Extracto
Antecedentes
La emodina se ha demostrado inducir la apoptosis de cáncer de páncreas células y inhibir el crecimiento tumoral en nuestros estudios anteriores. Este estudio fue diseñado para investigar si emodina podría inhibir la angiogénesis de tejidos de cáncer de páncreas y su mecanismo.
Metodología /Principal Encontrar
De acuerdo con nuestro estudio anterior, emodina el crecimiento de células de cáncer de páncreas inhibido, apoptosis inducida, y mejor será el efecto antitumoral de la gemcitabina en las células pancreáticas caner
in vitro
y
in vivo
mediante la inhibición de la actividad de NF-kB. Aquí, por primera vez, hemos demostrado que inhibe la angiogénesis tumoral emodina
in vitro Opiniones y en tejidos de cáncer de páncreas implantados, disminución de la expresión de factores asociadas con la angiogénesis (NF-kB y sus factores de VEGF regulado, MMP-2 , MMP-9, y eNOS), y la reducción de la fosforilación de la eNOS, como se evidencia por tanto inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western de los tumores implantados. Además, hemos encontrado que emodina no tuvo ningún efecto sobre la expresión de VEGFR
in vivo
.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados sugieren que emodina tiene un potencial efecto anti-tumor en páncreas el cáncer a través de su doble papel en la promoción de la apoptosis y la supresión de la angiogénesis, probablemente a través de la regulación de la expresión de NF-kappa B y NF-kappa B-regulado factores de angiogénesis asociada
Visto:. Lin SZ, Wei WT, Chen H, Chen KJ, Tong HF, Wang ZH, et al. (2012) Actividad antitumoral de emodina contra cáncer pancreático depende de su doble función: Promoción de la apoptosis y la supresión de la angiogénesis. PLoS ONE 7 (8): e42146. doi: 10.1371 /journal.pone.0042146
Editor: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Francia |
Recibido: Marzo 22, 2012; Aceptado: 2 Julio 2012; Publicado: 2 Agosto 2012
Copyright: © Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores estamos agradecidos por el apoyo financiero de: La Administración de Medicina tradicional china de la provincia de Zhengjing, china (Grant No. 2011ZZ010), Fondo de Ciencias de Zhejiang Provincial de jóvenes Investigadores Distinguidos (subvención nº LR12H280001) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (Grant n . 81173606). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Actualmente, el tratamiento de cáncer de páncreas es dependiente de la resección quirúrgica. Sin embargo, sólo alrededor del 25% de los pacientes con cáncer de páncreas son factibles para la resección quirúrgica debido a la invasión de cáncer de páncreas. Muchos pacientes con cáncer de páncreas localmente avanzado o metastásico dependen de la quimioterapia gemcitabina [1]. Sin embargo, el cáncer de páncreas es un representante de los tumores sólidos más altamente vascularizados y angiogénicos, que responde mal a la quimioterapia gemcitabina. Estudios anteriores han sugerido que el tratamiento con gemcitabina en el tiempo de supervivencia media de alrededor de 6,2 meses [2]. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas estrategias de tratamiento con el objetivo de mejorar la capacidad anti-angiogénico es urgente en la práctica clínica con el fin de mejorar la eficacia terapéutica y inhibir la metástasis de cáncer de páncreas
.
La activación constitutiva del factor nuclear-kB (NF-kB ) puede promover la proliferación celular, inhibir la apoptosis de las células, y regular la expresión de genes asociados con la angiogénesis [3], [4]. Además, las evidencias sugieren que la acumulación de NF-kB juega un papel importante en el crecimiento, inhibición de la apoptosis y la angiogénesis del cáncer de páncreas [5]. La gemcitabina se puede mejorar la expresión y la activación de NF-kB en las células de cáncer de páncreas [6], que se asocia con el desarrollo de quimiorresistencia de cáncer de páncreas. Por lo tanto, un nuevo fármaco que inhibe la expresión de NF-kappa B y la activación puede inducir la apoptosis de células cancelar y reducir la angiogénesis del cáncer de páncreas, mejorando así la actividad anti-tumor de gemcitabina y potencialmente beneficiar a pacientes con cáncer de páncreas.
