Extracto
Antecedentes
La existencia de células madre del cáncer (CSC) o células madre, como el cáncer en una masa tumoral se cree que es responsable de la recurrencia del tumor debido a su intrínseca y extrínseca características de resistencia a fármacos. Por lo tanto, asesinato selectivo de células madre cancerosas sería una nueva estrategia para la prevención de la recurrencia y /o el tratamiento de tumores mediante la superación de resistencia a las drogas. Hemos desarrollado un nuevo sintético compuesto CDF, que mostró una mayor biodisponibilidad en los tejidos animales, tales como páncreas, y también indujo la inhibición del crecimiento celular y la apoptosis, que fue mediada por la inactivación de NF-kappa B, la COX-2, y VEGF en el cáncer pancreático ( las células PC).
Metodología /Principales conclusiones
En el presente estudio hemos demostrado, por primera vez, que la FCD podría inhibir significativamente la capacidad de formación de esferas (pancreatospheres) de las células PC compatibles con aumento de la desintegración de pancreatospheres, que se asoció con la atenuación de los marcadores CD44 y CSC (EpCAM), especialmente en (MIAPaCa-2) células PC gemcitabina resistentes que contienen alta proporción de células madre cancerosas en consonancia con el aumento de miR-21 y la disminución de miR-200. En un modelo de ratón con xenoinjerto de PC humano, el tratamiento CDF significativamente el crecimiento tumoral inhibido, que se asoció con una disminución de la actividad de ADN de NF-kB de unión, la COX-2, y miR-21 expresión, y el aumento de PTEN y la expresión de miR-200 en restos tumorales.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados sugieren fuertemente que la actividad antitumoral del CDF se asocia con la inhibición de la función CSC a través de la baja regulación de las vías de señalización asociadas-CSC. Por lo tanto, la FCD podría ser útil para la prevención de la recurrencia y /o el tratamiento de tumores PC con un mejor resultado del tratamiento en el futuro
Visto:. Bao B, Ali S, D Kong, Sarkar SH, Wang Z, Banerjee S, et al. (2011) la actividad antitumoral de un nuevo compuesto-CDF está mediado por la regulación de miR-21, miR-200, y PTEN en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10.1371 /journal.pone.0017850
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 13 de diciembre de 2010; Aceptado: 10 Febrero 2011; Publicado: 9 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Bao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Nacional del Cáncer Instituto, subvenciones del NIH 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1, y 5R01CA132794 (FH Sarkar). Agradecemos a Puschelberg Guido y fundaciones por su generosa contribución financiera. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas (CP) es una de las enfermedades malignas más letales con peor pronóstico, que está clasificada como la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Durante las últimas dos décadas, numerosos esfuerzos se han hecho para mejorar el tratamiento de los pacientes y la supervivencia de PC, pero el resultado ha sido decepcionante. Este decepcionante resultado se debe a muchos factores entre los que
de novo
resistencia (intrínseca) y adquiridas (extrínseca) resistencia a terapias convencionales (quimioterapia y radioterapia), incluyendo gemcitabina sola o en combinación con otros agentes citotóxicos o dirigidos . Nuevas pruebas sugieren que la resistencia de hecho, podría ser debido a la existencia enriquecida de células iniciadoras de tumores, también clasificados como células madre, como el cáncer (CSC) en una masa tumoral [2] - [6]. Las células madre cancerosas tienen la capacidad de auto-renovación y el potencial de regenerarse en todos los tipos de células diferenciadas que dan lugar a poblaciones de células tumorales heterogéneos en una masa tumoral, lo que contribuye a la agresividad del tumor [2] - [6]. Por lo tanto, el hecho de no eliminar estas células especiales se considera que es una de las causas subyacentes de la mala evolución del tratamiento con terapias convencionales, lo que sugiere que las estrategias terapéuticas nuevas y novedosas se deben desarrollar para el asesinato selectivo de células madre cancerosas resistentes a los medicamentos con el fin de erradicar el riesgo de la recurrencia del tumor para mejorar la supervivencia de los pacientes diagnosticados de CP.
