3.
la agresividad de KRAS G12mut CRC se correlaciona con la alta c-MET expresión en relación con los miembros de su eje
a continuación, intentó identificar marcadores que pueden ser expresados diferencialmente entre los
KRAS
WT y G12mut CRC en el grupo pPI3K baja. Sobre la base de nuestra observación preliminar de alta expresión de c-MET totales y IGF1R en
KRAS
tumores G12mut en comparación con el
tumores KRAS
WT (Fig. 3A, Fig. S4 en Archivo S1), examinamos si un diferencial de c-MET o expresión de IGF1R dependientes pueden segregar a los subgrupos
KRAS
WT y G12mut dentro del grupo de baja relación pPI3K /pHER3. ratios relativos HER1 /c-MET y HER3 /c-MET fueron considerablemente más altos en el
KRAS WT
CRC que en
KRAS
tumores G12mut (Fig. 3B) en el grupo pPI3K /pHER3 baja , pero no en el grupo de alto pPI3K /pHER3, que era consistente con las diferencias DFS (Fig. 3A). Hemos investigado si las proporciones adecuadas de HER1 /c-MET (Fig. S1 S5 en Archivo) o HER3 /c-MET también puede segregar las diferencias observadas entre la DFS
KRAS
WT y G12mut CRC dentro de la baja pPI3K /grupo relación pHER3. El análisis de la
KRAS
genotipos de las muestras en los dos sub-cohortes reveló que la mayoría de las muestras
KRAS
WT y G13D estaban presentes en el alto HER1 /c-MET sub-cohorte (es decir, HER1 & gt; c-MET), mientras que la mayoría de la
KRAS
muestras G12mut estaban presentes en el bajo HER1 /c-MET sub-cohorte; la figura (es decir, HER1 & lt c-MET) ( . 3C). Una relación de corte de HER1 /c-MET similares no segregar el grupo de alto pPI3K /pHER3 basado en el
KRAS
genotipos (Fig. 3D). Cálculo en paralelo con un índice de HER3 /c-MET resultó en datos similares pero menos robusto que no segregar el KRAS WT y G12mut CRC tan claramente como el índice de HER1 /c-MET (
los datos no presentados
). Estos datos indicaron que la agresiva
KRAS
tumores G12mut son molecularmente distinta, ya que son en su mayoría marcadas por una alta expresión de c-MET, que es equivalente o superior a la expresión de HER1 y HER3.
( A) relación /Tc-MET pMET se comparó entre PI3K alta (alta pPI3K /pHER3) y baja PI3K (grupos de alto pPI3K /pHER3) utilizando el Mann-Whitney
t-test
. La comparación se muestra en todos los CRC,
KRAS
WT, G13D mutado y G12 mutado CRC. diferencias significativas con los valores de p se indican en azul. (B) Expresión comparativa entre los grupos de alto y bajo de PI3K para los siguientes marcadores: pHER1 /pMET, pHER2 /pMET, pHER3 /pMET, pHER1 /pIGF1R, pHER2 /pIGF1R, y pHER3 /pIGF1R. diferencias significativas con los valores de p se indican en azul.
Discusión
Este estudio se basa en la hipótesis de que el estado de las vías de señalización activadas en
KRAS WT
y CRC mutantes pueden proporcionar información adicional que pueda ser útil para la comprensión de los resultados terapéuticos en estos tumores [17] - [19]. El análisis presentado en este estudio proporciona evidencia de que el CRC puede ser sub-clasificarse en función de sus perfiles moleculares vía de señalización independientemente de los
KRAS
estado mutacional, tal como se resume en la figura. 4. Además de proporcionar conocimientos moleculares en CRC pronóstico, un perfilado tales basada en las vías puede tener importantes implicaciones en la estratificación de la población de pacientes de CRC para las estrategias terapéuticas adecuadas.
Esquema que resume la sub-clasificación de los CCR en función de su vía de señalización perfiles y
KRAS
estado mutacional. Las posibles opciones terapéuticas para cada subclase en base a sus perfiles de la vía se indican.