emodina (1,3,8-trihidroxi-6-metilantraquinona), un derivado de antraquinona natural aislado de Rheum palmatum L, es capaz de inhibir el crecimiento de células de cáncer de páncreas como se evidencia por los estudios anteriores [6], [7], [ ,,,0],8]. Sorprendentemente, se ha informado de que emodina tiene el potencial de inhibir varios procesos angiogénicos [9], [10]. Se ha sugerido que emodina puede inhibir el crecimiento de células de cáncer mediante el bloqueo de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) de señalización en células de cáncer de colon humano, lo que indica que emodina puede ser utilizado como un inhibidor potencial de la angiogénesis del tumor [11]. Sin embargo, no queda claro si emodina podría inhibir la angiogénesis del cáncer de páncreas. Curiosamente, se ha encontrado que emodina puede inhibir la expresión y la activación de NF-kB [6], [12]. Por lo tanto, en el presente estudio, que tuvo como objetivo investigar si emodina puede inhibir el crecimiento de células de cáncer de páncreas y de la angiogénesis del cáncer de páncreas a través de un posible mecanismo implicado NF-kB. Se encontró que el tratamiento con emodina aumentaron la inhibición del crecimiento inducida por gemcitabina y la apoptosis de las células del cáncer pancreático
in vitro
. Además, demostró la inhibición del crecimiento del tumor y anti-angiogénesis efectos de emodina en el cáncer de páncreas
in vivo
, con la regulación negativa de la expresión de NF-kappa B y proteínas reguladas por NF-kappa B (es decir, VEGF, MMP-2, MMP -9, y eNOS) y con papeles en inhibición de la angiogénesis y la reducción de la eNOS fosforilación.
resultados
citotoxicidad de emodina contra las células SW1990, Panc-1 células, HPNE y EC
para probar la citotoxicidad de emodina, las células SW1990 y las células Panc-1 fueron tratados con diferentes dosis de emodina (10 m, 20 m, 40 m, y 80 mM) durante 72 h, y las viabilidades de estas células se determinaron utilizando el CCK-8 ensayo. Como se muestra en la Fig. 1A, el tratamiento con emodina sola redujo la viabilidad celular tanto de las células SW1990 y las células Panc-1 de una manera dependiente de la dosis. análisis de CCK-8 reveló que después de las células SW1990 y las células Panc-1 se trataron con emodina (40 M) durante 12 h, 24 h, 48 h y 72 h, emodina redujo la viabilidad celular de las dos líneas celulares en una manera dependiente del tiempo (Fig. 1B). Curiosamente, emodina tratamiento (40 M) durante 72 h redujo la viabilidad celular de las células SW1990 y las células Panc-1 por 46,4% y 40,8%, respectivamente. Sin embargo, el tratamiento combinado de ambos emodina y gemcitabina redujo significativamente la viabilidad celular de las células SW1990 y las células Panc-1 por 72,4% y 54,7%, respectivamente, lo que indica un aumento de la citotoxicidad del tratamiento farmacológico combinado contra las células SW1990 y las células Panc-1 en comparación a la terapia de agente único (Fig. 1C) (
P Hotel & lt; 0,05). Por otra parte, se encontró que la emodina, gemcitabina, y su combinación no cambió el crecimiento de las células epiteliales normales pancreáticos humanos (HPNE) (Fig. 1D). Se encontró que la gemcitabina (20 mmol /L) de tratamiento redujo significativamente la muerte celular en pancreático ECs derivados del cáncer, mientras que la emodina (/L 40 mmol) de tratamiento y el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina mejorado la muerte celular en estas células, lo que indica que emodina tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación de páncreas ECs derivados del cáncer.
