Extracto
Oral carcinoma oral de células escamosas (COCE) de los pacientes diagnosticados en estadios tardíos han limitado las opciones quimioterapéuticos que subraya la gran necesidad para el desarrollo de nuevos agentes contra el cáncer para el manejo de enfermedades más eficaz. El objetivo fue investigar el potencial anticáncer de Apaziquone, [EOquin, USAN, E09, 3-hidroxi-5- aziridinil-1-metil-2 (1H-indol-4,7-diona) prop-β-en-α- ol], un profármaco que pertenece a una clase de agentes contra el cáncer llamados agentes alquilantes bioreductive, por CCCA. inhibe la proliferación celular y la apoptosis tratamiento Apaziquone inducida en células CCCA
in vitro
. tratado Apaziquone células CCCA mostraron aumento de la activación de la caspasa 9 y caspasa 3, y poli (ADP ribosa) polimerasa (PARP) de escisión de lo que sugiere la inducción de la apoptosis por apaziquone en células de cáncer oral. Es importante destacar que, el tratamiento apaziquone redujo significativamente el volumen de xenoinjerto de tumor oral en ratones SCID //Crl NOD inmunocomprometidos sin causar toxicidad aparente a los tejidos normales. En conclusión, nuestro
e in vitro
in vivo
estudios identificados y demostraron la eficacia preclínica de Apaziquone, como un potencial candidato terapéutico novedoso contra el cáncer para el manejo del cáncer oral.
Visto: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan R (2015) Actividad anticáncer de Apaziquone en células de cáncer oral y el modelo de xenoinjerto: implicaciones para la terapia del cáncer oral. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10.1371 /journal.pone.0133735
Editor: Pei-Yi Chu, Facultad de Medicina, Universidad Católica Fu Jen, TAIWAN
Recibido: 6 Febrero, 2015; Aceptado: 30 de junio de 2015; Publicado: 24 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Srivastava et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. el apoyo financiero de este trabajo fue proporcionado por Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Los proveedores de fondos aprobado el diseño del estudio, pero no tuvo ningún papel en la recolección de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Los autores agradecen los Institutos Canadienses de Investigación en Salud para Presidente en el cáncer avanzado de diagnóstico (RR), y Alex Shnaider y Simona Presidente de cáncer de tiroides (PGW): perfil
Conflicto de intereses:. PGW y RR son accionistas de Proteocyte Diagnóstico Inc. Además, el apoyo financiero de este trabajo fue proporcionado por Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
oral carcinoma de células escamosas (COCE) comprenden una gran proporción de cáncer de cabeza y cuello de contabilidad para un estimado de 263.000 nuevos casos y unas 127.000 muertes cada año en todo el mundo [1]. La etapa temprana del CCCA pacientes (I y II) se tratan con cirugía y /o radioterapia, y tienen tasas de supervivencia a cinco años del 70% - 90% [2-4]. Sin embargo, dos tercios de los pacientes sufren de CCCA loco-regional enfermedad avanzada (estadios III y IV) en el momento del diagnóstico. Existe insuficiencia de los datos de los ensayos clínicos aleatorios para definir una estrategia óptima para los pacientes con estadios III y IV CCCA. Los pacientes con enfermedad avanzada o recurrente han limitado las opciones de tratamiento y un mal pronóstico (la tarifa & lt supervivencia a 5 años; 50%) [5]. la cirugía y la terapia de radiación definitiva son opciones para los pacientes CCCA; la cirugía y la radioterapia pueden tener un profundo efecto en la calidad de vida de los supervivientes [6, 7].
En los últimos años, la aplicación de concurrente quimio-radiación ha surgido como una alternativa atractiva a tratamiento quirúrgico tradicional de avanzada CCCA [8-10]. Es de señalar que la quimioterapia ha evolucionado a partir de los cuidados paliativos a un componente central de tratamiento curativo para la CCCA localmente avanzado. El cisplatino, carboplatino, metotrexato y taxanos son activos como agentes únicos o en combinación en recurrente o metastásica OSCC [3, 11-14]. Sin embargo, las toxicidades limitantes de la dosis en pacientes con cáncer restringen su utilidad clínica. En la actualidad, no existe un régimen de quimioterapia de segunda línea estándar para el tratamiento de OSCCs recurrentes o metastásicas. terapias Monotargeted, tales como inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3), factor nuclear kappa B (NFkB), y el objetivo de mamífero de la rapamicina (mTOR) han demostrado una eficacia limitada [15-18 ]. Por tanto, existe una gran necesidad de desarrollo de nuevos fármacos para el cáncer oral. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos compuestos con actividad contra el cáncer potente es un proceso largo y costoso. Un enfoque alternativo es la explotación de medicamentos ya establecidos que se han aprobado para uso clínico para otros tipos de cáncer.