en la búsqueda de nuevos agentes aún no tóxicos, la atención se ha centrado en los agentes naturales durante varios años. Uno de tales agentes es la curcumina (diferuloylmethane), que se deriva de la planta Curcuma longa (Linn) cultivadas en el sudeste de Asia tropical [7] - [9]. La curcumina se ha demostrado que inhibe el crecimiento de una variedad de células tumorales; Sin embargo, la escasa biodisponibilidad de la curcumina limita su aplicación en la clínica. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso análogo sintético de la curcumina, 3,4-difluoro-benzo-curcumina [lo nombramos como difluorado-curcumina o en fin CDF [10], [11]], que mostró una mayor biodisponibilidad en tejidos pancreáticos, y también inhibe el crecimiento celular, el ADN de unión a la actividad de NF-kB, Akt, COX-2, y la producción de PGE
2 y VEGF, y causaron la inducción de miR-200 y la inactivación de miR-21 en células PC [ ,,,0],12]. Dado que el miR-200 se asocia con la adquisición de transición epitelial a mesenquimal (EMT), que también se cree que está asociada con células madre cancerosas o células madre, como el cáncer, que aquí se investigaron los efectos de la CDF en función de CSC.
Aquí mostramos, por primera vez, que la FCD podría inactivar muchas funciones de células madre cancerosas, incluyendo la capacidad de auto-renovación como lo demuestra la inhibición de la formación de esferas (pancreatospheres) la capacidad de las células PC resistentes a los medicamentos, lo cual era consistente con la inactivación de CSC biomarcadores tales como CD44 y EpCAM. También demostramos la actividad anti-tumor de CDF solo y en combinación con gemcitabina, que era consistente con la inactivación de miR-21 y, por consiguiente aumento de la expresión de PTEN, la atenuación de la actividad de unión al ADN de la inhibición de NF-kappa B en la expresión de la COX -2, y la activación de la expresión de miR-200 en restos tumorales de un modelo de xenoinjerto de ratón de PC humano, todos los cuales proporcionan convencer
in vivo
actividad de CDF que es consistente con
in vitro
hallazgos.
resultados
líneas ASPC-1 y MIAPaCa-2 de células y sus clones fueron seleccionados para este estudio debido a su naturaleza relativamente resistente. Las características de CSC de estas líneas celulares usando Lin28B y Nanog marcadores de células madre 'por RT-PCR, y EpCAM y CD44 por Western blot mostraron un aumento en el nivel de expresión en las líneas celulares PC-GTR en comparación con sus líneas de células parentales (Figura 1) . Por lo tanto elegimos estos para probar nuestra hipótesis de que CDF es más eficaz que la curcumina incluso en líneas celulares resistentes y también su resistente clones-GTR.
Las características de los CAC se confirmaron además por la expresión de la proteína de EpCAM y CD44 ( C).
CDF impide fuertemente clonogenicidad y la invasión de las células PC en comparación con gemcitabina y curcumina
Hemos seleccionado a la concentración de 20 nmol /L de gemcitabina y 4 mmol /L de la curcumina o CDF para llevar a cabo el ensayo clonogénico después de nuestra publicación anterior [12]. Los resultados demostraron que hubo una reducción significativa en la clonogenicidad de las células AsPC-1 y MIAPaCa-2 tratados con curcumina y CDF, pero no con gemcitabina (Figura 2A). Sin embargo, el tratamiento CDF tenía una mucho mayor y significativa reducción en la formación de colonias en comparación con la curcumina. Las células-GTR-2 MiaPaCa ASPC-1-GTR y tenían una reducción del 80% de la clonogenicidad con el tratamiento de CDF, mientras que se observó sólo el 20-30% de reducción de la clonogenicidad con gemcitabina o tratamiento curcumina (Figura 2A). En general, el tratamiento CDF mostró una reducción significativa en la clonogenicidad de las células PC humanos, lo que sugiere la superioridad de la CDF.
fluorescencia de las células invadidas se leyó usando ULTRA lector de microplacas de múltiples funciones (TECAN) a longitudes de onda de excitación /emisión de 530 /590 nm. nivel basal de expresión ABCG2 muestra relativamente más alta expresión en líneas celulares resistentes a fármacos (C).