El pronóstico de los tumores primarios CRC después de la cirugía se ha correlacionado con su
KRAS
estado mutacional [21 ]. A pesar de esta tendencia general también se observó en nuestra cohorte muestra de CRC, con tumores
KRAS WT
que demuestran una mejor DFS después de la cirugía que los
KRAS
tumores mutantes G12, no fue significativo debido a la heterogeneidad en las vías de señalización dentro de cada
KRAS
subtipo mutacional, especialmente en la etapa II y III tumores CRC independientemente de si o no los pacientes recibieron quimioterapia. Esto sugiere que
KRAS
mutaciones confieren sólo una parte de la ventaja necesaria para la supervivencia de las células tumorales con las señales de supervivencia adicionales presumiblemente derivada de múltiples vías de señalización. CRC con alta actividad PI3K recaída dentro de los 2 años, independientemente de su
KRAS
estado mutacional y tenía mal pronóstico. Incluso
KRAS WT
CRC con la señalización de PI3K alta eran tan agresivo como el
KRAS
G12mut CRC con indistinguibles DFS después de la cirugía. Por el contrario,
KRAS WT
CRC con baja actividad de señalización de PI3K demostraron un mejor pronóstico y podrían ser separados de la agresiva
KRAS
G12mut CRC con una relación de corte índice de HER1 /c-MET apropiada , porque c-MET niveles de expresión fueron mayores en
KRAS
G12mut CRC. En nuestra cohorte de estudio, éstos
KRAS WT
CRC constituidos ~44% del total
KRAS
población WT y revelan la heterogeneidad. La heterogeneidad en las poblaciones
KRAS WT
CRC se ha notado previamente en otros numerosos estudios, porque no todos los
KRAS WT
CRC son sensibles a los anticuerpos anti-EGFR. Una posible razón se ha descrito como la presencia de
BRAF
mutaciones. El número de
BRAF
muestras -mutated en nuestra cohorte era demasiado pequeño para extraer conclusiones razonables; Sin embargo, 3/5 de
BRAF
CRC -mutated en presencia de WT
KRAS
han demostrado una alta señalización PI3K. Nuestro estudio proporciona un posible mecanismo para la heterogeneidad en
KRAS WT
CRC y se especula que el 44% de la
KRAS WT
CRC con una baja de señalización PI3K y la expresión de alto HER1 puede ser los que responden a la lucha contra terapias -HER tales como anticuerpos anti-EGFR. Aproximadamente el 47% de las muestras de CRC con
KRAS mutaciones
G13D fueron recientemente sugiere tener características de resultados basados en terapias distintas [8] y fueron rastreados con nuestro
muestras KRAS WT
en términos de tener baja la señalización de PI3K y una alta expresión de HER1. La relevancia de la señalización de PI3K y los inhibidores de PI3K /mTOR se ha sugerido anteriormente en
KRAS
mutante [22] y
BRAF
mutante [23] CRC. Los resultados de nuestro estudio son consistentes con estos informes y ampliar aún más la importancia de la PI3K en los CRC, independientemente de su estado mutacional.
Las actividades relativamente altos de c-MET y IGF1R en comparación con los miembros de su actividad quinasa en agresiva CRC sugirieron que estas RTK alternativas pueden ser los impulsores de la señalización de PI3K alta.
KRAS mutado
CRC-G12 se anotaron para expresar los niveles del receptor c-MET más altos que los miembros de su que se correlacionaron con su mal pronóstico. evidencia más convincente en apoyo de la actividad de PI3K IGF1R impulsada en CRCs agresivos c-MET y vino de los pares de muestras primarias metastásico, en el que estos marcadores mostraron un claro aumento de la contraparte metastásico cuando se compara con la muestra primaria emparejado, aunque el estado mutacional del par se mantuvo sin cambios. Es importante señalar que las diferencias de expresión de los marcadores individuales no presentaron diferencias significativas, pero fue la expresión relativa de PHER señalización de pMET y pIGF1R que reveló patrones considerablemente diferenciales entre los CRC que eran más agresivo y recidivante anterior frente a los que se asociaron con mejor pronóstico. Actualmente, no hay opciones tangibles para identificar CRC agresivos y definir opciones terapéuticas para su tratamiento. pruebas de mutaciones son la única estrategia disponible, que no identifica a la agresiva
KRAS WT
CRC. Nuestro estudio proporciona evidencia para los perfiles de la vía de señalización activadas que son superiores a oncogénico pruebas de mutación por sí solos, debido a que estos resultados se pueden utilizar para identificar CRCs agresivas y posiblemente guiar las estrategias terapéuticas. La implicación clínica de perfiles combinatoria de proteínas y pruebas de mutaciones en términos de sensibilidad a los fármacos se está probando actualmente tanto en estudios preclínicos y clínicos prospectivos.
