Extracto
El cáncer de páncreas es una de las causas relacionadas con el cáncer principal de muerte en el mundo occidental con una necesidad urgente de nuevas estrategias de tratamiento. Recientemente, hiperforina y nemorosone se han descrito como compuestos de plomo contra el cáncer prometedores. Mientras que la hiperforina ha sido investigado a fondo
in vitro
y
in vivo
,
in vivo
datos para nemorosone siguen desaparecidas. Por lo tanto, se investigó el potencial inhibidor del crecimiento de nemorosone en xenoinjertos de cáncer de páncreas en ratones NMRI nu /nu y se determinaron los parámetros farmacocinéticos básicos. xenoinjertos de tumores fueron tratados con nemorosone y gemcitabina, el tratamiento de referencia actual. Tumor secciones se sometieron a H & amp; E, así como la caspasa 3 y Ki-67 tinción. Nemorosone cinética plasmática se determinó por HPLC y espectrometría de masas. La inducción de CYP3A4 y de otras enzimas que metabolizan por nemorosone e hiperforina fue probado en hepatocitos primarios utilizando QRT-PCR. A una dosis de 50 mg /kg por día nemorosone, se observó un efecto significativo inhibidor del crecimiento en xenoinjertos de cáncer de páncreas. El compuesto fue bien tolerado y rápidamente absorbido en el torrente sanguíneo con una vida media de aproximadamente 30 min. Se detectaron diferentes metabolitos, posiblemente se asemeja a los productos de oxidación de CYP3A4-independiente. Se concluye que nemorosone es un compuesto de plomo anti-cáncer de potencial con una buena biodisponibilidad, pequeños efectos secundarios y los efectos inhibidores del crecimiento prometedores, representando así un compuesto valioso para un enfoque de terapia de combinación
Visto:. Lobo RJ, Hilger RA, Hoheisel JD, Werner J, Holtrup F (2013)
en Vivo
Actividad y farmacocinética de Nemorosone pancreático en xenoinjertos de cáncer. PLoS ONE 8 (9): e74555. doi: 10.1371 /journal.pone.0074555
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Julio, 2013; Aceptado: August 2, 2013; Publicado: 5 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wolf et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de 3 años desde la Escuela Internacional de Helmholtz para la investigación del cáncer de FH. La financiación del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación como parte del consorcio NGFN PaCaNet Se agradece. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de muchos avances en el campo de la investigación y el tratamiento del cáncer, el cáncer de páncreas sigue siendo uno de los tumores más difíciles, con su tasa de mortalidad de casi igualando la tasa de incidencia [1]. Esto se debe principalmente a las dificultades en el diagnóstico de cáncer de páncreas en una etapa temprana resecable y su pronunciado quimio-resistencia. Así, más del 80% de los pacientes presentan un tumor en estadio avanzado ya metástasis a los ganglios linfáticos regionales y el hígado [2]. Gemcitabina, el actual estándar de tratamiento para el cáncer de páncreas, sólo de forma moderada mejora el tiempo promedio de supervivencia entre los 5 y los 6 meses [3], subrayando así la necesidad de explorar nuevos compuestos terapéuticos.
policíclicos acylphloroglucinols polipreniladas (PPAPs) son una clase de compuestos con diversas actividades biológicas que van desde antidepresivo, anti-cáncer y anti-inflamatoria a la actividad anti-microbiana [4]. Entre ellos, hiperforina (Figura 1), un remedio de la hierba de San Juan (
Hypericum
perforatum
), ha ganado el interés público como un antidepresivo popular de origen natural con un nuevo mecanismo de acción [5]. También se ha demostrado que poseen propiedades anticancerígenas
in vitro
y
in vivo
[6-8]. Sin embargo, a través de la unión al receptor de pregnano X (PXR), hiperforina regula positivamente fuertemente la expresión de CYP3A4, un miembro de la familia del citocromo P450 involucrado en el metabolismo de xenobióticos [9]. Por lo tanto, si se combina con fármacos quimioterapéuticos que se metabolizan por el CYP3A4, hiperforina reduciría en gran medida la eficacia de un enfoque anticancerígeno potencial terapia de combinación, ya que acelera la metabolización del fármaco (s) se combina con.