Apaziquone [EOquin, USAN, E09, 3-hidroxi-5- aziridinil-1-metil-2 (1H indol-4,7-diona) -prop- β-en-α-ol] es un profármaco que pertenece a una clase de agentes anticancerosos llamados agentes alkylaing bioreductive que ha sufrido una amplia evaluación clínica para el cáncer de vejiga [19] . Apaziquone se activa por varias enzimas, la enzima más ampliamente investigado ser NAD (P) H: quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) o DT-diaforasa, lo que reduce apaziquone en un agente alquilante de ADN [19]. Aquí en investigamos el potencial actividad antitumoral de Apaziquone en
in vitro y Hoteles en
in vivo y modelos de cáncer oral.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivos celulares
línea celular de carcinoma de células escamosas oral AMOS III, se ha establecido a partir de betel y tabaco asociado CCCA humana por nuestro laboratorio [20]. AMOS III fue utilizado como un
in vitro
y
in vivo
modelo experimental para el cáncer oral en este estudio. Otra línea celular OSCC establecido, SCC4, se ha utilizado para evaluar la aplicabilidad más amplia de apaziquone para el potencial de la terapia del cáncer oral de CCCA. línea de células de cáncer oral no metastásico, SCC4, se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC). células de cáncer oral (AMOS III /SCC4) se cultivaron en Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 1 mmol /L de L-glutamina, y penicilina-estreptomicina (1X) en un incubador humidificado (5 % dióxido de carbono, 95% de aire) a 37 ° C como se describió anteriormente [20 a 22]. Tanto las líneas celulares han sido probados utilizando el análisis de repeticiones cortas en tándem polimorfismo y están siendo reproducidos habitualmente en nuestro laboratorio.
in vitro la proliferación celular /ensayo de citotoxicidad (ensayo MTT)
La capacidad de apaziquone de inducir efectos citotóxicos se determinó por la conversión de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) a formazán por las deshidrogenasas mitocondriales. células de cáncer oral (AMOS III y SCC4) se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos en medio completo. Las células se cultivaron a que se adhieran durante la noche y después se expusieron a concentraciones variables de apaziquone [5 nM a 100 mu M] durante 24 a 96 h para determinar la dosis y la inhibición dependiente del tiempo de la proliferación celular. La proliferación celular se midió mediante la adición de MTT a las células. Brevemente, MTT se disolvió en PBS estéril y se añadió a los pocillos a una concentración final de 1,5 mM. Las células se incubaron con MTT durante 4 h, se retiró de los medios y los cristales de formazán restantes se disolvieron en DMSO. La absorbancia de formazán solubilizado se midió a 540 nm usando un espectrofotómetro de barrido de múltiples pocillos. El porcentaje de inhibición de la proliferación celular se calculó en cada punto de tiempo y dosis de la siguiente manera: (A
Control - A
tratada /A
de control) x 100.
En LD vitro
50 mediciones para Apaziquone
para determinar la potencia de apaziquone para causar la muerte celular de las células de cáncer oral, su LD
50 se determinó utilizando células de cáncer oral AMOS III y las células SCC4. Para determinar la concentración de apaziquone requerida para matar el 50% de las células (LD
50), 5.000 células de cada línea celular se sembraron por triplicado en cultivos de tejidos cero fluorescencia tratados placas de 96 pocillos (BD Biosciences, Mississuaga, ON, Canadá ). Después de la incubación durante la noche, el medio se reemplazó con medio que contiene apaziquone en un intervalo de concentración 5 nM to100μM. Después de 48 horas, se llevó a cabo el ensayo de azul de alamar para determinar la viabilidad celular.