se utilizaron las células sin tratamiento de drogas como control. (A) emodina inhibió la proliferación de las células SW1990 y las células Panc-1 de una manera dependiente de la dosis. (B) emodina inhibió la proliferación de las células SW1990 y las células Panc-1 de una manera dependiente del tiempo. (C) emodina potenció la inhibición de la proliferación de las células SW1990 y las células Panc-1 por gemcitabina. (D, E) Viabilidad de HPNE y EC se evaluó después de tratarse con el control de diluyente, gemcitabina (20 mmol /L), emodina (40 mmol /L), o su combinación durante 72 h. La cuantificación se realizó mediante el cálculo de la relación de un valor con el control. Los datos se expresan como media ± SD de cada grupo de células a partir de tres experimentos separados. Emo: emodina; Gema: gemcitabina. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en la apoptosis de células SW1990 y Panc-1 células
Además de citometría de flujo análisis reveló que el tratamiento con emodina solo el aumento de la tasa de apoptosis de las células SW1990 del 3,7% al 15,3% y el de las células Panc-1 del 7,7% al 26,0%. Comparado con el tratamiento solo medicamento, el tratamiento combinado con ambos fármacos inducidas tasas significativamente mayores de apoptosis (
P
& lt; 0,05), que fueron 41,2% para las células SW1990 y 38,7% para las células Panc-1 (figura 2A y B). Estos datos son consistentes con estudios previos de inhibición del crecimiento celular usando el ensayo de MTT, lo que indica que la pérdida de células viables por emodina y /o gemcitabina es al menos en parte debido a la inducción de la apoptosis de las células.
(A) representativos punto-gráficos que ilustran el estado apoptótica de las células SW1990 y células Panc-1. (B) El porcentaje de células apoptóticas y células SW1990 Panc-1. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de la emodina sobre la angiogénesis del derivado de cáncer de páncreas EC
El ensayo de angiogénesis se llevó a cabo para investigar el efecto de emodina sobre la angiogénesis
in vitro
. Se encontró que el tratamiento con gemcitabina (20 mmol /L) hasta reguladas el índice de la angiogénesis, mientras que el tratamiento emodina (40 mmol /L) y el tratamiento combinado de gemcitabina y emodina las reguladas el índice, lo que indica que emodina puede inhibir la angiogénesis espontánea y gemcitabina inducida (Figura 3).
(a) micrografías representativas (200 ×) de la angiogénesis después de un tratamiento de control de diluyente, gemcitabina (20 mmol /L), emodina (40 mmol /L), o su combinación para 72 h. Las células se sembraron en los pocillos recubiertos previamente con Matrigel (5 × 10
3 células /pocillo) y se cultivaron en medio DMEM FBS-10%. Aumento original. (B) La angiogénesis de células endoteliales (EC) aisladas a partir de tejidos de cáncer de páncreas.
In vitro
angiogénesis se analizó cuantitativamente como se describe en Materiales y Métodos. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en la expresión y la actividad de NF-kB
Los resultados del análisis EMSA mostraron que el tratamiento con emodina significativamente las reguladas la actividad de unión a ADN de NF-kB en las células SW1990 y las células Panc-1 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4A y B). Los niveles relativos de NF-kB /p65 en las células SW1990 y las células Panc-1 se determinaron usando el ensayo de transferencia Western. Se encontró que la gemcitabina regulado hasta la expresión de NF-kB /p65 en las células SW1990 y células Panc-1. Sin embargo, el tratamiento con emodina solo o combinado gemcitabina disminuyó significativamente la expresión espontánea de NF-kB /p65 en ambos tipos de células. NF-kappa B es un factor de transcripción potente para regular la expresión de genes relacionados con la apoptosis (figura 4c y D). Estos datos indicaron que emodina inhibe la expresión de NF-kappa B y promover la apoptosis de las células de cáncer de páncreas
in vitro
, mejorando así la inhibición del crecimiento celular y la proliferación por el tratamiento combinado.
