Extracto
Antecedentes
El pulmón es un sitio frecuente de metástasis de cáncer colorrectal (CRC). Después de la resección quirúrgica, metástasis pulmonares recurrencias se han relacionado con la presencia de micrometástasis, potencialmente accesible a una quimioterapia de alta dosis administrada a través de aislado adyuvante de perfusión pulmonar (ILP). Hemos tratado de determinar
in vitro
el fármaco más eficaz cuando se administra a líneas celulares de CRC durante una breve exposición y
in vivo
su inmediata y retardada tolerancia cuando se administra a través de ILP.
Métodos
en primer lugar, la eficacia de diversas moléculas citotóxicas contra un panel de líneas celulares de CRC humanos se probó
in vitro utilizando un ensayo citotóxico
después de una exposición de 30 minutos. Luego, a principios (operativa) y tardía (1 mes) la tolerancia de dos concentraciones de la molécula administrada a través de ILP se puso a prueba en 19 cerdos adultos que utilizan hemodinámica, biológicos y criterios histológicos.
Resultados
in vitro
, gemcitabina (GEM) fue el fármaco más eficaz contra las líneas celulares de CRC seleccionados.
In vivo
, GEM se administró a través ILP al normal (20 g /ml) o alta (/ml 100 g) las concentraciones. administración GEM se asoció con la vasoconstricción pulmonar transitorio y dependiente de la dosis, lo que lleva a una disminución voluntaria en flujo de entrada de la bomba con el fin de mantener una presión de la arteria pulmonar estable. Después de esta modulación, ILP usando GEM no se asoció con cualquier fuga sistémica, daño sistémico, y la toxicidad pulmonar aguda o retardada histológico. Estudios farmacocinéticos revelaron la absorción dependiente de la dosis asociada con la distribución heterogénea de la molécula en el parénquima pulmonar, y la citotoxicidad persistente de efluente venoso.
Conclusiones
GEM es eficaz contra las células CRC incluso después de una corta exposición . ILP con GEM es una técnica segura y reproducible
Visto: págs. P-B, Facy O, P mordiente, Ladoire S, G Magnin, Lokiec F, et al. (2013) Aislado de perfusión pulmonar como tratamiento adyuvante del cáncer colorrectal metástasis pulmonares: un estudio preclínico en un modelo porcino. PLoS ONE 8 (3): e59485. doi: 10.1371 /journal.pone.0059485
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Agosto, 2012; Aceptado: 14 Febrero 2013; Publicado: 18 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Pagès et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Liga Nacional francesa contra el cáncer [SW /SP-116F.2010] y el Comité Científico de la Facultad de Medicina de Dijon, Francia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Alrededor del 11% de los pacientes que sufren de cáncer colorrectal (CCR) con el tiempo desarrollarán metástasis pulmonares [1]. Esta condición se asocia con tasas de supervivencia a 5 años que van desde 5 a 50%, de acuerdo con la posibilidad de lograr la resección quirúrgica completa [2] - [7]. A pesar de la resección quirúrgica, la recurrencia pulmonar se produce en más de 40% de los pacientes, probablemente debido a micrometástasis que ya estaban presentes durante el procedimiento inicial [3]. la quimioterapia adyuvante mejora libre de progresión, pero no la supervivencia general [8], y el aumento de la dosis sistémica se asocia con toxicidades inaceptables [9].
La completa del tumor y la metástasis de control siempre ha sido la piedra angular de las terapias contra el cáncer. Además, los datos recientes indican que la metástasis es un proceso mediante el cual las células cancerosas multidireccional pueden sembrar sitios distantes, así como el propio tumor primario [10]. Este último proceso, conocido como "auto-siembra, 'ha sido validado en diversos modelos experimentales [11], y constituyen un fuerte argumento a favor del control local de las enfermedades metastásicas.
Con el fin de disminuir la recurrencia de metástasis de pulmón de CRC, algunos autores han desarrollado la técnica de perfusión aislada de pulmón (ILP) [12], lo que permite aumentar la dosis de agente citotóxico al tejido pulmonar sin exposición sistémica. Esta técnica se ha demostrado ser segura y eficaz contra las metástasis pulmonares de CRC en modelo de roedores [13] - [17]. Los principales objetivos de este estudio fueron determinar
in vitro
el fármaco más eficaz cuando se administra a líneas celulares de CRC durante una breve exposición y
in vivo
su inmediata y retardada tolerancia cuando se administra a través de ILP un modelo porcino.