Ensayo de apóptosis
Para verificar los resultados de los ensayos de viabilidad celular, Anexina V y yoduro de propidio (PI) era doble tinción utilizado para cuantificar la apoptosis. células AMOS III fueron tratados con vehículo solo o apaziquone a 500 nM durante 48 horas. Las células se marcaron con anexina V-FITC y PI utilizando el kit de ensayo de anexina V, siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma, St Louis, MO) y analizados utilizando el BD Cell Quest Software Pro. Estos resultados fueron verificados adicionalmente usando análisis de Western blot para caspasas específicas y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de ensayo.
Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
Los medios de comunicación cultivadas a partir de tratar, vehículo control y células tratadas AMOS III apaziquone se recogieron y centrifugaron para recoger las células no adherentes. Las células adherentes se lavaron con PBS (pH 7,4) y se trataron con tripsina. Ambas poblaciones de células no adherentes y adherentes se agruparon para el análisis adicional. Las células se fijaron en etanol al 70% (-20 ° C, durante la noche) y se resuspendieron en tampón que contenía PBS (pH 7,4), EDTA (0,5 mol /L, pH 8,0), Triton X-100 (0,05%), la RNasa A ( 50 mg /ml), y PI (100 mg /ml) antes del análisis de citometría de flujo.
ensayo TUNEL
ensayo TUNEL se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Apaziquone-tratada y se recogieron las células de control de vehículo AMOS III como se describe anteriormente. El etiquetado y el ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante, y los resultados fueron analizados mediante microscopía de escaneo láser confocal.
in vivo
actividad antitumoral de Apaziquone en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de células escamosas oral humana En
Este
in vivo
estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal del hospital Monte Sinaí antes de la apertura y el cuidado de los animales se realizó de acuerdo con el Centro de Toronto Phenogenomics (TCP) pautas a considerar la bienestar de los animales y reducir al mínimo la angustia. Un estudio preclínico se realizó para comparar la eficacia de diferentes concentraciones de apaziquone y control del vehículo en un modelo animal de SCC oral humana. La concentración predeterminada /dosis más efectiva de apaziquone fue tomada hacia adelante para
in vivo
las pruebas en modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer oral. Dos meses de edad de sexo masculino NOD-inmune comprometido /SCID /CRL#394 ratones fueron por vía subcutánea (sc) implantado con 1 x 10
6 células cancerosas en un medio libre de suero en la región del flanco para establecer tumores, de acuerdo con las pautas de Cuidado de Animales institucional . Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 100 a 200 mm
3, los ratones se asignaron al azar en grupos (n = 6 /grupo) de acuerdo con los volúmenes tumorales y los pesos corporales de los siguientes tratamientos: el control del vehículo sin tratar (0,1% DMSO -n = 6) y el brazo apaziquone tratados del estudio (n = 6). En el brazo de apaziquone del estudio, los ratones que llevan los tumores recibieron instilaciones intraperitoneales de apaziquone a 0,1 mg /kg de peso o de control del vehículo en 0,1% de DMSO 8 semanas después de la implantación del tumor. El tratamiento con fármacos se continuó durante 6 semanas. la incidencia de tumores, el volumen del tumor, el peso y la supervivencia global y la mediana de los animales se registraron. Los ratones se controlaron dos veces a la semana en busca de signos y síntomas. En la conclusión del estudio, se recogió sangre de la vena safena de los ratones para un análisis de recuento sanguíneo completo y el órgano prueba de funcionamiento antes de la anestesia. Los ratones fueron sacrificados luego por dislocación cervical o antes, si los tumores superaron el 20% de masa corporal y /o si los ratones muestran signos clínicos de palidez, encorvado, disnea y el movimiento anormal. Después de la eutanasia, los órganos se recogieron e inmediatamente se fijaron en formalina. Se midió el volumen del tumor. Los tumores fueron cosechadas y una rodaja línea media cara corte antero-posterior del tumor se fijaron en formalina. La periferia del tumor y el centro fue cortado en cubitos y flash congelado en nitrógeno líquido en viales separados. inmunohistoquímica Ki67 (IHC) se realizó con secciones de tejido FFPE (espesor de 4 micras) de los tumores de apaziquone tratado y de control del vehículo xenoinjertos de ratones del grupo siguiendo el procedimiento descrito por nosotros anteriormente [23]. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-Ki67 a una dilución de 1: 100 (Abcam, Laboratorios Cedarlane, Burlington, ON, Canadá) durante 1 h y anticuerpo secundario de conejo durante 20 min, seguido por el reactivo VECTASTAIN Elite ABC (Vector Labs, Burlingame, CA) utilizando diaminobencidina como cromógeno. En las secciones de tejido de control negativo, el anticuerpo primario fue sustituido por específico de isotipo de ratón no inmune /IgG de conejo. Las secciones fueron evaluados mediante un examen microscópico de luz. Hemotoxylin & amp; Eosina (H & amp; E) tinción también se realizó en secciones de xenoinjertos tumorales de ratón embebidos en parafina
El análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo utilizando el software SPSS 20.0 (Chicago).. La significación estadística se determinó usando la prueba t de Student pareada de dos colas. Una probabilidad p ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Estos
in vitro
estudios en determinar la LD
50 de apaziquone que se utiliza para guiar la dosis de apaziquone para ser utilizado en los
in vivo
estudios y establecer el modo de muerte celular en células de cáncer oral.
