Extracto
La endostatina es un importante inhibidor endógeno de la neovascularización que ha sido ampliamente utilizado en la terapia anti-angiogénesis para el tratamiento de cáncer. Sin embargo, su aplicación clínica se ve obstaculizado en gran medida por su baja eficacia. células madre mesenquimales derivadas de placenta humanos (hpMSCs) son células particularmente atractivos para uso clínico en terapias basadas en células. En el presente estudio, hpMSCs fueron aislados y caracterizados. A continuación, evaluaron el tumor de orientación propiedades y efectos antitumorales de hpMSCs como vehículos de suministro de genes para la terapia del cáncer de ovario. Nosotros diseñamos de manera eficiente para entregar hpMSCs endostatina a través de la transducción adenoviral mediada por Lipofectamine 2000. La capacidad tropismo de los hpMSCs ingeniería hacia las células tumorales después fue confirmado por
in vitro
ensayos de migración y
in vivo fotos: por vía intraperitoneal inyección de hpMSCs en ratones desnudos. Los hpMSCs expresan el gen de la endostatina humana demostraron homing preferencial al sitio del tumor y disminuyó significativamente el volumen del tumor, sin efectos tóxicos sistémicos aparentes. Estas observaciones se asociaron con los brotes de sangre disminuyó significativamente y la proliferación de células tumorales, así como un índice de apoptosis tumor aumentado dramáticamente. Estos resultados sugieren que hpMSCs son potencialmente un vehículo de administración eficaz para genes terapéuticos para el tratamiento de cáncer de ovario
Visto:. Zheng L, Zhang D, Chen X, Yang L, Wei Y, Zhao X (2012) antitumoral actividades de células madre mesenquimales derivadas-placenta humana que expresa endostatina en cáncer de ovario. PLoS ONE 7 (7): e39119. doi: 10.1371 /journal.pone.0039119
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: December 24, 2011; Aceptado: 16-may de 2012; Publicado: 24 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por 973 Programa Nacional de becas de China (2011CB910703). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es uno de los tumores malignos ginecológicos más comunes, y sigue siendo la cuarta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres [1]. A pesar de los muchos avances en el tratamiento quirúrgico, quimioterapia y radioterapia en los últimos decenios, el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario avanzado sigue siendo pobre, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 30% de los pacientes con metástasis a distancia. Esta baja tasa de supervivencia se debe principalmente a la recurrencia del tumor y la eventual aparición de [2] de resistencia a fármacos. En consecuencia, se necesitan urgentemente nuevos enfoques terapéuticos para cambiar las perspectivas futuras de los pacientes con cáncer de ovario.
La angiogénesis juega un papel crucial en los procesos biológicos y patológicos del cáncer. Múltiples líneas de evidencia han demostrado que el crecimiento y la progresión de la mayoría de los cánceres sólidos dependen de la angiogénesis y la angiogénesis tumoral es altamente orquestados por un equilibrio entre reguladores positivos y negativos [3], [4]. Hasta la fecha, se han identificado un gran número de agentes anti-angiogénesis. La endostatina, un fragmento carboxilo terminal de 20 kDa de la cadena α1 de colágeno XVIII que inhibe la migración de células endoteliales, proliferación, e induce la apoptosis de las células endoteliales vasculares, se ha considerado como el más potente inhibidor de la angiogénesis. Está bien establecido que la endostatina puede inhibir eficazmente varios tumores sólidos, tales como pequeño Lewis carcinoma de células de pulmón [5], cáncer de colon [6], cáncer de mama humano [7], carcinoma hepatocelular [8], [9], cáncer de ovario [ ,,,0],10], [11], y el melanoma maligno [12]. Sin embargo, como un medicamento de proteína, endostatina tiene una corta vida media
in vivo
y fácilmente pierde su eficacia. Además, el requisito para un régimen de dosificación frecuente y altas dosis de proteína purificada caro dificulta su aplicación clínica futuro. Para superar estas deficiencias, la aplicación de la terapia génica ha sido explorado. Sin embargo, la eficiencia de suministro de genes de vectores de plásmidos es muy pobre, y que también producen muy baja expresión de endostatina. Otras estrategias han tratado de superar algunas de estas cuestiones en los intentos de prolongar la expresión de endostatina. Adenovirus es considerado uno de los vectores de genes más eficientes y se ha demostrado para generar alta expresión de endostatina durante varios días [4]. Sin embargo, surgen limitaciones del tiempo de supervivencia relativamente corto del virus, y estos vectores no pueden migrar especialmente al sitio del tumor y por lo tanto requieren la inyección de ubicación. Por lo tanto, se necesitan nuevas y más efectivas herramientas terapéuticas que se dirigen específicamente la expresión de endostatina a las células tumorales.