Estrechamente estructuras químicas relacionadas de hiperforina (izquierda) y nemorosone (derecha), dos policíclicos acylphloroglucinols polipreniladas.
al estar estructuralmente relacionada con la hiperforina, pronunciadas propiedades contra el cáncer también se han demostrado
in vitro
para nemorosone (Figura 1) en líneas celulares de diversos orígenes, entre ellos el neuroblastoma y leucemia [10,11]. Análisis más detallados de su mecanismo de acción sobre las células de cáncer de páncreas mostraron una rápida elevación de los niveles de calcio cyctosolic y la despolarización de la membrana mitocondrial seguida por la activación de la apoptosis a través de una vía de respuesta al estrés conocida como la respuesta de la proteína desplegada [12]. Curiosamente, se encontró que las células normales diferenciadas a ser 10 veces menos sensibles a un tratamiento con nemorosone, abriendo así un potencial de ventana terapéutica para explorar también su actividad anti-cáncer
in vivo
.
En este estudio, hemos demostrado que, a diferencia de hiperforina, nemorosone no induce CYP3A4 e investigar su actividad biológica, así como la farmacocinética básicos
in vivo
en un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas. Se muestra que nemorosone se absorbe rápidamente en el torrente sanguíneo y es capaz de inhibir el crecimiento de tumores de xenoinjertos.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo en estrictamente de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal del consejo regional Karlsruhe, Alemania (número de permiso: G-204/09). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia xilacina /ketamina, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Implantación y el tratamiento de los tumores de xenoinjertos
De seis a ocho semanas de edad hembra atímicos NMRI nu /nu ratones desnudos (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania) fueron alojados en grupos de 4 a 6 en ventiladas de forma jaulas (IVC; TECHNIPLAST, Alemania) a 22 ° C con un ciclo de 12 h de luz /oscuridad y se deja que adaptarse a las condiciones de vivienda para una semanas antes de la implantación de tumores. se mantuvieron MIA-PaCa-2 células como se describe anteriormente [12], y 200 l de una suspensión de células (~ 2 × 10
6) se inyectó s.c. en el flanco derecho de cada ratón para establecer tumores de xenoinjertos subcutáneos. El volumen del tumor se controló periódicamente usando un calibrador digital, y los animales se organizaron al azar en grupos de tratamiento y de control una vez que el volumen medio del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm
3.
Nemorosone, purificada a partir de extractos de flores metanólicos como se informó anteriormente [ ,,,0],12], se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 50 mg /ml, y el hidrocloruro de gemcitabina (Eli Lilly, Alemania) se disolvió en solución de NaCl al 0,9%. Las soluciones para inyección se esterilizó por filtración y se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) con 0,3 ml jeringas de insulina (Becton Dickinson, Alemania) después de la esterilización del lugar de inyección. El peso corporal se controló diariamente antes de la i.p. inyección. 1 l /se inyectó g de peso corporal para lograr una concentración final de 50 y 120 mg /kg para nemorosone y gemcitabina, respectivamente. Nemorosone se inyecta una vez al día, mientras que para la gemcitabina se utilizó el programa de tratamiento estándar de cada tres días durante cuatro ciclos [13].
tinción inmunohistoquímica de tumores de xenoinjertos
Un día después del último tratamiento, los ratones fueron sacrificados por dislocación tumores fueron resecados y xenoinjertos de cuello uterino, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Los tumores se montan en un criomicrotomo (Leica, Alemania) a -25 ° C y 5 micras rodajas se generan a partir de los márgenes y centros de tumor a ser transferido a portaobjetos de vidrio
Para hematoxilina y eosina (H & amp; E). Tinción , las secciones del tumor se fijaron durante 5 s en acetona a -20 ° C, se secan y se tiñeron en hematoxilina (Carl Roth, Alemania) durante 15 s y ácida 1,5% eosina en EtOH al 96% (Merck, Alemania) durante 4 s. Después de la deshidratación por incubación posterior en 70%, 96% y 2 x 100% EtOH, la tinción se fijó en solución RotiClear (Carl Roth, Alemania) y cubreobjetos se montaron en medio de montaje primordial (DAKO, EE.UU.).