Materiales y Métodos
in vitro anti tumoral Efecto
Las líneas celulares.
un panel de líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano (HT29, HCT8, HCT116, SW480) fue elegido para representar la diversidad de la sensibilidad quimioterapia CRC y el estado mutacional (Tabla 1), comprado a la Tejidos y células Colección Americana (ATCC®, Rockville, MD, EE.UU.) y se mantuvieron en cultivo como se recomienda.
compuestos
los siguientes compuestos fueron elegidos como los fármacos más eficaces contra la CRC en el entorno clínico [18] - [19]:. gemcitabina (GEM) (Gemzar®, Lilly) , cisplatino (cisplatina Mylan®, Mylan), 5 fluorouracilo (5-FU) (fluorouracile Accord®, Acuerdo de Salud), oxaliplatino (Eloxatine®, Sanofi), Raltritexed (Tomudex®, Hospira) e irinotecán (Campto®, Pfizer).
ensayo de citotoxicidad.
anti tumoral efecto de estos compuestos se determinó utilizando el ensayo citotóxico, tal como se describe anteriormente [20]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 24 pocillos, se deja crecer hasta confluencia en 24 horas, y se expusieron a los compuestos seleccionados solos o en combinación durante 30 minutos. Después de 4 días, las células se tiñeron utilizando cristal violeta, y se midió la absorbancia en cada pocillo por un fotómetro automático (filtro de 590 nm, Spectra-A®, Varian, Francia). La supervivencia celular se calculó como el porcentaje de absorbancia en tratados
vs
pocillos no tratados, y se determinó la CI50 (concentración de lograr una inhibición del crecimiento de 50% de las células). El medicamento más eficaz se define como el compuesto con la IC50 más bajo [20], y se probó en combinación con el segundo compuesto más eficiente.
Aislado perfusión pulmonar
Animales.
tres meses de edad grandes cerdos blancos (n = 19), con un peso de 50 ± 3 kg cada una, fueron adquiridos de Hazotte (Beaumont, Francia). Animales se les permitió aclimatarse al ambiente del laboratorio durante 7 días con acceso libre a comida y agua. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Borgoña, Francia (A0809).
Anestesia.
Los animales fueron anestesiados como se describe anteriormente [21]. La presión sanguínea arterial sistémica se controló a través de un catéter insertado en la arteria humeral. La frecuencia cardiaca, electrocardiograma, la temperatura nasal, la saturación arterial de oxígeno fueron controlados mediante el sistema NICO (Novametrix Medical Systems, Wallingford, CT). La heparina no fraccionada (100 UI /kg) se administró antes de la exclusión vascular del pulmón. Para lograr la analgesia perioperatoria, 20 ml de ropivacaína 0,75% fueron inyectadas en la pared de la piel perilesional y el pecho. Tramadol y paracetamol fueron prescritos en el postoperatorio a intervalos regulares.
Técnica quirúrgica.
Después de haber colocado el animal en decúbito lateral derecho, una toracotomía posterolateral izquierda se llevó a cabo en el cuarto espacio intercostal . Pericardio se abre ampliamente, y se aisló la arteria pulmonar principal izquierda (LMPA) y las dos venas pulmonares izquierdas (LPV). Canulación se realizó utilizando un metal con punta de cánula derecha anguled (High Flow Arco aórtico cánula 3,8 mm, Terumo®, Ann Arbor, EE.UU.) insertado en el LMPA y una cánula venosa (DLP corazón izquierdo Vent catéter, Medtronic®, Minneapolis, EE.UU.) insertado en la convergencia de los LPVs a través de la aurícula izquierda (lA). Una línea de monitores se insertó en el origen de la LMPA. El LMPA y LA fueron que sujeta, el pulmón izquierdo se ventiló y el bronquio principal izquierdo se capturó para ocluir la sangre arterial bronquial [22].
Aislado perfusión pulmonar.
El sistema de circulación extracorpórea compone una bomba (Biomedicus®, Minneapolis, EE.UU.), intercambiador de calor, el depósito y el tubo de PVC de ¼ de pulgada de diámetro. El cebado se logró con una solución que contiene 850 ml de Voluven (6% de almidón de hidroxietilo 130 /0,4) y 150 ml de sangre de la circulación pulmonar. Después de iniciar la perfusión, el flujo de la bomba se aumentó gradualmente hasta obtener una presión media equivalente LMPA a la presión medida antes de la sujeción. a continuación, se inyectó la quimioterapia en el circuito de [23], el flujo de la bomba fue modulada para estabilizar la presión media de LMPA, y la perfusión quimioterapia duró 30 min seguido de un período de 15 min de lavado. A los 5, 10, 20 y 30 min de la perfusión, se tomaron muestras de sangre sistémica. A 30 minutos de perfusión, se tomaron dos muestras de pulmón para medir la concentración de fármaco en el tejido pulmonar y para evaluar la lesión pulmonar aguda histológico. Las muestras de fluidos fueron tomadas en el circuito de perfusión para medir la concentración de la droga, y el efluente de pulmón se elaboró para evaluar su efecto citotóxico sobre las células tumorales
in vitro
. Al final del procedimiento, se retiraron las cánulas, la toracotomía se cerró en un tubo temporal en el pecho, y los animales se despertaron.