Las células madre mesenquimales (MSC) son células madre multipotentes con la capacidad de diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo condrocitos , osteoblastos, adipocitos, músculos, neuronas, células del estroma, y otros tipos de células [13]. Varios estudios han indicado que las células madre mesenquimales derivadas de placenta humano (hpMSCs) son similares a las células madre de la médula ósea con respecto a características de las células y su potencial de diferenciación multilinaje [14] - [16]. Como tejidos de la placenta se originan durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, estos tejidos pueden contener células que han conservado las prosperidades de células embrionarias tempranas de las que derivan. Además, la placenta es fundamental para el mantenimiento de la tolerancia feto-materna durante el embarazo, lo que sugiere que las células presentes en el tejido placenta pueden tener características immonomodulatory. Mientras tanto, estudios recientes demostraron que mesenquimales aisladas a partir de tejido de placenta tienen la capacidad de homing específicamente a sitio del tumor múltiple. Estos tres aspectos clave hacen que las células de la placenta candidato muy atractivo para su posible uso en métodos de terapia celular en el tratamiento del cáncer directa [17]. Algunos estudios han diseñado las MSC de expresar interferón β (IFNß) en los gliomas [18], el melanoma metastásico [19], y modelos de cáncer de mama [20]. entregado-MSC IFNß se ha demostrado para suprimir el crecimiento de células tumorales por inducción de la diferenciación de células de cáncer y la apoptosis, lo que resulta en aumento de la supervivencia en estos modelos [18], [19]. Estos estudios demostraron el mecanismo molecular relevante mediar la interacción cruzada represiva entre MSCs de ingeniería y el crecimiento del tumor puede involucradas en múltiples aspectos, incluyendo: a. MSC pueden viajar al mismo destino homing como el cáncer de células madre que migra con habilidades inusuales para migrar al sitio oncogénico; segundo. la citoquina escondido en las MSC puede evadir la vigilancia del sistema inmune y ser bien tolerado por el huésped sin inducir una respuesta inmune inaceptable; do. MSCs-virales transducidas pueden entregar viral initiatively a los sitios tumorales y también aumentar la dosis viral local mediante la replicación viral continua y la amplificación [21]. Estos resultados mostraron MSCs podrían servir como candidato potencial de vector para la terapia génica. Mientras tanto, hpMSCs han demostrado ser más ventajoso en la obtención de células, el almacenamiento, y el trasplante de las MSC derivadas de médula ósea. Por otra parte, las células estromales mesenquimales de la médula ósea tienen un riesgo de infección viral [22] y su capacidad de diferenciación disminuye significativamente con la edad del donante [23]. Por otra parte, la placenta generalmente se desecha después del nacimiento; Como tal, este tejido está disponible en gran cantidad, y el aislamiento de células madre a partir de este tejido no se trata de procedimientos invasivos para el donante y evita controversia ética. Estos aspectos claves hacen que las células aisladas de placenta buenos candidatos para su posible uso en terapia celular. El interés principal de este estudio se ha centrado en si hpMSCs endostatina de ingeniería podrían migrar específicamente al sitio del tumor y superar la progresión tumoral y metástasis en un modelo de cáncer de ovario humano.