Para la tinción inmunohistoquímica con Ki-67 y activa la caspasa 3 anticuerpos, las secciones se bloquearon con 3% de peroxidasa en metanol después de la fijación en acetona fría y lavado en sline tamponada con Tris (TBS) suplementado con 0,1% (w /v) de albúmina de suero bovino (BSA). Después de otra etapa de lavado, las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C en 1: 100 diluciones de conejo anti-humana Ki-67 o activa la caspasa 3 anticuerpos (DAKO, EE.UU.) en TBS /0,1% BSA. Los portaobjetos se lavaron en TBS /0,1% de BSA suplementado con 0,1% (v /v) de Tween-20 y posteriormente en TBS /0,1% BSA antes de la adición de peroxidasa de rábano (HRP) conjugada de cabra anti-IgG de conejo secundaria de anticuerpos (DAKO , EE.UU.) durante 45 min a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se tiñeron con cromógeno líquido 3,3 'diaminobencidina (DAB) diluido 1: 500 en tampón de sustrato (DAKO, EE.UU.). El desarrollo del color se controló microscópicamente y se detuvo en DH
2O. Las secciones se counterstained en hematoxilina, se deshidrataron y se montaron como se ha mencionado anteriormente.
Análisis de farmacocinética nemorosone
50 mg /kg i.p. nemorosone se administraron y los ratones fueron anestesiados con 7 mg /kg de xilazina y 100 mg /kg de ketamina 5, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 min después de la aplicación de nemorosone. Se extrajo sangre en jeringas heparinizadas por puntuacion corazón y, posteriormente, se centrifugó durante 10 min a 16.000 x g para preparar plasma. Nemorosone se extrajo a partir de plasma mediante la adición de 400 l de acetonitrilo (ACN) al plasma 100 l y centrifugación a 21.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se transfirió a un nuevo vial y se concentró en un concentrador de vacío. El sedimento resultante se disolvió en disolvente para cromatografía líquida de alta presión (HPLC) (50% H
2O, 30% MeOH, 20% ACN). Se inyectaron 10 l de cada muestra para análisis en un sistema de HPLC Waters 2690 (Waters, Alemania) equipado con una PDA 996 y un detector de ZQ2000 ESI-MS (Waters, Alemania). La separación se realizó usando una columna C18 de fase inversa simetría (5 micras de tamaño de poro, 4,2 x 250 mm; Waters, Alemania) y una velocidad de flujo constante de 1 ml /min usando un gradiente de disolvente. Se detectó la absorbancia a 303 nm Nemorosone.
área del pico en el cromatograma Nemorosone se cuantificó con la ayuda de una curva de calibración (Figura S3) derivado de muestras de plasma humano de pinchos con concentraciones definidas de nemorosone (10 ng /ml a 100 mg /ml). Los cromatogramas de HPLC se analizaron usando el software Empower 2, y la cinética de concentración en plasma después de nemorosone i.p. la inyección se ajustaron utilizando TopFit 2.0 [14] bajo el supuesto de una disposición de dos compartimento después de la absorción de un solo segmento.
Análisis de los cambios de expresión de enzimas que metabolizan en hepatocitos humanos primarios
Acerca de 7,5 × 10
5 hepatocitos humanos primarios (Zen-Bio, Carolina del Norte, EE.UU.) se sembraron en cada pocillo de una colágeno I recubierto con placa de cultivo celular de 12 pocillos en medio de baño (Zen-Bio, Carolina del Norte, EE.UU.) y se dejó unieran durante 10 h. medio en placa se intercambió con medio de mantenimiento (Zen-Bio, NC, EE.UU.) y las células fueron cultivadas a 80% de confluencia antes de la incubación con 0,5 y 1 nemorosone M y hiperforina diciclohexilamonio sal (Sigma Aldrich, Alemania) o 10 mM rifampicina (Sigma Aldrich , Alemania) durante 48 h. Las células fueron cosechadas por tripsinización y el ARN total se aisló con un kit RNeasy Mini (Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El ARN se sometió a análisis cuantitativos de PCR en tiempo real utilizando el kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR (Qiagen, Alemania) y cebadores Quantitect (Qiagen, Alemania) como anteriormente [12].
Las pruebas estadísticas descritas
Todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado a menos que se indique lo contrario. Para todos los experimentos, se utilizó la prueba t de Student (en SigmaPlot 10.0) para el análisis de la importancia de la diferencia entre dos grupos.