CDF o curcumina tratamiento disminuyó la migración celular y la invasión de PC. Los resultados mostraron que 4 mmol /L de la curcumina tenía una inhibición mínima de la invasión, mientras que la concentración similar de CDF mostró una inhibición significativa de la invasión (Figura 2B). El nivel basal de expresión ABCG2 se encontró en líneas celulares de sus padres (
de novo de drogas resistentes a las células); Sin embargo, el nivel de expresión de ABCG2 se incrementó aún más en medicamentos (resistentes a los fármacos adquirida) las líneas celulares resistentes (Figura 2C).
CDF viabilidad de las células PC inhibido humanos más que la curcumina y gemcitabina como evaluados por el ensayo MTT
Inicialmente ensayo de MTT se llevó a cabo para examinar el efecto de diferentes concentraciones de gemcitabina (1 a 50 nmol /L), y la curcumina o CDF (2-6 mmol /L) en la supervivencia celular después de 72 horas de tratamiento (datos no mostrado). Posteriormente, 4 mol /L de CDF o curcumina, y 20 nmol /L de gemcitabina se utiliza para tratar individualmente, así como en combinación con gemcitabina durante 72 h. Los resultados mostraron que el tratamiento CDF en combinación con gemcitabina causó una reducción notable de la supervivencia celular en las cuatro líneas celulares en comparación con la curcumina y el tratamiento de combinación de gemcitabina (Figura 3). Además, el análisis del tratamiento combinación de fármacos mostró que el índice de combinación después del tratamiento con CDF en combinación con gemcitabina fue de menos de 1,00 (Figura 3), lo que sugiere el efecto sinérgico de la combinación de CDF. En contraste, el índice de combinación con curcumina y gemcitabina fue de más de 1,00 (Figura 3), que muestra el efecto no sinérgico. En general, estos resultados sugieren que CDF causó una reducción mucho más significativa de la supervivencia celular en las células PC, en comparación con gemcitabina /curcumina solo o sus combinaciones en comparación con CDF y la combinación de gemcitabina.
ensayo de MTT se realizó en los cuatro celular líneas después de 72 horas de tratamiento con CDF, la curcumina, o su combinación con gemcitabina. control no tratado se le ha asignado un valor de 100%. El valor p se muestra representa la comparación entre un solo agente y sus combinaciones mediante el uso de la prueba t pareada. El índice de combinación (IC) & lt; 1 para el CDF y gemcitabina combinación indica sinergismo
CDF notable aumento de la desintegración de las células PC pancreatosphere
Para examinar el efecto de los tratamientos en el ámbito de formación. capacidad de las células PC (pancreatosphere) y desintegración de pancreatospheres, se realizó ensayo de desintegración de la esfera por 10 días para generar la formación de pancreatospheres, seguido de 5 días de tratamiento con fármacos. Los resultados muestran que hubo un notable aumento de la desintegración esfera por la curcumina y el tratamiento CDF, no por el tratamiento con gemcitabina (Figura 4). Sin embargo, se observó el mayor efecto sobre la desintegración en respuesta al tratamiento CDF (Figura 4), una vez más lo que sugiere que CDF es mucho más superior en la inhibición de las funciones de las células madre, como el cáncer.
Se calcularon los valores de P emparejados por el
t
prueba.
formación pancreatospheres CDF inhibida en las células PC
Para examinar el efecto de los fármacos sobre CSC capacidad de auto-renovación de las células PC, se realizó ensayo de formación de esfera de 1 semana y cuatro semanas (Figura 5A y B). Los resultados indicaron que CDF en combinación con gemcitabina formación pancreatospheres totalmente eliminado después de cuatro semanas de tratamiento en comparación con gemcitabina y la combinación de la curcumina en células PC incluso en células PC gemcitabina-resistente, lo que sugiere que CDF puede causar los pancreatospheres más sensible a la gemcitabina que la de la curcumina tratamiento, y podría ser útil para el asesinato selectivo de células madre cancerosas. La Figura 5C muestra el efecto de diferentes concentraciones de gemcitabina y CDF en 2
nd paso de pancreatospheres en pancreatospheres primarios pretratadas de células AsPC-1. tratamiento CDF inhibió notablemente 2
nd paso de pancreatospheres de una manera dependiente de la dosis. Además, las células CDF-pre-tratadas mostraron un efecto mayor que las células-pre-tratados no CDF.