Materiales y Métodos
recombinante adenoviral construcción vector
construcción del adenovirus endostatina recombinante ha sido descrito en un estudio anterior [10]. Brevemente, el ADNc de endostatina humana de longitud completa (aproximadamente 570 bp) se amplificó por RT-PCR. Después de la confirmación de secuencia, el ADNc se clonó en un vector lanzadera para el rescate de adenovirus con deleción de E3 (sistema AdEasy) recombinante E1- /[24]. Las partículas virales se amplificaron en 293 células, purificados por dos etapas de cloruro de cesio (CsCl) ultracentrifugación en gradiente, y se midieron por absorción a 260 nm. El título de virus se cuantificó utilizando un ensayo TCID50 estándar.
Cultivo de células y reactivos
Los A2780s línea celular de riñón embrionario humano y células (HEK293) se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas , VA, EE.UU.) y se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) rutinariamente suplementadas con 10% de suero fetal inactivado por calor bovina más ampicilina y estreptomicina humidificado en un 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C . ratones desnudos hembra (6-8 semanas de edad) fueron adquiridos desde el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Sichuan.
hpMSC aislamiento y cultivo
a término se obtuvo placenta humana a partir de una madre sana después del donante consentimiento por escrito bajo un protocolo de recogida de tejido aprobado por la institución del Consejo de Revisión Institucional (IRB) del segundo hospital del oeste de china. Los consentimientos informados fueron escritas y todos los documentos se mantuvieron en IRB occidental china de segundo hospital. Con procedimientos estériles, deciduas fetales tejido placentario se cortó en trozos de aproximadamente 1 cm
3 en tamaño, se lavaron con PBS, y se digirió con 1 mg /ml de colagenasa tipo I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) a 37 ° C durante 2 h. Las células se separaron entonces mediante centrifugación en medio de separación de Ficoll-Hypaque en un gradiente g /cm
3 densidad de 1,088 para eliminar las células no deseadas. Las células recogidas se volvieron a suspender a la cultura en la L-medio DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 20% de SFB (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), 10 U de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), 2 mmol /l de L-glutamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Después las células se sembraron en 75 cm
2 matraces y se cultivaron en un 37 ° C, 5% de CO
2 incubadora con humedad saturada. Después de 48 h, las células no adherentes se eliminaron mediante la sustitución del medio de cultivo. medio fresco se intercambió cada 3 a 4 días. Las células se recogieron por tripsinización (0.25% de tripsina con 0.1% EDTA), posteriormente a pases, y luego se usa durante el cuarto paso para los experimentos.
fenotipo de superficie de la célula y diferenciado multipotentes estimación
Para distinguir hpMSCs, caracterización fenotípica de CD29, CD44, CD105, CD73, CD166, CD90, CD34 y CD 45 se analizaron mediante un citómetro de flujo (Coulter EPICS Elite ESP) [25]. Las células se digieren y se incubaron con anticuerpo durante 25 minutos a 4 ° C. Las células no teñidas, nonincubated sirvieron como control. A continuación, las células se fijaron en 4% de formalina tamponada y se analizaron con un citómetro de flujo. Los mínimos de células para eventos de 8.000 cerradas fueron adquiridas para cada muestra. Para la diferenciación osteogénica y adipogénica, hpMSCs se cultivaron a 5 × 10
4 células por pocillo de placas de 12 pocillos en OsteoDiff o medio de inducción Adipodiff (Miltenyi Biotec GmbH) durante 3 semanas, a continuación, rojo de alizarina S y aceite rojo-O se utilizaron para visualizar los depósitos de calcio y gotitas de grasa por separado. Para determina si la transfección con adenovirus afectaría a las características multipotentes, 48 horas después transfectadas con adenovirus, las células se cultivaron en OsteoDiff o medio de inducción Adipodiff durante 3 semanas, a continuación, Oil-Red-O y rojo de alizarina S se utilizaron para visualizar los depósitos de calcio y grasa gotitas, respectivamente
transfección y expresión de proteínas hpMSC ensayos