Resultados
Nemorosone no induce la expresión de CYP3A4 en hepatocitos humanos primarios
metabolización es una parte importante de las propiedades farmacocinéticas de un medicamento. La mayoría de los xenobióticos son metabolizados por la familia del citocromo P450 (CYP) en el hígado después de ser detectado por los receptores nucleares [15-17]. Al ser estructuralmente muy similar a nemorosone, hiperforina (Figura 1) se ha demostrado para inducir la expresión CYP3A4 mediante la unión del receptor nuclear de pregnano X (PXR) y, por tanto, un metabolismo más rápido de fármacos co-administrado con hiperforina [9,18]. Con el fin de probar si también nemorosone es detectado por el PXR e induce la expresión de CYP3A4, así como otras importantes enzimas metabolizadoras de fármacos, los hepatocitos humanos primarios se cultivaron en presencia de nemorosone, hiperforina y rifampicina, un fármaco conocido para inducir la expresión CYP3A4 por la unión al receptor PXR (control positivo). Después de 48 horas de incubación, se extrajo el ARN de los hepatocitos y se sometió a análisis de QRT-PCR para evaluar la expresión de enzimas seleccionadas.
hepatocitos humanos primarios se trataron con las concentraciones indicadas de rifampicina, hiperforina, nemorosone o vehículo solamente. El ARN se extrajo después de 48 h y se sometió a análisis de QRT-PCR para detectar los cambios de expresión de genes seleccionados que participan en el metabolismo de fármacos. Expresión valores son en relación con el control del vehículo y representan la media ± SD de las mediciones por triplicado.
Figura 2 muestra que el tratamiento de los hepatocitos humanos con hiperforina y rifampicina dio lugar a una regulación significativa de
CYP3A4
la expresión génica, de 15 a 20 veces en comparación con el control del vehículo. En contraste con esto, el tratamiento con 1 mM nemorosone sólo se indujo
CYP3A4
expresión 3 veces, mientras que casi no hubo inducción tras el tratamiento con 0,5 M nemorosone. tratamiento hiperforina también ligeramente hasta reguladas
CYP1A2
,
CYP1B1
y
CYP2B6
expresión, pero no hubo ningún cambio detectable para la otra prueba de enzimas que metabolizan como aldehído deshidrogenasa 1A1 (ALDH1A1 ), epóxido hidrolasa 1 (EPHX1) o glutatión S-transferasa A2 (GSTA2). Por lo tanto, puede ser la hipótesis a partir de estos datos, que la hiperforina se metaboliza principalmente por CYP3A4 después de ser detectada por el PXR. A pesar de ser estructuralmente similar a la hiperforina, no parece nemorosone de obligar a la PXR y, por tanto, enzimas que metabolizan solamente se inducen débilmente nemorosone representación potencialmente útil en un enfoque de terapia de combinación anti-cáncer.
Nemorosone inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos in vivo
Figura 3 muestra que la inyección diaria de 50 mg nemorosone /kg dio como resultado una supresión significativa y completa del crecimiento del tumor en comparación con el promedio de los tumores de control que aumentaron de 5 veces en volumen. Un efecto similar se observó en el grupo de control que recibió 120 mg /kg de gemcitabina. Al mismo tiempo, el tratamiento con nemorosone demostró una buena tolerabilidad, ya que el peso corporal se mantuvo estable durante el período de tratamiento de 28 días (Figura S1). Sin embargo, hay que señalar que los animales que recibieron nemorosone comenzaron a hiperventilar poco después de la inyección. La respiración normal se restableció de nuevo 5-10 minutos después de la inyección i.p. aplicación.
Para examinar los efectos histológicos de tratamiento nemorosone, los animales fueron sacrificados después del período de tratamiento y se extirparon los tumores. Se tratan y después se tiñó el tejido de control para los marcadores de apoptosis y proliferación.
diferencias histológicas entre los tratados y los tumores de control eran visibles en H & amp; E-manchado secciones del tumor (Figura 4). Mientras que los tumores de control mostraron una distribución homogénea de células viables, las secciones de los tumores tratados con nemorosone demostraron grandes áreas de células necróticas o tarde-apoptóticos caracterizadas por tinción eosina solamente. La ausencia de tinción con hematoxilina en estas áreas indica cariolisis. La tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo dirigido contra la caspasa 3 regiones verificadas activos de apoptosis excesiva (células de color marrón oscuro), mientras que las secciones de control exhibieron un cierto fondo apoptosis solamente (Figura 4C y D). En las zonas que carecen de células de caspasa-positivo, se encontró que el número de células que expresan el marcador de proliferación Ki-67 a reducirse en las secciones de tumores nemorosone tratados (Figura 4F). En contraste con esto, una distribución homogénea de las células en proliferación que se caracterizan por una tinción de color marrón oscuro fue visible en las secciones de control.