(A) imágenes representativas que muestran que el tratamiento con emodina para 72 h inhibió la actividad de NF-kappa B de una manera dependiente de la dosis en las células SW1990 y las células Panc-1. (B) Los datos se expresan como media ± SD% de los niveles relativos de la activación de NF-kB en las células SW1990 y las células Panc-1 a partir de árboles experimentos separados. La igualdad de carga de proteínas fue asegurada por inmunotransferencia 10 g de proteína nuclear con el anticuerpo anti-retinoblastoma. Los extractos nucleares de células de cáncer gástrico SGC7901 no estimuladas se utilizaron como control negativo, y SGC7901 células estimuladas con 50 ng /ml TNF se utilizaron como control positivo. +: Control positivo; -: control negativo. (C) La emodina atenuó la expresión espontánea y gemcitabina inducida por NF-kB en las células SW1990 y células Panc-1. (D) La cuantificación se realizó mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en el crecimiento de forma ortotópica Trasplantados cáncer pancreático
El protocolo de tratamiento se muestra en la figura 5A. Al día 56 después de los tumores se implantaron, el peso medio de los tumores tratados con solución salina normal, emodina (40 mg /kg), gemcitabina (100 mg /kg), y emodina (40 mg /kg) más gemcitabina (80 mg /kg) fue (1,721 ± 0,149) g, (1,021 ± 0,109) g, (0,794 ± 0,082) g, y (0,393 ± 0,057) g, respectivamente. Se observó una disminución significativa (
P
& lt; 0,05) en el peso del tumor en el grupo de emodina o gemciatabine comparación con el control sin tratar y el mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral en el grupo de combinación (figura 5B y C) (
P & lt; 0,05
, en comparación con el grupo de control o fármaco individual).
(a) ilustración esquemática de protocolo experimental. (B) Las fotografías de los tumores pancreáticos implantados de forma ortotópica en el día 28 después del tratamiento. El tratamiento combinado de emodina y gemcitabina inhibió significativamente el crecimiento del tumor. (C) Los pesos de los tumores de los grupos individuales de los ratones en el último día del experimento (Día 37). *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en el crecimiento de forma ortotópica implantado cáncer de páncreas detectado por MicroPET
Después de ser tratada durante 4 semanas, la ratones desnudos fueron imágenes con alta resolución de la tomografía por emisión de positrones (MicroPET) (Fig. 6A) y el flúor-18 marcado con fluorodeoxiglucosa (
18 F-FDG) para determinar la relación de tumor a tejido muscular normal (T /NT ratio) en las mismas regiones de tamaño de interés (ROI) y valores de captación estándar (SUV). En comparación con la relación de T /NT del grupo de control (2,78 ± 0,042), los del grupo de gemcitabina (1,88 ± 0,043) y el grupo emodina (2,20 ± 0,052) se redujo significativamente (
P & lt; 0,05
), y el grupo de combinación (1,55 ± 0,058) se redujo aún más (
P
. & lt; 0,05, en comparación con los grupos de fármacos individuales) (Fig 6B). Los SUV del grupo de gemcitabina (3,61 ± 0,12) y el grupo emodina (4,10 ± 0,35) se redujo significativamente en comparación con el grupo control (5,49 ± 0,22) (
P & lt;
0,05), y el grupo de combinación ( 2,72 ± 0,08) tenían absorción incluso más bajo que los grupos de fármacos individuales (
P & lt;..
0,05) (Fig 6C)
(a) MicroPET que muestra una gran sección coronal tumor trasplante ortotópico de una ratón desnudo. (B y C) Relación de T /NT y SUVs en el grupo de gemcitabina, el grupo emodina y el grupo de combinación fueron más bajas que la del grupo de control (cloruro sódico al 0,9%) (
P
& lt; 0,05), y el grupo de combinación mostró aún más bajo /T NT y SUVs que el grupo emodina y el grupo de gemcitabina. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de la emodina sobre la angiogénesis de forma ortotópica implantado cáncer de páncreas detectado por el tumor vascular Imaging
Como se demuestra en la figura 7A y B, análisis de imágenes vascular tumor reveló que gemcitabina aumentó la distribución recipiente (
P
& lt; 0,05), aunque se redujo el volumen del tumor en comparación con el grupo de control como se muestra por MicroPET (
P & lt
; 0,05). Sin embargo, se encontró que tanto el volumen del tumor y la distribución recipiente en el grupo de emodina y el grupo de combinación redujo significativamente en comparación con los grupos control y gemcitabina (
P
& lt; 0,05) (figura 7A y B). Además, el análisis de inmunohistoquímica mostró que el tratamiento con gemcitabina significativamente hasta reguladas los niveles de expresión de CD31 y CD105, que se pueden disminuyó notablemente por el tratamiento emodina y el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina (figura 7C y D). Estas observaciones sugieren que la emodina podría inhibir la angiogénesis de tumores implantados de forma ortotópica