La población MSC aislada con fenotipo positivo se expandió de forma continua durante semanas hasta que las placas hpMSCs-adhesión alcanzaron & gt;. 90% de confluencia y poseía actividad anclaje suficiente y la estabilidad para soportar las tensiones de la infección vector viral a una alta multiplicidad (normalmente entre población duplicaciones 4 y 7). Antes de la transducción, el medio de cultivo se retiró y las células se lavaron una vez con DMEM libre de suero. Ad-hendo-GFP se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a una multiplicidad de infección (MOI; virus /célula) de 2000 (seleccionado como el óptimo entre la MOI de 1,000, 2,000, y 3,000). Después de 48 h, vector y el modelo de células transducidas fueron analizadas en un microscopio invertido (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, EE.UU.). Y un citómetro de flujo se aplicó para la evaluación de la fluorescencia verde
Las células transfectadas con Ad-hendo (hpMSC-Ad-hendo) y los adenovirus de control (Ad-nulo) a una MOI de 2000 (2,5 * 10
8 pfu /10
6 células en 1,0 ml de medio completo) era obtiene entonces, y se recogió el sobrenadante, se concentró por ultrafiltración (Centricon YM-3; Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), y se analizó por transferencia Western. Las proteínas se separaron mediante un gel de SDS-PAGE 12% y transblotted a una membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). A continuación, la membrana se bloqueó en 5% de leche sin grasa en 0,1% de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente y más tarde sondeó con un anticuerpo anti-endostatina policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) diluido 1:400 a 4 ° C durante la noche. Posteriormente, las transferencias se incuban con una inmunoglobulina anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando un kit de detección ECL (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.).
Por otra parte, también se realizó un ensayo ELISA para determinar el nivel de expresión de endostatina segregada por hpMSCs ingeniería
in vitro
. Como se ha descrito antes, los hpMSCs aisladas fueron transfectadas con endostatina llevar a adenovirus, y en 48, 72 y 96 horas después de la transfección, se recogieron y se ensayaron para genes de endostatina humana niveles de expresión utilizando una endostatina humana Quantikine ELISA Kit (R & amp; D Systems) los sobrenadantes .
in vitro
hpMSC la migración de ensayo
A2780 (1 * 10
6) o HEK293 (5 * 10
5) las células fueron sembradas en 500 l de medio /pocillo en placas de 24 pocillos. Después de 24 horas, un Millicell insertar (tamaño de poro 8 m; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) se colocó encima de la capa A2780 o HT293 celular, y las células se sembraron hpMSCs en el pocillo superior y se cultivaron durante 48 h. Debido a la membrana de policarbonato de la Millicell, las células comparten el mismo medio sin la interacción célula-célula directa entre las cámaras. La membrana se lavó tres veces con PBS. Los hpMSCs en el lado inferior de la membrana se tiñeron con cristal violeta, y cinco campos aleatorios se contaron usando un microscopio invertido (Axiovert 200; Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, EE.UU.). Estos experimentos se realizaron por triplicado.
Determinación de hpMSC homing al sitio del tumor
Los tumores fueron establecidos en ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de 5 * 10
6 células A2780s. Después de 14 días de exposición al tumor cuando los nódulos tumorales eran palpables, hpMSCs fueron transfectadas con Ad-GFP usando Lipofectamine como se ha descrito antes. Después de 48 h, se recogieron las células, se lavaron una vez con PBS y se suspendieron en medio fresco. i.p. Entonces se inyectaron células a las 2 * 10
5 células por inyección. ratones portadores de tumor no se aplicaron como control. Tres días y 2 semanas después de la inyección, se recogieron los nódulos tumorales y orangs (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) y se congelaron en compuesto de corte temperatura óptima (OCT), respectivamente. hpMSCs fluorescentes se detectaron en secciones criogénicas frescas (3-5 M) de las muestras de tumor y los órganos utilizando un microscopio de fluorescencia.