En resumen, el tratamiento de los tumores nemorosone MIA-PaCa-2 xenoinjerto
in vivo
fue demostrado para reducir el número de células en proliferación e inducir la apoptosis, lo que conduce a una reducción de la masa tumoral se caracteriza por grandes regiones de morir las células tumorales.
el análisis farmacocinético revela una rápida absorción y metabolización de nemorosone
Absorción y metabolización de nemorosone
in vivo
se evaluó mediante la retirada de la sangre antes y en diferentes puntos de tiempo después de ip inyección de 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone, así como los posibles metabolitos se extrajeron de plasma de ratón, y la concentración de plasma se analizaron para cada punto de tiempo por cromatografía líquida de alta presión reversedphase (RP-HPLC; detección a 303 nm)
Los ratones se trataron con i.p. diaria. inyecciones de 50 mg /kg nemorosone, única o 120 mg kg gemcitabina /en el tiempo indicado puntos (puntos verdes) del vehículo. El volumen del tumor se midió 2-3 veces por semana utilizando un calibrador digital. Los valores representan la media ± SD de 8 animales por grupo
* p & lt.; 0,05, ** p & lt; 0,01 (en comparación con el control del vehículo).
Cinco minutos después de la inyección i.p. aplicaciones, aproximadamente 40 mg /ml (80 mM) nemorosone se detectaron en plasma de ratón, que señala hacia una absorción muy rápida en el torrente sanguíneo (Figura 5A). En el mismo punto de tiempo, se encontraron 7 picos adicionales se asemejan a los posibles metabolitos en el cromatograma HPLC (Figura 5A, la Figura S2). Sin embargo, la concentración plasmática de los posibles metabolitos (M01-M09) se calculó que era de 20 a 200 veces menor que la de nemorosone. Durante el tiempo observado de 120 min, la concentración plasmática disminuyó nemorosone logarítmicamente de 40 a 2,7 g /ml con una vida media de aproximadamente 30 min. Farmacocinética de nemorosone después por vía intraperitoneal Se encontraron aplicación a ser mejor descrito por un modelo de distribución de dos compartimientos produciendo una línea bifásica en el gráfico log-escala en la figura 5B. De acuerdo con este modelo, nemorosone se absorbe rápidamente y se distribuye en la corriente sanguínea dentro de la primera 10 min después de la inyección. 20 min después de la aplicación, la eliminación parece ser el proceso predominante que se caracteriza por la línea ajustada recta. Sin embargo, hay que señalar, que los procesos antes del punto de tiempo de 5 min (absorción y distribución) se asumieron y requieren una mayor confirmación en un estudio más detallado. Por lo tanto, la concentración máxima dentro de los primeros minutos podría ser mucho mayor (~ 100 g /ml)
Las secciones de 5 micras de nemorosone-tratados y los tumores de control se tiñeron con hematoxilina-eosina (H & amp;. E; A y B) o inmunohistoquímicamente analizado con anticuerpos dirigidos contra activa la caspasa 3 (C y D) o Ki-67 (e y F). Los tumores tratados mostraron una reducción de la masa tumoral debido a la apoptosis /necrosis (flechas negras) y un menor número de células proliferantes en comparación con el control (células de color marrón oscuro).
Las muestras de plasma fueron tomadas en pre puntos de tiempo definidos después de ip aplicación de 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone y sus metabolitos se cuantificaron por RP-HPLC con la ayuda de una curva de calibración (Figura S3). concentración (A) de plasma de nemorosone (línea verde superior) y sus posibles metabolitos (M01 a M09). (B) Farmacocinética de nemorosone se describe mejor mediante un modelo de dos compartimientos con una vida media de 30 minutos.
Identidad de nemorosone fue confirmado por un detector de espectrometría de masas ESI se presentan picos de moléculas de protonada nemorosone y sus sales de sodio y potasio (figura S4). Además, se encontró que la masa de los picos de moléculas de algunos metabolitos que ser incrementado en 16 u, lo que sugiere que la oxidación de nemorosone podría ser uno de los pasos principales de metabolización. Sin embargo, debido a la baja resolución del detector ESI-MS, la estructura de metabolitos nemorosone podría no ser caracterizado en detalle.