Se observó una reducción significativa en pancreatospheres en células tratadas con CDF muestra por asterisco
CDF disminuyó CD44 y EpCAM expresión en células PC pancreatospheres de
Se examinó el efecto de los fármacos sobre los biomarcadores de CSC, CD44 y EpCAM en pancreatospheres de células ASPC-GTR-1 ASPC-1 y por microscopía confocal (Figura 6). Los resultados indican que CDF disminuyó CD44 y EpCAM expresión en pancreatospheres, lo que sugiere el efecto inhibidor de CDF en la formación de pancreatosphere puede estar asociada con la inhibición de CD44 y la expresión de EpCAM.
Expresión en pancreatospheres de AsPC-1 y AsPC- 1-GTR células se evaluó mediante microscopía confocal (ampliación X250).
CDF en combinación con gemcitabina inhibe el crecimiento del tumor de páncreas in vivo mucho más que la curcumina combinación
Hemos utilizado una inyección subcutánea modelo de tumor de xenoinjerto en el que el tumor se indujo mediante MIAPaCa-2 células en ratones CB17-SCID. tratamiento CDF en combinación con gemcitabina inhibió significativamente el crecimiento tumoral en MIAPaCa-2 tumores mucho más que la curcumina y la combinación de gemcitabina (Figura 7A), así como en comparación con cualquiera de los controles no tratados o aquellos tratados con un solo fármaco. Los ratones no mostraron ninguna pérdida de peso durante el período de tratamiento (30 días), lo que sugiere que estos tratamientos no tuvo efectos adversos importantes en animales.
La actividad anti-tumor y los cambios en el peso del tumor de cada grupo de animales ( UN). La flecha indica comenzando día del tratamiento. ADN NF-kB actividad de unión a tejidos tumorales; y NF-kB estudio de control de la competencia con el oligonucleótido no marcado NF-kappa B (B). borrones análisis de Western de la COX-2, PTEN y la expresión de β-actina en restos tumorales (C); miR-21, miR-200b y MIR-200c expresión en restos tumorales como se mide por tiempo real de RT-PCR (D). Los valores de p se calcularon por el emparejado
t
prueba.
CDF con gemcitabina redujo significativamente la activación de NF-kB
in vivo
NF activación kappa B se determinó de la CDF o curcumina, y /o tratada gemcitabina restos tumorales derivadas de células MIAPaCa-2 inducida por tumores como se muestra arriba. FCD y la curcumina como agente único regulados hacia abajo la activación de NF-kB, mientras que la gemcitabina activan nivel de NF-kB, que fue abrogada en el tratamiento de combinación con CDF. El tratamiento de combinación de CDF con gemcitabina mostró una disminución significativa en el nivel de NF-kappa B en comparación con la curcumina y el tratamiento de gemcitabina (Figura 7B), lo que sugiere que la inactivación de NF-kB podría ser uno de los mecanismos moleculares por los cuales CDF provoca su anti-tumor actividad contra tumores de PC.
efectos del MID en la expresión de proteínas
in vivo
La COX-2, PTEN, y la expresión de β-actina se determinó mediante Western blot. Se observó una baja regulación significativo en la expresión de COX-2 tanto en la combinación, pero el efecto fue más pronunciado en el grupo de combinación CDF. La expresión de la fosfatasa y la tensión homólogo (PTEN), se encontró un gen supresor de tumor a ser disminuido en células MIAPaCa-2; Sin embargo, la expresión de PTEN es regulada hasta cuando son tratados con CDF (Figura 7C). Estos resultados sugieren que CDF es mucho más eficaz que la curcumina. Desde PTEN es un objetivo conocido de miR-21, que ha sido informado de que hasta reguladas en PC [13] - [15], se evaluaron los niveles de expresión de miR-21 en los restos tumorales como se muestra a continuación
la modulación de la expresión de miR-21 y miR-200 de la familia
in vivo
Hemos determinado los niveles de expresión de miR-21, miR-200b y MIR-200c en MIAPaCa-2 tumores de tiempo real RT-PCR. La sobreexpresión de miR-21 se observó en MIAPaCa-2 tumores mientras que hemos encontrado una reducción significativa en la expresión de miR-21 en los tumores tratados con ya sea solo o en combinación con CDF y gemcitabina (Figura 7D) CDF. Se determinó aún más los niveles de expresión de los genes miARN-200b y MIR-200c en los tejidos tumorales que son conocidos reguladores de la EMT y resultó ser significativamente baja en MIAPaCa-2 células (Figura 7D). En contraste, se encontró que el tratamiento CDF con o sin combinación de gemcitabina mostró aumento de la expresión de ambos miR-200b, y miR-200c, pero el efecto de la curcumina o su combinación fue mínima, lo que sugiere la superioridad de la CDF en la supresión de la expresión del MIR -21, lo que resulta en la re-expresión de PTEN, y la re-expresión de miR-200, que podría ser responsable de la reversión de la EMT fenotipo en las células tratadas con CDF. En general, estos resultados sugieren que las características fenotípicas de MiaPaCa-2 tumores son consistentes con la población enriquecida de células madre cancerosas y las características de EMT, y estas células resistentes a los fármacos podrían morir ya sea por CDF solo o en combinación con gemcitabina.