Tratamiento del modelo de xenoinjerto experimental
ratones hembra BALB /c desnudos 6- se adquirieron 8 semanas de edad del centro animal experimental de la Universidad de Sichuan. El protocolo de investigación fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el Tratamiento de la Universidad de Sichuan. cáncer de ovario humano fue establecida por vía intraperitoneal inyección de ratones desnudos con 5 * 10
6 células A2780 en 200 l de PBS. Antes i.p. administración, hpMSCs fueron transfectadas con Ad-hendo o Ad-nula a una MOI de 2000 como se describe anteriormente. Los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos (n = 5 animales /grupo): (a) Los ratones tratados con solución salina normal al 0,9% (NS); (B) los ratones tratados con hpMSCs a 2 * 10
5 /ratón; (c) los ratones tratados con hpMSCs-null-transfectadas anuncio a 2 * 10
5 /ratón; (d) los ratones tratados con hpMSCs-transfectadas con hendo anuncio a 2 * 10
5 /ratón. El tratamiento se inició 5 días después de la estimulación de células tumorales y se administró mediante inyección i.p. inyección cada 3 días para un total de 6 veces. Los ratones se monitorizaron diariamente para la carga tumoral, distensión abdominal, caquexia, y otras anomalías. Se sacrificaron los ratones 1 semana después de la última administración, y el i.p. los tumores fueron extirpados y luego ponderados.
La cuantificación de la proliferación celular y la densidad de los microvasos angiogénico
se cosecharon
muestras de tumores primarios con los tejidos adyacentes y los órganos internos pertinentes, se fijaron en 4% de paraformaldehído y, a continuación embebido en parafina. Para el análisis inmunohistoquímica, las secciones 3 a 5 m de espesor se cortaron de los bloques de parafina, desparafinaron en xileno, y rehidratada con una serie de EtOH graduada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por tratamiento en autoclave de las secciones en tampón de recuperación (10 mmol /l de tampón EDTA citrato [pH 6,0]; Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 4 minutos en vapor saturado después de hasta la presión ganando (126 ° C, 1,6 bar, 23 psi). La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% a temperatura ambiente durante 10 min libres de la luz, y la unión no específica de los reactivos se inactivó mediante incubación de las secciones durante 20 minutos en 10% de cabra normal o suero de conejo. Las secciones fueron incubadas con cabra anti-humano Ki-67 anticuerpos policlonales (1:150; Maixin-Bio, Fuzhou, China) y la rata policlonal anti-CD31 humano (1:200; Maixin-Bio, Fuzhou, China) durante la noche en una cámara húmeda a 4 ° C; esto fue seguido por la incubación con biotina conejo anti-cabra /IgG de rata y luego complejo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante-biotina a 37 ° C durante 45 min. Las inmunorreacciones fueron finalmente desarrollaron (visualizado con diaminobencidina solución [DAB] como cromógeno) utilizando un sistema de + sustrato-cromógeno DAKO Liquid DAB, y los precipitados amarillo carmesí fueron identificados como tinción positiva. Contratinción se realizó con cuidado paliativo con hematoxilina de Gill, y los portaobjetos se deshidrataron y se montó con cubreobjetos de vidrio. Las secciones fueron visualizadas usando un microscopio a 400 aumentos (Olympus, Tokio, Japón). El Ki-67-positivas las células o los vasos sanguíneos se contó a partir de tres áreas en cada sección en una forma ciega.
encapsulación alginato ensayo
ensayo de células tumor perla que contiene alginato se describe en detalles anteriormente [ ,,,0],26]. Brevemente, las células A2780 cultivadas se resuspendieron con 1,5% (m /v) de alginato de sodio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), y luego la solución de alginato de células tumorales se dejó caer en un baño de remolino de 0,25 M CaCl2 con el fin de formar gotitas que contienen aproximadamente 1 x 10
células 5 tumorales por perla. Después anestesiados, los ratones desnudos se implantaron s.c. con cuatro perlas en una incisión en la parte posterior, las incisiones se suturaron con pinzas quirúrgicas. El hpMSCs-Ad-hendo (a una MOI de 2000) se inyectó por vía intraperitoneal en días 3, 6, 9, 12 después de la implantación de bolas, con hpMSCs-Ad-null, hpMSCs o solución salina como control. A los 14 días, los ratones fueron inyectados i.v. con solución tran 100 l FITC-dex- (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) (100 mg /kg) y se sacrificaron 20 minutos más tarde. Imagen de los implantes de alginato fue tomada mediante el uso de la cámara SPOT FIEX. Las esferas de alginato se transfirieron a tubos que contienen 2 ml de solución salina. Los tubos se mezclaron mediante un vórtice durante 20 s y se centrifuga (3 min; 1.000 x g). Finalmente se midió la fluorescencia del sobrenadante para cuantificar la formación de vasos sanguíneos.