Discusión
hiperforina y nemorosone son algunos de los miembros mejor estudiados de la diversa clase de policíclico polipreniladas acylphloroglucinols y ambos se consideran compuestos de plomo para el desarrollo de terapias contra el cáncer [4,6,12,19]. Sin embargo, hasta ahora la actividad anticancerígena
in vivo
sólo se ha demostrado para hiperforina pero no para nemorosone [6]. Por lo tanto, este estudio piloto para evaluar la actividad de nemorosone contra los tumores de xenoinjertos de cáncer de páncreas
in vivo
, así como la identificación de los parámetros farmacocinéticos básicos como la cinética de absorción y metabolización.
Nuestros resultados indican que nemorosone potentemente inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas
in vivo
y parece ser aún más eficaz que el actual estándar de cuidado de gemcitabina (Figura 3). Aunque la dosis nemorosone administrada de 50 mg /kg por día fue bien tolerada durante el período de tratamiento, se observó la hiperventilación directamente después de la aplicación de nemorosone que indica alguna actividad sistémica de este compuesto directamente después de la absorción en el torrente sanguíneo. Similares observaciones fueron hechas por humulone, un compuesto relacionado estructuralmente aislado a partir de lúpulo, después de la inyección intravenosa en los gatos [20]. Esto indica propiedades farmacodinámicas comparables que podrían ser debido a la acción de estos compuestos sobre la homeostasis del calcio en los músculos. Esta hipótesis está apoyada por la perturbación nemorosone inducida instantánea de la homeostasis del calcio celular observada
in vitro
[12]
Efectos del tratamiento nemorosone sobre los tumores de xenoinjertos fueron confirmados por H & amp;. E tinción de tejido secciones, así como inmunohistoquímicamente mediante tinción de caspasa activa 3 y el marcador de proliferación Ki-67. Nemorosone tratados con MIA-Paca-2 tumores exhibieron más necrótico y /o regiones de apoptosis, que se asocian con una elevada actividad de caspasa 3 y un menor número de células proliferantes que expresan Ki-67, consistente con los resultados obtenidos en MIA-Paca-2 células
in vitro
[12].
La medición de la cinética plasmática después de ip inyección de 50 mg /kg nemorosone confirmado la biodisponibilidad y la absorción del compuesto en el torrente sanguíneo (Figura 5). Cinco minutos después de la inyección, se encontró que la concentración plasmática nemorosone a ser de 40 mg /ml (80 mM) con eliminación logarítmica dominando 20 min después de la inyección y nemorosone demostrando una vida media en plasma de aproximadamente 30 min. Los valores medidos para la cinética de plasma fueron más aptos asumiendo un modelo de dos compartimentos disposición como también se observó en un estudio farmacocinético de la concentración plasmática hiperforina tras la administración oral [21,22]. la concentración plasmática máxima calculada de nemorosone era ~ 100 mM. Por lo tanto, teniendo en cuenta la dosis alta durante la primera 5-10 min después de la aplicación, la hiperventilación aguda observado puede explicarse por nemorosone reversiblemente interferir con las células sanas entre la concentración plasmática máxima y el inicio de la fase de eliminación de aproximadamente 10 minutos más tarde.
en total, se detectaron 9 posibles metabolitos en plasma de ratón, la mayoría de ellos ya estaban presentes en 5 minutos después de ip de inyección (Figuras 5 y S2). Esto apunta hacia una rápida metabolización de nemorosone, consistente con la vida media calculada de tan sólo 30 min. Desafortunadamente, la estructura de los metabolitos no se pudo obtener debido a la baja resolución del detector ESI-MS. Sin embargo, considerando el hecho de que los tiempos de retención observados en el cromatograma RP-HPLC son más bajos para todos los metabolitos en comparación con nemorosone, los procesos de oxidación o hidroxilación se puede suponer. Esta hipótesis se ve apoyada por el hecho de que, en comparación con nemorosone, la masa de los metabolitos seleccionados se incrementa en un 16 u, la masa molecular de oxígeno (Figura S4). Para obtener información estructural detallada sobre los metabolitos, un sistema LC /ESI-MS con una resolución más alta o un enfoque de preparación para el análisis de RMN tendrá que ser establecida. se han aplicado ambos métodos para hiperforina metabolizado en los sistemas microsomales de hígado de rata y dio como resultado la identificación de cuatro metabolitos de hiperforina, cada hidroxilado en el grupo metileno terminal de de una de las cadenas laterales de cuatro prenil [23]. Los autores especularon que dos isoformas del citocromo P450 de rata ortólogo de CYP3A4 humana eran principalmente involucrada en la metabolización de hiperforina. Esto es consistente con el hecho de que la hiperforina induce la expresión de
CYP3A4 través
unión al receptor de pregnano X (PXR) [9,24].