Pancreatospheres el crecimiento del tumor mejorada
in vivo
en condiciones experimentales tradicionales, que normalmente se inyecta un millón de células para evaluar el crecimiento del tumor; sin embargo, para investigar el mayor potencial de crecimiento del tumor por pancreatospheres, inyectamos sólo 5.000 células en ratones como un estudio de prueba de concepto. El peso del tumor se incrementó notablemente en los días progresaron (Figura 8A). El nivel de miR-21 se incrementó entre los tumores implantados con un millón de células parentales en comparación con pancreatospheres (Figura 8B). El animal fue sacrificado después de 30 días debido a la carga tumoral, y los tumores brutos se muestra en la Figura 8C indicando tumores más grandes, así como metástasis en los ganglios linfáticos loco-regional mientras que los tumores derivados de células parentales no mostraron metástasis en un período de 30 días. Las células derivadas de tumores mostraron una inhibición significativa de pancreatospheres cuando se tratan con CDF (Figura 8D). En general, estos resultados sugieren que las células madre cancerosas (pancreatospheres) se puede cultivar en ratones CDF y podría ser útil para la muerte de estas células resistentes al fármaco (Figura. 8).
(A). 5.000 pancreatospheres se inocularon en ratones utilizando 01:01 matrigel, el crecimiento progresivo del tumor durante un período de 30 días. Se observó un aumento moderado en la expresión de miR-21 como se mide por tiempo real de RT-PCR en los tumores derivados de pancreatospheres en comparación con los tumores derivados de células de los padres mediante la inyección de un millón de células y el tumor se evaluó durante el mismo período de tiempo (B) . Fotografías que muestran el crecimiento del tumor, puntas de flecha a tumor y asterisco (*) se refiere a locorregional metástasis en ganglios linfáticos, mientras que no se encontró ninguna metástasis en los que se inyectaron un millón de células parentales (C). Las células tumorales cosechadas de los tumores derivados de pancreatospheres fueron tratados con CDF mostraron una inhibición significativa en la formación de pancreatospheres (D).