Análisis de la apoptosis en los tejidos tumorales
análisis apoptosis se realiza por medio de TUNEL (mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick-end etiquetado) utilizando un sistema DeadEnd fluorométrico TUNEL (Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. núcleos TUNEL-positivas, núcleos picnóticos con tinción fluorescente de color verde oscuro, se visualizaron y se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón). El índice de apoptosis se determinó por dos investigadores dependientes contando las células TUNEL positivas en cinco campos de alta potencia por diapositiva.
Evaluación de la toxicidad potencial
Con el fin de evaluar los posibles efectos secundarios y toxicidad de hpMSCs, se observaron los índices pertinentes, tales como la pérdida de peso, anorexia, diarrea, caquexia, ulceración de la piel, piel de volantes, y la muerte tóxica. Después del sacrificio de los ratones, diversos órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón, etc.) se recogieron y se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS. Las secciones de 3-5 micras se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Y se observan bajo un microscopio por dos patólogos en una forma ciega
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas en el peso del tumor , el peso del animal, por ciento apoptosis, y la densidad de los microvasos se determinaron usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
fenotipo análisis y las características de las células multipotentes aisladas
citometría de flujo análisis indicaron que la población de células de la placa-adhesión era. positivo para la madre mesenquimales marcadores de células CD29 (& gt; 95%), CD44 (& gt; 95%), CD73 (& gt; 99%), CD90 (& gt; 95%), CD166 (& gt; 95%), CD105 (& gt; 95%) y negativos para los marcadores CD34 hematopoyéticas (& lt; 3%) y CD45 (& lt; 3%), que era consistente con las características de las MSC (Figura 1A). La definición general de MSC incluye tanto fenotípica y criterios funcionales, por lo que aplica la osteogénico y el ensayo de diferenciación adipogénica a indentify las características pluripotentes antes y después de la transfección de adenovirus. Para la diferenciación osteogénica y adipogénica, hpMSCs se cultivaron a 5 × 10
4 células por pocillo de placas de 12 pocillos en OsteoDiff o medio de inducción Adipodiff (Miltenyi Biotec GmbH) durante 3 semanas, a continuación, rojo de alizarina S y aceite rojo-O se utilizaron para visualizar los depósitos de calcio y gotitas de grasa por separado. Como se muestra en la Figura 1B, 1C, visualizando las vacuolas de lípidos y depósitos de calcio que apuntan a una capacidad de diferenciación multipotentes más amplia de nuestros hpMSCs. También se determinó si la transfección con adenovirus afectaría a las características multipotentes. 48 horas después transfectadas con adenovirus, las células se cultivaron en medio de inducción o OsteoDiff Adipodiff durante 3 semanas, a continuación, Oil-Red-O y rojo de alizarina S se utilizaron para visualizar los depósitos de calcio y gotitas de grasa por separado. Como se muestra en la Figura 1C, vacuolas lipídicas positivos y depósitos de calcio pueden ser visualizados.