A:. La imagen vascular de los tumores fueron capturados por la máquina de rayos-X. B: la densidad vascular se calculó como el número de los vasos sanguíneos del tumor total dividido por el volumen del tumor, y luego normalizada con el grupo control. (C) emodina solo o combinado con gemcitabina inhibió la expresión de CD31 y CD105. Se presentan (D) de datos cuantificados. La cuantificación se realizó mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en la expresión de proteínas asociadas con la angiogénesis en el cáncer pancreático ortotópico tejidos detectada por inmunohistoquímica y Western Blot
como se muestra en la Fig. 8, el análisis de inmunohistoquímica reveló que emodina y gemcitabina las reguladas la expresión de Ki-67 en comparación con el grupo control (
P
& lt; 0,05), y su combinación más abajo-regulada la expresión Ki-67 en comparación con los tratamientos con fármacos individuales (
P Hotel & lt; 0,05). Tanto el análisis de inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western revelaron que la gemcitabina hasta reguladas la expresión de VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, y NF-kappa B en los tumores ortotópicamente thanspanted comparación con el grupo control (
P & lt
; 0,05), mientras que emodina solo o combinado con gemcitabina reguladas por la expresión de factores de la angiogénesis asociada (VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, y NF-kappa B) en los tejidos de cáncer de páncreas (
P
& lt; 0,05). Además, el tratamiento emodina y el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina inhibieron significativamente la fosforilación de la eNOS. Sin embargo, se encontró que ninguno de los tres tratamientos altera el nivel de expresión de VEGFR en tejidos de cáncer de páncreas.
análisis (A) La inmunohistoquímica de la expresión de Ki-67, NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9, y eNOS en los tejidos de cáncer de páncreas ortotópico. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de NF-kappa B, VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, VEGFR, y p-eNOS en los tejidos de cáncer de páncreas ortotópico. Se presentan (C) cuantificado de los datos de análisis de inmunohistoquímica. (D) La cuantificación de los resultados de Western blot se llevó a cabo mediante el cálculo de la relación entre el valor para el grupo de control. *,
P Hotel & lt; 0,05; #,
P Hotel & gt;. 0,05
Efecto de emodina de NF-kB La actividad en trasplantados de páncreas Cáncer de tejidos
Para determinar si el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina tiene ningún efecto sobre la activación de NF-kB, se evaluó la actividad de unión al ADN de NF-kB utilizando el ensayo de EMSA. En consonancia con los resultados de inmunotransferencia, emodina solo o combinado con gemcitabina disminución de la actividad de unión a ADN de NF-KB en el cáncer de páncreas ortotópicamente implantados con células Panc-1 (Fig. 9A, B).
(A) NF- la actividad de unión al ADN kappa B se determinó por la EMSA y el experimento supershift. La igualdad de carga de proteínas fue asegurada por inmunotransferencia 10 g de proteína nuclear con el anticuerpo anti-retinoblastoma. +, Control positivo; -, control negativo. Se presentan (B) de datos cuantificados. *,
P
. & Lt; 0,05
Efecto de emodina en los niveles de mRNA expresión de NF-kappa B, VEGF, MMP-2, MMP-9 y eNOS en el cáncer pancreático los tejidos detectado por RT-PCR
de acuerdo con los resultados de la inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western, la expresión de ARNm de NF-kappa B, VEGF, MMP-2, MMP-9 y eNOS en tejido de cáncer de páncreas eran arriba regulada en el grupo de gemcitabina, pero las reguladas en el grupo de emodina y el grupo de combinación en comparación con el grupo de control en los tejidos de cáncer de páncreas (
P
& lt; 0,05). (Fig. 10A, B)
(A) Los niveles de ARNm de NF-kappa B, VEGF, MMP-2, MMP-9 y eNOS en el tejido de cáncer de páncreas en diferentes grupos de tratamiento fueron detectados por RT-PCR. Se presentaron (B) de datos cuantificados. *,
P
. & Lt; 0,05
Discusión
De acuerdo con nuestras observaciones anteriores [8], el tratamiento de las células con emodina mejorado significativamente la inhibición de la célula crecimiento por gemcitabina, que se correlaciona bien con los resultados del análisis de apoptosis. Del mismo modo, encontramos que emodina inhibió el crecimiento de células de cáncer de páncreas
in vivo
. Aquí, por primera vez, se encontró que emodina inhibe la angiogénesis de cáncer de páncreas in vivo, downregulated la expresión de NF-kappa B y proteínas reguladas-kappa B NF con papeles en la inhibición de la angiogénesis (VEGF, MMP-2, MMP-9, y eNOS). Este estudio se centró en el efecto anti-angiogénesis de emodina
Hoteles en vivo y el posible mecanismo.