resultados
Efecto de apaziquone en las células cancerosas orales
Las curvas de dosis-respuesta en las células apaziquone AMOS III y SCC4 se muestran en la figura 1. El LD
50 de apaziquone en AMOS III y SCC4 fueron 500 nM y 1μM respectivamente (figura 1).
Alamar azul ensayo se realizó para determinar el> 50 de apaziquone en AMOS III y SCC4 células sub LD
análisis de la expresión de las proteínas apoptóticas por Western blot
se analizaron las proteínas extraídas de las células AMOS III tratados y tratados con apaziquone mediante Western blot de PARP, caspasa 9 y caspasa 3. Con el aumento de la dosis de expresión Apaziquone de la longitud completa de la caspasa 9 proteína disminuyó y la exfoliados caspasa 9 aumentó, mientras que la expresión de PARP escindida y se escindió de la caspasa 3 aumentó. (Fig 2A y Fig S1) y el efecto similar de Apaziquone se observó en las células SCC4 en estas proteínas (Fig 2B y S1 FIG), confirmando la inducción de la apoptosis mediante el tratamiento apaziquone en ambas líneas celulares de cáncer oral.
Equal cantidades de proteínas en extractos libres de células preparados a partir de AMOS III y células SCC4 tratados con diferentes dosis de Apaziquone (250 nM, 500 nM y con 1 m) y así como las células de control tratados con vehículo no tratados se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVP, se sondaron con anticuerpos específicos y se detectó utilizando ECL. Paneles show-células (A) AMOS III y células SCC4 (B). Un aumento dependiente de la dosis en PARP escindida, caspasa 9 escindida y se observó exfoliados caspasa 3 en ambas líneas celulares de cáncer orales ensayadas. β-actina se utilizó como control de carga.
muerte celular por apoptosis inducida Apaziquone medida por Túnel Ensayo
ensayo de túnel efectuado en las células AMOS III mostraron una mayor fragmentos de ADN en las células tratadas Apaziquone en comparación con células de control de vehículo no tratado tratadas (Fig 3).
células AMOS III Apaziquone tratados mostraron fragmentos de ADN aumentaron en comparación con las células de control no tratadas vehículo que representan aumento de la apoptosis en las células tratadas con fármaco.
apaziquone la muerte celular inducida por apoptosis medido por Anexina V ensayo
ensayo de anexina V se realiza en las células tratadas apaziquone AMOS III utilizando FACS mostró un aumento significativo en la apoptosis temprana y tardía en las células tratadas apaziquone (38%) en comparación a la no tratada (5%) y las células de control tratados con vehículo (8%) (Fig 4A).
(a) Apaziquone células tratadas AMOS III mostraron aumento significativo de la apoptosis temprana y tardía (38%) en comparación con las células no tratadas (5%) y vehículo de control (8%) mediante el ensayo de anexina V. (B) Apaziquone células tratadas AMOS III muestran significativamente mayor número de células en el Sub G
O
fases 2M en comparación con el control sin tratar las células G AMOS III fase y.