A. Las características fenotípicas de las MSC purificadas fueron verificadas mediante citometría de flujo análisis, que mostró que estos expandido y las poblaciones de placa-adhesión de células (en duplicaciones 3 y 5) fueron positivas para CD29 (& gt; 95%), CD44 (& gt; 95%) , CD73 (& gt; 99%), CD90 (& gt; 95%), CD166 (& gt; 95%) y CD105 (& gt; 95%) la expresión de marcadores de superficie y negativo para CD34 (& lt; 3%) y CD45 (& lt; 3%). La línea continua indica las células control no teñidas y la línea de puntos indica células madre mesenquimales aisladas. B. osteogénico y determinación adipogenic diferenciación en las células madre mesenquimales aisladas. Panel izquierdo indica depósito positivo de calcio (flechas), el panel de la derecha indica lípidos vacuolas (flechas). C. osteogénico y determinación adipogenic diferenciación en las células madre mesenquimales aisladas después de transfección con adenovirus. 48 h después de la transfección, las células se lavaron con PBS y se cultivaron en medio de inducción o OsteoDiff Adipodiff durante 3 semanas, a continuación, Oil-Red-O y rojo de alizarina S se utilizaron para visualizar los depósitos de calcio y gotitas de grasa por separado. vacuolas de lípidos y depósitos de calcio (flechas) podrían ser visualizadas (× 100).
in vitro
expresión de hpMSC-Ad-hendo
Desde placenta- humana MSC derivados son relativamente resistentes a la infección por adenovirus de tipo salvaje debido a su baja expresión del receptor CAR de adenovirus, se realizó Lipofectamine 2000 mediada por la transducción adenoviral. La eficiencia de suministro de genes del adenovirus en hpMSCs se determinó por evaluación microscopio. Se encontró que después de la transducción con el Ad-hendo-GFP recombinante a una MOI de 2,000 y 3,000, casi todas las células que emiten fluorescencia verde después de cultivo en condiciones de placa-adhesión (Figura 2A). Sin embargo, junto con el aumento de multiplicidad de infección, también se aumentó la muerte celular, lo que posiblemente refleja el daño celular debido a la expresión del transgen excesiva. Además, la citometría de flujo se utilizó para medir la eficacia de transducción. Los resultados indicaron que era eficaz a una MOI de 2000, ya que aproximadamente 82,3% de las células hpMSC-hendo expresó consistentemente GFP en este MOI (Figura 2D). Tomados en conjunto, se optó por utilizar células modificadas en estas condiciones de transducción (una MOI de 2000) en todos los experimentos posteriores. Posteriormente, para comprobar si la proteína de endostatina se secretó a partir de células hpMSC-Ad-hendo, se realizó análisis de transferencia de Western. Como se muestra en la Figura 2B, a una MOI de 2000, una banda diferenciada de unos 20 kDa, que corresponde al tamaño de la endostatina, se expresó en las células tratadas con Ad-hendo pero no en las células tratadas Ad-nulos. Por otra parte, también se realizó un ensayo ELISA para detectar endostatina secretada por hpMSC-Ad-hendo. Como se muestra en la Figura 2C, la concentración de la endostatina en los sobrenadantes de cultivo de células fue significativamente mayor que los grupos de control y el nivel de endotatin también aumentó con el tiempo y se mantuvo en un nivel alto 96 h después de la transfección. Este ensayo verifica que la endostatina puede ser secretada eficientemente de los hpMSCs ingeniería.
A. La fluorescencia de GFP se evaluó en el canal FITC. Los hpMSCs transfectadas con adenovirus GFP-etiquetados mostraron verde. Aumento original × 400. B. Las células transfectadas con Ad-hendo y controlar adenovirus (Ad-nulo) a una MOI de 2000 se analizaron por Western blot para detectar la expresión de la proteína de endostatina. hpMSCs transfectadas con Ad-hendo mostraron una expresión evidente de la proteína de endostatina en comparación con el control. C. Para verificar el nivel de expresión de endostatina segregada por hpMSCs ingeniería
in vitro
, ensayo ELISA se realizó para evaluar la endostatina en los sobrenadantes de las células transfectadas con adenovirus que llevan endostatina, hpMSCs y hpMSCs transfectadas con Ad-nula se aplicaron como control. A las 48 h, 72 hy 96 h después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células y se determinaron la concentración de endostatina. La concentración de la endostatina en los sobrenadantes de cultivo de células fue significativamente mayor que los grupos de control y el nivel de endotatin también aumentó con el tiempo y se mantuvo en un nivel alto 96 h después de la transfección. D. de citometría de flujo se aplicó para evaluar la eficiencia de transfección de Ad-hendo-GFP. La tasa de transfección a MOI 1000, 2000 y 3000 fue del 60,3%, 82,3% y 79%, respectivamente. En comparación con el control, la infección a una MOI de 2000 dio como resultado una mayor eficiencia de la transfección. El cuadro rojo representa la zona positivo en cada parcela.