Se ha informado de que la gemcitabina induce la activación de NF-kB y posteriormente provoca resistencia a los medicamentos [ ,,,0],13]. De acuerdo con nuestras observaciones anteriores, el presente estudio mostró claramente que emodina inhibe la activación espontánea de NF-kappa B de una manera dependiente de la dosis en las células SW1990 y las células Panc-1, y abrogó la activación de NF-kappa B gemcitabina inducida en ambos tipos de Células. Además, se encontró que emodina solo o combinado con gemcitabina presentado efectos anti-tumorales en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas, como se evidencia por una disminución en el peso del tumor. Del mismo modo, la emodina solo o en combinación con gemcitabina ha demostrado tener actividad antitumoral potente en un modelo de tumor subcutáneo en nuestro estudio anterior [8].
Un paso crítico en la angiogénesis implica la proliferación local de células endoteliales. Hee-Jin Kwak et al. demostró que emodina efectivamente inhibe la angiogénesis VEGF-A inducida in vitro e in vivo [10]. Alexander D. Crawford et al. informado de que la formación de emodina la proliferación celular y de tubo endotelial de mamífero inhibida in vitro [14]. Y se ha informado de que emodina puede inhibir la angiogénesis asociada a tumores en carcinoma de colon humano
in vitro
[9]. Nuestro estudio demostró que la proliferación de la formación de cáncer derivado de EC y de los vasos sanguíneos de páncreas fue inhibida por emodina solo o combinado con gemcitabina. La activación constitutiva de NF-kB se observa en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas humano [15]. Estrategias dirigidas a la vía regulada NF-kappa B pueden ser útiles para mejorar los efectos de los agentes quimioterapéuticos tales como la gemcitabina en las células endoteliales derivadas de tumores [16]. Nuestro estudio sugiere que emodina puede inhibir la angiogénesis de CE derivados del cáncer de páncreas a través de la vía de señalización regulada NF-kB. Además, los resultados de las imágenes vasculares tumorales mostraron que la densidad vascular en el grupo de emodina y el grupo de combinación emodina /gemcitabina redujo significativamente en comparación con los grupos de control y gemcitabina. Además, en comparación con los grupos de control y gemcitabina, el tratamiento emodina y el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina redujo significativamente los niveles de expresión de CD31 y CD105. Nuestros resultados sugieren que emodina puede inhibir la angiogénesis del cáncer de páncreas ortotópicamente implantado.
Estudios anteriores han sugerido que NF-kappa B puede regular la expresión de varias proteínas asociadas con la angiogénesis, tales como MMP-2, MMP-9, VEGF y eNOS [12], [17], [18], [19]. Nuestro estudio anterior ha demostrado que emodina downregulated la activación y expresión de NF-kappa B en la implantación de células SW1990 inducida por cáncer de páncreas [20], el análisis de NF-KB de los tejidos tumorales ortotópico en este estudio mostró que emodina solo o combinado con gemcitabina suprimida NF- expresión kappa B y su actividad en los tejidos de cáncer de páncreas. También se encontró que emodina solo o en combinación con gemcitabina regulado por disminución de la expresión de genes regulados por NF-kB (VEGF, eNOS, MMP2 y MMP9), que están estrechamente relacionados con la angiogénesis.