Apaziquone la muerte celular apoptótica inducida medida por análisis del ciclo celular
análisis del ciclo celular de células tratadas apaziquone AMOS III mostraron significativamente mayor número de células en el Sub G
O y G
fases 2M en comparación con los no tratados las células de control comprobar el incremento de la apoptosis en las células tratadas con fármaco (figura 4B).
actividad antitumoral in vivo Red de apaziquone
El
in vivo
antitumoral la actividad de apaziquone se evaluó en modelos de xenoinjertos de cáncer orales en pacientes inmunodeprimidos ratones macho NOD /SCID /CRL#394. No hubo ningún cambio significativo en el peso corporal de los ratones en el grupo tratado apaziquone o ratones de control no tratados vehículo en el transcurso de 42 días de tratamiento (figura 5A). El crecimiento del tumor se retrasó significativamente por apaziquone (dosis de 0,1 mg /kg) de tratamiento durante este periodo de tiempo. Esta dosis se selecciona de entre el estudio piloto que se llevó a cabo utilizando dosis múltiples varía de 0,05 mg /kg del peso corporal de 0,5 mg /kg. En el grupo de tratamiento, el volumen medio del tumor fue de 220.05mm
3 (SD-19,76) en comparación con el volumen medio del tumor de 376,18 mm3 (SD-54.08) en el grupo de control de vehículo no tratado. Este estudio mostró que el tratamiento apaziquone retrasó significativamente el crecimiento tumoral (valor de p & lt; 0,001, emparejado prueba t de Student entre los grupos tratados y no tratados de dos colas; la figura 5B y 5C).
(A) Ningún cambio significativo en peso corporal se observó en los ratones tratados apaziquone o los ratones de control vehículo durante el curso del tratamiento. (B) Efecto del tratamiento apaziquone en el tamaño del tumor en ratones. tumores extirpados representativos que muestran la diferencia en el tamaño de los tumores entre apaziquone tratados y los ratones del grupo control no tratado. (C) Efecto del tratamiento Apaziquone el retraso del crecimiento tumoral. xenoinjertos de tumores desarrollados en los flancos de ratones NOD /SCID /CRL se administraron con apaziquone (0,1 mg /kg de peso corporal) inyecciones intraperitoneales semanales durante 6 semanas. tratamiento Apaziquone retrasó el crecimiento tumoral de forma significativa (valor p & lt; 0,001, emparejado la prueba t de Student de dos colas) en los ratones del grupo tratados con fármaco, en comparación con los ratones en los grupos de control o de control del vehículo no tratados. (D) Efecto del tratamiento Apaziquone en los riñones y el hígado de los ratones. La histología de los tejidos de hígado y riñón obtenidos al término de la
in vivo
estudio. Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). i: Sección de hígado después del tratamiento con el control del vehículo. ii: Sección de hígado después del tratamiento con apaziquone. iii: Sección del riñón después del tratamiento con el control del vehículo. iv: Sección del riñón después del tratamiento con apaziquone. No se observó necrosis o fibrosis oncocítico en ambos riñones y el hígado después del tratamiento con apaziquone. v: Ki67 inmunotinción tinción inmunohistoquímica para Ki67 de sección de tejido tumoral de xenoinjertos control sin tratar por vía oral que muestra un alto nuclear y vi: xenoinjerto tratados apaziquone que muestra marcadamente reducida tinción de Ki67 de la sección de tejido tumoral de xenoinjertos tratados apaziquone (aumento original x 200)
Los ratones tratados mostraron apaziquone se observó sólo pocos efectos secundarios tales como pérdida menor peso, aspecto encorvado, con los ojos hundidos y la catarata unilateral en algunos ratones. Sin embargo, macroscópica y microscópica (H & amp; E manchada) el examen del hígado no mostró signos evidentes de necrosis oncocítico o fibrosis en los ratones en el grupo tratado apaziquone. Del mismo modo, no se observaron lesiones renales brutos o microscópicas en los ratones tratados con apaziquone. Estos resultados fueron confirmados por el patólogo (Figura 5D).