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que una análogo sintético de la curcumina, CDF, es significativamente más eficaz en comparación con la curcumina en la muerte de las células resistentes a gemcitabina cáncer de páncreas (PC), que consiste alta proporción de células con células madre del cáncer (CSC) o cáncer de células madre de características similares. La inhibición del crecimiento celular podría ser en parte debido a una mejor absorción celular, la retención y la reducción de la inactivación metabólica de las células PC por CDF, lo cual es consistente con nuestros hallazgos publicados sobre los datos farmacocinéticos celulares y animales [10], [11]. Nuestros informes anteriores indican que la CDF inhibe NF-kB y la actividad de la COX-2 en células PC
in vitro
[12]. Este sentido, confirman estas observaciones
in vivo
utilizando un modelo de ratón con xenoinjerto. Por lo tanto, la muerte de las células PC gemcitabina resistente por CDF está asociada con la inactivación de NF-kappa B y vía de señalización de la COX-2, que es muy importante, ya que estas vías se sabe que contribuye a la resistencia a fármacos de las células PC a agentes quimioterapéuticos [16] -. [18]
los CCC comprende sólo una muy pequeña proporción de células en una masa tumoral y posses la capacidad de auto-renovación y dar lugar a células tumorales diferenciadas [3] - [5], [19] . La teoría CSC tiene implicaciones clínicas fundamentales sobre todo porque CSC se ha identificado en muchos tejidos tumorales malignas como el cáncer de páncreas y que se consideran altamente resistente a la quimio-radiación que las células hija diferenciadas [3] - [5], [20]; Sin embargo, células madre cancerosas aisladas de tumores humanos son generalmente insuficientes para más estudios sobre el mecanismo. La existencia de células madre cancerosas proporciona una explicación para la observación clínica de que la regresión del tumor por sí sola no puede correlacionarse con la supervivencia de los pacientes [21] debido a la recurrencia del tumor, que es en parte debido a la presencia de células madre cancerosas. Por lo tanto, la orientación vías de auto-renovación y la muerte de células madre cancerosas podría proporcionar enfoque más específico para la eliminación de células que son la causa fundamental de la recurrencia del tumor. Un desafío potencial en este sentido es el desarrollo de terapias que afectan selectivamente células madre cancerosas sin dañar las células madre normales que pueden confiar en mecanismos similares para la auto-renovación. En este estudio, hemos demostrado que la CDF no sólo inhibe el crecimiento celular de las células PC, sino que también inhiben CSC capacidad de auto-renovación según la evaluación de la formación de esfera (pancreatospheres) ensayos. Por lo tanto, CDF podría tener un mayor potencial para inhibir el crecimiento del cáncer tal como se documenta por nuestro modelo de ratón con xenoinjerto de células PC resistentes gemcitabina, que parece estar mediada a través de la inhibición de la capacidad de auto-renovación CSC
.
Nuevas evidencias sugieren el papel de microRNA (miRNA) en muchos procesos biológicos [22] - [25]. Entre muchos miRNAs, miR-21, comúnmente considerado como un oncogén, se sobreexpresa en muchos tumores sólidos, incluyendo PC y se ha informado que se asocia con la progresión del tumor, la supervivencia pobre y la resistencia a fármacos [13], [14], [26 ], [27]. En nuestro informe anterior, hemos demostrado que la expresión de miR-21 es hasta reguladas en las células PC gemcitabina resistente y que su expresión puede ser significativamente las reguladas por el tratamiento CDF
in vitro
[12]. El aumento de la expresión de miR-21 se sabe que está asociado con la inactivación de PTEN, un gen supresor de tumor know, lo que resulta en la activación de la vía de señalización de PI3K /Akt /mTOR, lo que lleva a un crecimiento agresivo del tumor [15], [28]. En este estudio, se confirmó que el tratamiento podría CDF da como resultado la baja regulación de miR-21, lo que resulta en la sobre regulación de PTEN
in vivo
, lo que sugiere que la actividad antitumoral del CDF se asocia con sobre regulación de PTEN resultante de la inactivación de la expresión de miR-21.
a diferencia de miR-21, miR-200 de la familia es conocida como supresor de tumores y que son por lo general las reguladas en algunos tumores, incluyendo PC y la pérdida de la expresión de la familia de miR-200 contribuyen a la adquisición de EMT fenotipo y resistencia a los medicamentos. Down-regulación de miR-200 por la técnica de siRNA se ha demostrado que se asocia con EMT fenotipo mientras que re-expresión de miR-200 puede dar lugar a la reversión de EMT fenotipo [29], [30]. En nuestra publicación anterior [12], hemos demostrado que el tratamiento CDF podría volver a expresar el miR-200 en células PC. Aquí hemos demostrado, por primera vez, que la CDF puede regular hasta-miR-200b y MIR-200c en restos tumorales
in vivo
, en consonancia con significativamente mayor inhibición del crecimiento tumoral en el modelo de ratón con xenoinjerto cuando era CDF se utiliza en combinación con gemcitabina. Estos resultados sugieren que la actividad antitumoral de la CDF es mediada a través de la re-expresión de miR-200, que puede potencialmente da lugar a la reversión de la EMT fenotipo y también podría conducir a superar la resistencia a las drogas en PC.