MMP-2 y MMP-9 puede estar asociada con la angiogénesis del tumor [9], [17]. Se ha informado de que emodina puede inhibir la angiogénesis asociada a tumores a través de la supresión de MMP-9 expresión [9]. En este estudio, el análisis inmunohistoquímico demostró que emodina solo o combinado con gemcitabina downregulated la expresión de MMP-2 y MMP-9 en los tejidos de cáncer de páncreas ortotópico, mientras que la gemcitabina no tuvo ningún efecto sobre la expresión de MMP-2 y MMP-9. Estos resultados sugieren que emodina puede inhibir la angiogénesis de tejidos de cáncer pancreático a través de la supresión de la MMP-2 y MMP-9.
Como un factor regulador de la angiogénesis, el VEGF está estrechamente asociada con la angiogénesis [21] y la metástasis de cáncer de páncreas [22]. Como se informó por Aggarwal et al., Aumento de NF-KB dependiente de la expresión de VEGF puede promover la supervivencia de células tumorales y la angiogénesis vascular [23]. Un estudio reciente sugiere que emodina puede inhibir la expresión de VEGF en células de neuroblastoma humano [24]. En este estudio, se encontró que emodina solo o combinado con gemcitabina downregulated significativamente la expresión de VEGF en el cáncer de páncreas ortotópicamente implantado. Nuestros resultados sugieren que emodina puede inhibir la expresión del VEGF para suprimir la angiogénesis del cáncer de páncreas. Otros experimentos demostraron que emodina, gemcitabina, y su combinación no tuvo ningún efecto sobre la expresión de VEGFR, lo que indica que la inhibición de la angiogénesis por emodina en el cáncer de páncreas no se asoció con VEGFR.
eNOS estimula la liberación de NO que a su vez puede promover la proliferación de EPCs [25]. La inhibición de la eNOS en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) puede inhibir la formación de la proliferación y el tubo de las células endoteliales [10]. En este estudio, se encontró que emodina solo o combinado con gemctabine inhibió la expresión de eNOS en los tejidos de cáncer de páncreas ortotópico, lo que indica que la inhibición de la expresión de eNOS puede estar implicado en la inhibición de la angiogénesis tumoral por emodina. Otros experimentos demostraron que el tratamiento emodina y el tratamiento combinado de emodina y gemcitabina, inhibió la fosforilación de la eNOS, lo que indica que emodina puede inhibir significativamente la fosforilación de la eNOS gemcitabina inducida que está implicado en la migración de EC, la proliferación y la formación del tubo
in vitro
[26].
NF-kB está estrechamente asociada con la inhibición de la apoptosis no sólo, sino también la angiogénesis de tumores. Nuestro estudio indica por primera vez que NF-kappa B puede también desempeñar un papel importante en la inhibición de la angiogénesis por emodina en el cáncer pancreático
in vivo
, y el efecto aumentado de la gemcitabina en el cáncer de páncreas se puede lograr a través de emodina mediada downregulation de la expresión de NF-kappa B y las proteínas NF-kappa B-regulada con papeles en la inhibición de la angiogénesis (es decir, VEGF, MMP-2, MMP-9 y eNOS). Sin embargo, la forma en emodina disminuir la expresión de NF-kB está aún por estudiarse.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los protocolos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de Primera hospital afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang.
líneas celulares y
Las líneas celulares de cáncer de páncreas humano SW1990 y Panc-1 se adquirieron de la American Type Culture Collection Animales
. células epiteliales normales de páncreas humano (HPNE) (CHI INC Científica, Maynard, MA) fueron sembrados en nuestro laboratorio. Los ratones hembra atímicos BALB /c nu /nu (4-6 semanas de edad) se adquirieron de Shanghai Instituto del Cáncer de la implantación del tumor. Todos los animales se mantuvieron en un ambiente estéril dentro del Centro Experimental Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, de acuerdo con el Reglamento de Animales de Laboratorio del Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular de China (http://www.most.gov. cn /kytj /kytjzcwj /200411 /t20041108_32465.htm).