CYP3A4
expresión también se encontró que era fuertemente inducido por la hiperforina y la rifampicina, una sustancia conocida para activar PXR, tras el tratamiento de hepatocitos primarios humanos en este estudio (Figura 2). Curiosamente, nemorosone era sólo moderadamente eficaces en la inducción de
CYP3A4
expresión: La incubación de los hepatocitos con 1 M nemorosone sólo dio lugar a un aumento de 3 veces de
CYP3A4
ARNm en comparación con un aumento de 15 veces en incubación con hiperforina 1 M. Este resultado es sorprendente teniendo en cuenta la cavidad de unión a ligando altamente flexible de la PXR que se ha demostrado hiperforina a perfectamente bind [24,25]. Por lo tanto, dada la estrecha relación estructural con hiperforina, la PXR se debe esperar que también se unen e inducir
CYP3A4
expresión en concentraciones equimolares nemorosone. Esto no parece ser el caso, haciendo así una mayor concentración de nemorosone para el tratamiento del cáncer preferibles a las de hiperforina para los que se han reportado múltiples interacciones con otros medicamentos relacionados con la inducción de CYP3A4 [9,18]. Teniendo en cuenta el hecho de que una expresión elevada PXR también se ha observado en diversas células pancreáticas [26], el tratamiento de cáncer de páncreas con un enfoque de la terapia de combinación es más probable que tenga éxito con nemorosone en lugar de hiperforina.
En conclusión, nuestro estudio demuestra un efecto inhibidor del crecimiento significativo de nemorosone en xenoinjertos de cáncer de páncreas con una buena compatibilidad. Análisis básico farmacocinético sugiere, que nemorosone es rápidamente absorbido y metabolizado por oxidación de una manera independiente de la CYP3A4. Esto hace nemorosone un compuesto de plomo muy prometedora para terapias de combinación. Por lo tanto, se deben realizar estudios más detallados sobre modelos de xenoinjertos ortotópico y análisis farmacocinéticos de una resolución más alta.
Apoyo a la Información
Figura S1.
El peso corporal de los ratones tratados y de control. El peso corporal de los ratones tratados y de control se determinó rutinariamente en una base diaria antes de la i.p. inyección. Los valores representan la media ± SD de 8 animales por grupo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s001 gratis (TIF)
figura S2. cromatogramas de HPLC de
nemorosone y sus metabolitos detectados en plasma. Superposición de cromatogramas de HPLC seleccionados (detección a 303 nm) de ratón (verde) y (azul) muestras de plasma humano, así como plasma humano sobrecargadas con 100 nemorosone ng /ml (rojo) y plasma de ratón 5 min después de i.p. se muestra la aplicación de nemorosone (negro)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
fila estándar de plasma humano se trataron con concentraciones crecientes nemorosone. Una línea de calibración para nemorosone se disparó en muestras de plasma humano se calculó y se ejecutan en paralelo a las muestras extraídas de plasma de ratón para permitir la cuantificación de nemorosone
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s003 gratis (TIF)
Figura S4.
ESI-MS espectros de nemorosone y metabolitos seleccionados. ESI-MS espectros se registraron para cada pico, y se muestran los espectros de nemorosone, así como para los metabolitos M01, M06 y M08. Los picos de iones molécula de nemorosone protonada (m /z = 503,2), así como sus sales de sodio (m /z = 525,2) y potasio (m /z = 541.1) sales están marcados con flechas negras. Potencialmente oxidado nemorosone de sodio (m /z = 541,1) y potasio (m /z = 557,2) sales están marcados con flechas de color gris
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074555.s004 gratis (TIF)
Reconocimientos
los autores agradecen al Fondo para el DKFZ animales de Laboratorio y Sven Rüffer para la ayuda técnica durante el cultivo celular y de los animales de trabajo, así como el Dr. Shereen Keleg, Centro Europeo de páncreas, Heidelberg, por su ayuda con tinción inmunohistoquímica.