La función hepática y pruebas de función renal no mostraron diferencias significativas entre los ratones en los grupos tratados y de control apaziquone vehículo sin tratar. Estos hallazgos confirman además que no había toxicidad en el grupo tratado apaziquone (S1 Tabla). Sin embargo, el hemograma tenía algunas diferencias en el número de glóbulos blancos (WBC) y el recuento de neutrófilos. Los ratones en el grupo tratado apaziquone había aumentado números de glóbulos blancos en ambos (media de los recuentos de 56,1 frente a 33,4) y los neutrófilos (52,2 vs. 29,7) en comparación con los ratones del grupo de control del vehículo (S2 Tabla).
Discusión
el objetivo de este estudio fue determinar la actividad anti-tumor de apaziquone para investigar su potencial como una alternativa eficaz a los agentes quimioterapéuticos utilizados actualmente para la gestión de los pacientes CCCA. Apaziquone es un pro-fármaco quinona indol que se activa por reductasas diaforasa DT celulares en regiones bien oxigenadas de los tumores, mientras que en condiciones de hipoxia apaziquone es activado por reductasas citocromo P450 [24]. La conversión de apaziquone a los metabolitos activos, a su vez alquilatos el ADN genómico y conduce a la muerte apoptosis /célula. Apaziquone ha demostrado ser activo contra diferentes tipos de tumores tanto
in vitro
y
in vivo
incluyendo carcinoma de colon, melanoma, renal y carcinoma de pulmón de células no pequeñas y líneas celulares de cáncer del sistema nervioso central [19, 25]. Apaziquone también mostró significativos efectos antiproliferativos contra varios tumores sólidos murinos y humanos, incluyendo los tumores de colon de ratón generalmente resistentes MAC y gástricas, ovario y de mama xenoinjertos [26]. Apaziquone ha sido ampliamente investigado contra el cáncer de vejiga urinaria en los estudios clínicos no sólo pre-clínicos, pero también múltiples [27]. A nuestro entender, este estudio es el primer informe sobre los efectos anticancerígenos de apaziquone en el cáncer oral.
Aquí hemos demostrado que en apaziquone es potentemente activa contra las células de cáncer oral. Nuestros resultados demostraron una reducción de la proliferación celular y el aumento de la fracción de células en sub-G
o-fase del ciclo celular que sugiere apaziquone inducida por la muerte celular en las células CCCA. Se confirmó la apoptosis como principal causa de aumento de la muerte celular en las células tratadas con apaziquone AMOS III CCCA utilizando ensayo de anexina V. Nuestras conclusiones fueron apoyadas además por el aumento de los niveles de PARP fragmentada (enzima de reparación del ADN) después de la escisión de la caspasa 9, lo que sugiere la activación de la apoptosis en las células tratadas apaziquone CCCA.
En apoyo de nuestro
in vitro
datos que demuestran la eficacia de apaziquone como un nuevo fármaco para el COCE,
in vivo
estudios de xenoinjertos de ratón reveló una marcada reducción del crecimiento del tumor con menor pérdida de peso en los animales tratados apaziquone en comparación con el grupo de animales control del vehículo. Los tumores tratados con el fármaco mostraron una reducción marcada expresión del marcador de proliferación, Ki67, en comparación con el control sin tratar tumores por inmunohistoquímica que demuestran que el tratamiento apaziquone reducida proliferación de células tumorales
in vivo
. Por otra parte, las muestras de suero para los perfiles de química clínica, hematología y pruebas de la función de órganos de los ratones tratados apaziquone no mostraron ninguna toxicidad aparente en los animales tratados. Tomados en conjunto, estos hallazgos preclínicos sugieren que apaziquone tiene un efecto terapéutico sobre el cáncer oral
in vivo
.