En conclusión , CDF mostró efecto inhibitorio del crecimiento mucho más pronunciada, inhibe CSC auto-renovación consistente con la inactivación de los biomarcadores CSC (CD44 y EpCAM) en células PC especialmente en células PC-resistentes a gemcitabina en comparación con la curcumina. En xenoinjerto modelo de ratón de PC tumores humanos inducidos por MIAPaCa-2 células, CDF muestra actividad antitumoral mediante la regulación de la COX-2, PTEN, miR-21, miR-200, y NF-kB
in vivo
. Estos resultados sugieren fuertemente que la CDF podría ser un nuevo agente para el tratamiento de PC en PC general, pero gemcitabina resistente, en particular, atenuando el comportamiento de células madre cancerosas.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. Cualquier animal encontró poco saludable o enfermo fueron sacrificados sin demora. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Universidad Estatal de Wayne Los usuarios institucionales Comité de Cuidado de Animales (Número de Permiso: A-03.10.08).
cultivo celular, medicamentos y reactivos
líneas celulares de cáncer pancreático humano AsPC-1, y MIAPaCa-2 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Estas dos líneas de células ASPC-1 y MIAPaCa-2 se expusieron a 200 nmol /L de gemcitabina y 5 mmol /L de Tarceva (erlotinib) cada dos semanas durante unos 6 meses para crear gemcitabina y Tarceva (GTR) las líneas celulares resistentes, nombrados como AsPC-1-GTR y MIAPaCa-2-GTR, respectivamente. Como resultado, AsPC-1, AsPC-1-GTR, MIAPaCa-2, y MIAPaCa-2-GTR fueron escogidos para este estudio en base a sus sensibilidades diferenciales a gemcitabina. Todas las líneas celulares se han autenticado (Centro de Tecnología Genómica Aplicada de la Universidad Estatal de Wayne) el 13 de marzo de 2009 y se congelaron estas células autenticados para su uso posterior. El método utilizado para las pruebas era corto de perfiles de repetición en tándem utilizando el sistema PowerPlex 16 de Promega. Gemcitabina y curcumina fueron adquiridos de Eli Lilly (Indianapolis, IN) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), respectivamente. CDF se sintetizó como se describe en nuestra publicación anterior [10], [11]. La gemcitabina se disolvió en agua, mientras que CDF y la curcumina se disolvieron en DMSO con una concentración final de 0,1% DMSO en medio.
Anticuerpos
Los anticuerpos contra ABCG2, y PTEN se adquirieron de Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). El anticuerpo para la COX-2 y β-actina fue adquirido de Cayman Químicos (Ann Arbor, MI) y Sigma Chemicals (St. Louis, MO).
ensayo clonogénico
ensayo clonogénico se llevó a cabo para examinar el efecto de los fármacos sobre el crecimiento celular en células PC, como se describe anteriormente [12]. 5 × 10
4 células se sembraron en una placa de seis pocillos. Después de 72 h de exposición a 20 nmol /L de gemcitabina, 4 mol /L de CDF o curcumina, se tripsinizaron las células, y 1.000 células viables individuales se sembraron en 100 mm de placas de Petri. Las células se incubaron durante 10 a 12 días a 37 ° C en un 5% de CO
2/5% de O
2/90% N
2 incubadora. Las colonias se tiñeron con 2% de cristal violeta y se cuentan.
Invasion ensayo
La actividad invasiva de las células se ensayó mediante el uso de BD BioCoat Tumor Invasion sistema de ensayo (BD Biosciences, Bedford, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se describe anteriormente [31]. Brevemente 5 × 10
4 células se sembraron con medio libre de suero suplementado con curcumina o CDF en la cámara superior y pocillos de fondo se rellenaron con medio completo en el sistema. La fluorescencia se leyó usando lector de microplacas (TECAN) a 530/590 nm y se fotografiaron.