La capacidad migratoria de las células tumorales hacia hpMSCs
in vitro
y
in vivo
se ha propuesto que los factores liberados de las células cancerosas pueden ser potenciales quimioatrayentes que participan en el tropismo de las MSC. Para evaluar la capacidad migratoria de hpMSCs hacia células A2780,
in vitro se llevaron a cabo los ensayos de migración en
utilizando insertos Millicell. El medio condicionado de células 293 se utilizó como control. Sólo unos pocos hpMSCs-Ad-hendo células migran hacia el medio 293 acondicionado, mientras que la migración de hpMSCs-Ad-hendo se estimuló significativamente por medio condicionado de las células A2780 cáncer de ovario humano (P & lt; 0,01; figura 3A). Cuando se calcularon los números de células migradas en la parte inferior de los insertos Millicell, se confirmó que hpMSCs no modificados migran al medio condicionado de las células A2780 en un patrón similar a la de hpMSCs-Ad-hendo. En conjunto, nuestros datos indican que en las condiciones descritas, hpMSCs mostraron células de capacidad y A2780 migratorios significativos poseían una mayor capacidad para inducir la migración de las MSC en comparación con células 293 (P & lt; 0,05; Figura 3B). Para determinar si hpMSCs preferentemente alojados a xenoinjertos de ovario humano, que establecieron ratones desnudos peritoneal modelo de cáncer de ovario. 2 semanas después de i.p. inyección de células A2780 y los tumores eran palpables, que i.p. inyectado células madre mesenquimales transfectadas con adenovirus que llevan GFP, y ratones portadores de tumor no se utilizaron como control. En el punto de tiempo de 3 días y 2 semanas después de la inyección i.p. inyección de células madre mesenquimales transfectadas, los ratones se sacrificaron y se recogieron los nódulos tumorales, hígado, bazo, pulmón, riñón y corazón y se midió la señal de GFP. Como se muestra en la Figura 3C, 3 días después de i.p. inyección, se detectaron señales de GFP en la periferia del tumor. 2 semanas después de i.p. inyección, curiosamente se detectó señal positiva en el parénquima tumoral. Este hallazgo sugiere que las células madre mesenquimatosas inyectadas persisten en el xenoinjerto y pueden integrar en el foco tumor. Además, no hay ninguna señal positiva que se encuentra en los órganos del portador de un tumor y no tumor ratones portadores.
A. La migración de hpMSCs /hpMSCs-AD-Endo células a través de una membrana de 8 um Millicell. HpMSCs se cultivaron en placas de 24 pocillos a membranas de 8 um de tamaño de poro, y A2780s o 293 células fueron cultivadas en la cámara inferior. Las células migraron al lado inferior de la membrana se marcaron con violeta de metilo. Aumento original × 400. B. Inducción de hpMSCs /migración hpMSCs-Ad-Endo estimulada por A2780s o 293 células. En comparación con las células 293, células A2780s promueven la migración de hpMSCs //hpMSCs-Ad-Endo significativamente. Los datos que se muestran como medias ± SD. C. Para verificar la propiedad específica de homing mesenquimales transducido al sitio del tumor, que transducido hpMSCs con adenovirus que llevan GFP y se inyecta por vía intraperitoneal a ratones desnudos con tumor de ovario peritoneal establecido. Después de 3 días y 2 semanas de inyecciones i.p. la inyección, los ratones se sacrificaron y se recogieron los nódulos tumorales y órganos. Panel izquierdo: 3 días después por vía intraperitoneal inyección, señal de GFP (flecha) se detectaron en la periferia del tumor. Panel derecho: 2 semanas después de la inyección i.p. inyección, se detectaron señales positivas para GFP en el parénquima tumoral (flecha), que indican hpMSCs persisten en el xenoinjerto y pueden integrarse en el foco tumoral.