Evaluación clínica de apaziquone se detuvo por falta de eficacia en los ensayos de fase II [25, 28] . administración de fármacos pobre a los tumores causados por una combinación de la rápida eliminación farmacocinética y la mala penetración a través del tejido avascular fueron los principales factores responsables de su poca eficacia. Choudry et al [29] sugirió que un subconjunto de pacientes con cáncer de vejiga existe cuyos tumores poseen la maquinaria bioquímica adecuada requerida para activar este fármaco. Puesto que un factor significativo en la falta de apaziquone en la clínica se atribuyó a su eliminación farmacocinética rápida resultando en una mala administración de fármacos a los tumores, se propuso la administración intravesical de EO9 para eludir el problema de la administración de fármacos a los tumores. Sobre la base de una comprensión de por qué no apaziquone, una nueva fase I /II de ensayos clínicos contra el cáncer superficial de vejiga mediante la administración intravesical fue encargado en 2001 y patrocinado por Spectrum Pharmaceuticals (Irvine, CA) [19]. actividad antitumoral significativa se informó en la fase I /II [30], y esto fue confirmado posteriormente en estudios de fase II [31]. Puri
et al
[30] demostró que apaziquone administrada por vía intravesical es bien tolerada a nivel local y sistémica, y que tiene la actividad de ablación de las lesiones marcador de cáncer superficial de vejiga. Hendricksen et al., [32] mostró que un solo tumor de vejiga instilación en la resección transuretral de post-inmediata de apaziquone fue bien tolerado con un buen perfil de seguridad esperada. Apaziquone y su metabolito EO5a no se detectaron sistémicamente con los análisis farmacocinéticos [26]. El análisis de los datos agrupados de dos en fase III de ensayos clínicos separados para apaziquone en el cáncer de vejiga mostró un efecto significativo del tratamiento a favor de apaziquone en el criterio principal de valoración de la tasa de recidiva tumoral a los 2 años (p-valor = 0,0174) y en una variable secundaria de valoración , el tiempo hasta la recidiva (p-valor = 0,0076). Sin embargo, no cumplió con su objetivo primario de una diferencia estadísticamente significativa en la tasa de recidiva tumoral a los 2 años entre los dos brazos [33]. Estos ensayos clínicos utilizando la administración intravesical de apaziquone directamente en la vejiga apoyaron nuestra justificación del uso de este medicamento para tratar el cáncer oral debido a la cavidad oral es de fácil acceso para la administración de fármacos localizada y es probable que mejore la farmacocinética de apaziquone para uso clínico en pacientes con cáncer oral.
Loco-regional está emergiendo como un complemento importante de la cirugía y la quimioterapia sistémica en pacientes seleccionados con algunos tipos de cáncer [34-37]. En este contexto, apaziquone ha surgido como un medicamento localmente eficaz en cáncer de vejiga superficial [19]. Nuestro
in vitro
y
in vivo
estudios sobre apaziquone en el cáncer oral proporcionan evidencia preclínica de su eficacia y garantiza futura fase I y estudios farmacológicos en apoyo de su potencial uso clínico. En el caso de que la administración sistémica de apaziquone en pacientes con cáncer oral produce eficacia limitada, que puede ser explorado para la quimioterapia locorregional como adyuvante a la cirugía como la mayoría de los sitios dentro de la cavidad oral son fácilmente susceptible de loco-regional aplicación del fármaco.
Una de las limitaciones de nuestro estudio es que no hemos determinado el nivel de expresión o actividad de NAD (P) H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) también conocido como DT-diaforasa 1, la enzima implicada en el metabolismo de apaziquone en forma oral SCC células; investigación a fondo de NQO1 en COCE y su importancia para la eficacia en pacientes apaziquone CCCA se llevará a cabo en un futuro estudio. Sin embargo, la expresión de proteína NQO1 Recientemente se ha informado de predecir mal pronóstico de no pequeñas de cáncer de pulmón de células [38].
Conclusiones
Apaziquone mostró actividad contra el cáncer prometedor en líneas celulares de cáncer orales matar al cáncer células por apoptosis. Además, apaziquone demostró actividad antitumoral prometedora en xenoinjertos de tumor de cáncer oral sin toxicidad significativa a los tejidos normales que subraya la eficacia preclínica de apaziquone, como un potencial candidato terapéutico novedoso contra el cáncer para la gestión de cáncer oral.
Apoyo información
S1 Fig. . Densitometría análisis Western blot
histogramas del western blot análisis de densitometría de la caspasa 3, caspasa 9, exfoliados caspasa 9, PARP y se escindió PARP normalizado a ß-actina en comparación con los controles no tratados (NTC)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s001 gratis (TIF)
S1 tabla. Perfil clínico Química, Hígado & amp; Pruebas de función renal
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s002 gratis (DOCX)
S2 tabla. Hemograma completo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0133735.s003 gratis (DOCX)