La supervivencia celular ensayo
ensayo MTT se realizó utilizando AsPC-1, AsPC-1-GTR, MIAPaCa-2, y MIAPaCa-2-GTR como se describe anteriormente [12] después de 72 h de tratamiento. índice de combinación y isobolograma para el tratamiento de combinación también se calcularon y se representaron usando el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) para determinar la sinergia basado en el método de Chou y Talalay [32].
formación de ensayo Esfera /desintegración
Las suspensiones de células individuales de células se sembraron en pocillos de adherentes ultra bajas de placa de 6 pocillos a 1.000 células /pocillo en medio de la formación de la esfera [33]. Después de 7 días, las esferas denominado como "pancreatospheres" se recogieron por centrifugación y se contaron [33]. Para el ensayo de desintegración esfera, 1.000 células /pocillo, se incubaron durante 10 días, después de 5 días de tratamiento de drogas, que examinó el efecto del tratamiento farmacológico de la desintegración de pancreatospheres como se describe anteriormente [33]. Los pancreatospheres se recogieron por centrifugación y se contaron bajo un microscopio.
microscopía confocal
suspensiones de células individuales de células AsPC-1 y AsPC-1-GTR se sembraron utilizando pozos adherentes ultra bajas de 6- así placa a 3.000 células /pocillo en medio de formación de esferas. Después de 7 días de tratamiento, los pancreatospheres se recogieron por centrifugación, se lavaron con 1 x PBS, y se fijaron con paraformaldehído al 3,7%. anticuerpos CD44 y EpCAM se utilizaron para la inmunotinción de ensayo, como se describe anteriormente [29]. Los pancreatospheres marcadas con CD44 o EpCAM fueron fotografiados por microscopía confocal (Leica TCS SP5) utilizando software LAS AF 1.2.0 Build 4316.
La extracción de proteínas y Western blot
Las proteínas se extrajeron de todos cuatro líneas celulares y también de los tejidos tumorales en animales como se ha descrito anteriormente [12]. Nivel relativo de ABCG2 se evaluó para las cuatro líneas celulares. Los efectos sobre la COX-2, PTEN y la expresión de β-actina fueron evaluados en los tejidos tumorales mediante análisis de transferencia Western. como se describe anteriormente [12].
Experimentos con Animales
El animal protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de la Universidad Estatal de Wayne, Detroit, MI. Ratones hembra CB17 SCID 4 semanas de edad se adquirieron de Taconic Farms (Germantown, NY) y alimentados con la dieta Lab 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). Pequeños fragmentos de la MIAPaCa-2 xenoinjerto se implantaron por vía subcutánea y bilateralmente en los ratones para los ensayos de drogas de eficacia. Una vez que los ratones desarrollaron tumores palpables, ellos fueron seleccionados al azar en los siguientes grupos de tratamiento (n = 5 /grupo): (1) control sin tratar; (2) CDF (5 mg /ratón /día), intragástrica una vez al día durante 12 días; (3) la curcumina (5 mg /ratón /día), intragástrica una vez al día durante 12 días; (4) gemcitabina (1 mg /ratón /día), intravenosa cada tercer día durante un total de tres dosis; (5) CDF y gemcitabina con las dosis indicadas anteriormente; (6) la curcumina y gemcitabina utilizando las dosis como se indicó anteriormente. medidas de los tumores y los cambios de peso se llevaron a cabo y el tejido se almacenó a -70 ° C para el ARN y la proteína de extracción.
movilidad electroforética Shift Ensayo de ensayo (EMSA) para evaluar la actividad de unión a ADN de NF-kappa B
proteínas nucleares se prepararon a partir de tejido de tumores usando un homogeneizador Dounce con 400 l de tampón de lisis enfriado en hielo extraídos como se describió anteriormente [34]. EMSA se realizó utilizando el sistema de infrarrojos Odyssey Imaging con NF-kB IRDye oligonucleótido marcado de LI-COR, Inc. (Lincoln, NE). se utilizó Diez mg del extracto de proteína nuclear como se describió anteriormente [34]. El estudio de control de la competencia NF-kB se llevó a cabo utilizando oligonucleótido no marcado consenso NF-kB. Las muestras se cargan y ejecutan a 30 mA durante 1 hora. El gel se escaneó usando Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR, Inc.).
TaqMan miARN en tiempo real de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
Para determinar la expresión de miRNAs (miARN-200b, 200c miR-y miR-21) en MiaPaCa-2 tumores, se utilizó el kit TaqMan MicroARN ensayo (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante. 5 ng de ARN total fue inverso transcrito y en tiempo real las reacciones de PCR se realizaron como se describe anteriormente [30], el uso de Smart Cycler II (Cepheid).