Reactivos
La emodina fue comprado a Sigma (St. Louis, EE.UU.), disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,2 mmol /L en stock y se almacena a -20 ° C. La concentración final de DMSO era & lt; 0,1%. Gemcitabina fue adquirido de Ely Lilly (Bad Homburg, Alemania) y se disolvió en solución salina estéril a 50 g /L en stock. RPMI-1640 y suero fetal bovino (FBS) se obtuvieron de Gibco BRL (Grand Island, NY, EE.UU.). kit de reactivos de la apoptosis celular (Anexina V-FITC y PI) se adquirió de Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, China). Recuento de células kit-8 (CCK-8) se adquirió de Beyotime Instituto de Biotecnología (Haimen, China). Flúor-18-fluorodesoxiglucosa marcada (
18F-FDG) fue proporcionado por la escuela de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang, China). Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes comerciales: anticuerpos anti-β-actina anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-VEGF, y fueron comprados a Epitomics (Burlingame, California, EE.UU.); anticuerpos anti-NF-kB, anti-CD31 y anti-CD105 se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.); anti-eNOS y anti-VEGFR (Flk-1) (C1158) anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz (Santa Cruz, EE.UU.); -ENOS anti-fosfo (Ser1177) fue adquirido de Señalización Celular (Beverly, MA, EE.UU.); anti-anticuerpo Ki-67 y el kit DAB se adquirieron de Zhongshan Bio-Tech Co., Ltd (Beijing, China). El reactivo de TRIzol se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). El rápido kit de purificación de ARN 200 se adquirió de Fastagen Biotech (Shanghai, China).
El aislamiento de células endoteliales microvasculares (ECS) de tejidos de cáncer de páncreas implantados.
tejidos de cáncer de páncreas implantados se cortaron en 1 bloques de tejido mm y se incubaron en 0,1% de colagenasa I en MEM a 37 ° C durante 2 h. Microvascular EC fueron aisladas de los bloques de tejido utilizando un kit de aislamiento de células endoteliales del grano de inmunoafinidad magnético (Dynal Biotech, Brown Deer, WI). Brevemente, Dynabeads M-450 y ovejas IgG anti-rata, junto con un anti-ratón de anticuerpo CD31 de rata monoclonal (30-l alícuota por tubo 5 ml) se incubaron en 1 ml de sobrenadante de tejido a 4 ° C durante la noche y después se lavaron tres veces con 10% de FBS-DMEM; 1 ml de suspensión de células se puso en el tubo que contiene las perlas lavadas. Después de la incubación con agitación ocasional a 4 ° C durante 30 min, se recuperaron las células de talón de ruedas, se lavaron y se digirieron entonces en 1 ml de tripsina /EDTA (GIBCO) para liberar las perlas. Las células libres de talón se centrifugaron en 10% de FBS-RPMI-1640 y después se resuspendieron en medios de cultivo 7 ml como se describe a continuación. El rendimiento de los EC vascular era & gt; 98%. La identidad de las células aisladas se confirmó por la formación de tubos in vitro en Matrigel y la tinción de cadherina VE, una exclusiva marcador CE.
Cell Cultura
HPNE, ECs, las células SW1990 y Panc -1 células se cultivaron en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con incubaron-calor 10% de SFB (Invitrogen, Nueva York, EE.UU.), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. Las células se pasaron a 70-80% de confluencia. células SW1990 luciferasa transfectadas se recogieron 70 a 80% de cultivos confluentes después de una breve exposición a 0,25% de tripsina suplementado con 0,2% de EDTA. La tripsinización se terminó con medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. Las células se lavaron una vez en medio libre de suero y se resuspendieron en PBS. Las suspensiones que consisten en células Panc-1, con & gt; 90% de viabilidad, se utilizaron para las inyecciones
Cell Tasa de supervivencia Detectado por CCK-8
HPNE, CH, células SW1990, y Panc. -1 células recogidas en fase exponencial se sembraron a una densidad inicial de 4 × 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos. A continuación, las células se dividieron en cuatro grupos con tratamiento diferente para las 72 h: El grupo control (DMSO al 0,1%), el grupo de gemcitabina (gemcitabina, 20 mmol /L), el grupo emodina (emodina, 40 mmol /L), y la combinación grupo (gemcitabina 20 mmol /L + emodina 40 mmol /L), con cinco pozos para cada grupo. Los pozos sin drogas pero 0,1% de DMSO se utilizaron como control. Una hora antes de que terminara la exposición, se añadió 0,01 ml de CCK-8 en cada pocillo.