Nuestro estudio también descubrió una variación sustancial en perfiles proteómicos fosforilada entre emparejado CRC primarios y metastásicos . Esto estaba en contraste con el genotipado, según el cual no era completa concordancia entre los tejidos tumorales primarios y metastásicos. Esto está en consonancia con los resultados de uno de los mayores estudios de comparación entre las metástasis hepáticas primarias y coincidentes en 305 pacientes con CCR (tasa de concordancia, el 96,4%; intervalo de confianza del 95%, 93,6-98,2%) [24]. Por otra parte, un análisis genómico reciente en 84 pacientes con metástasis de CCR y hepáticos primarios demostró una alta tasa de concordancia de & gt; 90% entre las metástasis hepáticas primarias y durante cinco genes (es decir,
KRAS
,
ANR
,
BRAF
,
PIK3CA
,
TP53
) [25]. Una de las hipótesis más plausibles para dicha tasa alta concordancia en el estado mutacional es que
KRAS
mutaciones son los eventos tempranos de conducción en la progresión del CRC de adenoma [26]. Si estas diferencias en los perfiles vía se correlacionan con las respuestas al tratamiento de inhibidores específicos de RTK, podemos necesitar una biopsia de sitios metastásicos, además de los tumores primarios para obtener una predicción más precisa de la respuesta al tratamiento. Sin embargo, nuestro tamaño de la muestra era muy pequeña, con sólo diez pares de primaria y metástasis. Por lo tanto, se necesita un análisis más extenso emparejado para abordar con rigor esta discrepancia en perfiles proteómicos.
En conclusión, nuestro estudio demuestra que existe una heterogeneidad significativa en las vías de señalización de la proteína activada a pesar de un estado mutacional similar en el CRC. Por lo tanto, dichotomizing CRC simplemente como
KRAS
mutante en comparación con
KRAS WT
puede ser una subestimación de la heterogeneidad molecular dentro de cada subgrupo de CRC. Por otra parte, un perfilado más amplia vía de señalización, además de las pruebas de mutaciones oncogénicas, se debe realizar para obtener una identidad molecular más clara de los tumores.
información de apoyo
archivo S1.
Apoyo figuras. Figura S1. Perfilado de la señalización de la vía marcadores en los cánceres colorrectales utilizando CEER. (A) Clasificación de expresión Perk de mayor a menor en
KRAS
de tipo salvaje, G12 mutado y G13D mutado CRC se muestra en un diagrama de cascada. expresión Perk encima de la mediana se representa en el eje y positivo. también se muestra la expresión de pAKT en cada muestra. La siguiente tabla muestra los valores de la mediana Perk CU en cada subgrupo mutacional de CRC tumores, así como el porcentaje de tumores que expresan Perk encima de la mediana. (B) imágenes inmuno-array CEER para las proteínas de transducción de señales indicadas en 8 muestras de colon. Como se representa con una barra de color por debajo de la inmuno-array, un blanco o un rojo representa una expresión de alto nivel o fosforilación, mientras que un verde o un azul representa un bajo nivel de expresión o la fosforilación de los respectivos marcadores. estadio del tumor y el
KRAS
estado mutacional de cada muestra se indican. Figura S2. Efecto del índice de pPI3K /pHER3 en la supervivencia libre de enfermedad en los CRC. Comparativas curvas DFS de muestras CRC segregados por la disminución de ratios de pPI3K /pHER3. DFS para las muestras por encima de cada respectiva de corte se muestra en rojo y DFS para muestras debajo de cada respectiva de corte se muestra en azul. p-valores respectivos se indican. Figura S3. Características de los pares de muestras primarias CRC metastásico emparejados. Tabla que enumera las características del tumor primario de los 10 pares de CRC primarias-metastásico emparejados segregadas por sus ratios de expresión pPI3K /pHER3. 6 pares de diferentes muestras se incluyen en el grupo peor DFS donde estaba expresión pPI3K /pHER3 & gt; 2/10.