Los grupos experimentales.
estudio de fase I ha definido una dosis máxima tolerada siguiente una infusión IV de 30 minutos de GEM equivalente a dosis sistémica de 20 mg /ml /h [24]. Como una proyección, la concentración de GEM utilizado para ILP era 0 g /ml (grupo de control, n = 5), 20 mg /ml (grupo de dosis regular, n = 7 animales) y 100 g /ml (grupo de dosis alta, n = 7).
Farmacocinética.
Para determinar la concentración de GEM en muestras de sangre y el parénquima pulmonar, las muestras se secaron a girar a 4 ° C y 12000 G durante 10 minutos. La cuantificación de GEM en el plasma y luego se surpernatant consigue utilizando isocatic sistema de alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) en fase inversa como se describe anteriormente [25]. Concentración de GEM en el extremo de la ILP se estableció en el circuito, en dos biopsias de pulmón diferentes, y en la circulación sistémica. citotoxicidad residual del efluente venoso se estudió usando diluciones en serie y en el ensayo citotóxico in vitro.
toxicidad sistémica aguda.
El procedimiento ILP se realizó en diez y nueve cerdos. La toxicidad sistémica de GEM se evaluó mediante la medición de la función hepática y renal. tolerancia hemodinámica se evaluó mediante el registro de la frecuencia cardíaca y la presión arterial sistémica.
toxicidad pulmonar aguda.
tolerancia respiratoria se evaluó mediante el registro de la presión media de LMPA, oxihemoglobina saturación (SpO2) y la presión parcial de dióxido de carbono durante la espiración (PCO2). La gravedad de las lesiones pulmonares se evaluó histológicamente mediante la puntuación de Chiang, que fue creado para evaluar la lesión pulmonar aguda después de la secuencia de isquemia /reperfusión de los pulmones trasplantados [26]. En pocas palabras, esta puntuación estima a lesiones como el edema y la infiltración celular. El edema se puntuó como 1 para el edema perivascular; 2 para el edema peribronquial o intersticial; 3 para el edema alveolar. infiltración de células se anotó como 2 para la infiltración celular perivascular; 3 para la infiltración de células intersticiales; 4 para la infiltración de células alveolares. La suma de todas las puntuaciones patológicas fue la puntuación para cada ámbito de aplicación, y luego se calculó la puntuación media para el pulmón izquierdo por la suma de la parte superior y la puntuación lóbulo inferior, donde 0 es un resultado normal.
toxicidad retardada.
Después de un mes de seguimiento, doce animales fueron reintervenidos sucesivamente. toxicidad retardada se evaluó mediante los mismos métodos y criterios como se describe para la toxicidad aguda. Los animales fueron sacrificados humanamente mediante una inyección intracardiaca de pentobarbital (Dolethal®, Vetoquinol).
Análisis estadístico.
Las variables categóricas se presentan como números y proporciones. las variables continuas normales se presentan como media ± desviación estándar. En cuanto a los parámetros hemodinámicos, se compararon los valores medios moderados de una manera repetida en el mismo animal mediante ANOVA de medidas repetidas. Una regresión lineal se realizó para estimar la correlación entre las variables continuas. Cuando los resultados del análisis de varianza fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,05), se realizó un
post hoc
comparación utilizando el método de Benferroni para reducir el riesgo α. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software estadístico STATA 12 (StataCorp, College Station, EE.UU.).
Resultados
Ensayo citotóxico
Administrado a través de una corta exposición, GEM fue más eficiente del 5 FU, cisplatino, oxaliplatino e irinotecán (Figura 1 A & amp; B). Raltitrexed mostró la misma eficacia que GEM en HCT8 y HT29, pero no en células HCT116 y SW480. Adjunción de raltitrexed a GEM no aumentó su citotoxicidad (Figura 1 C). Por lo tanto, GEM solo fue seleccionada para el procedimiento ILP.
A- valores de IC50 después de la exposición in vitro durante 30 minutos de las células SW480 CRC, HT28, HCT116 y HCT8 con oxaliplatino, 5-FU, cisplatino, GEM, irinotecán y raltitrexed. B- Las curvas de dosis-respuesta después de la exposición in vitro durante 30 minutos de las células SW480 CRC, HT28, HCT116 y HCT8 con oxaliplatino, 5-FU, cisplatino, GEM, irinotecán y raltitrexed. C- curvas de dosis-respuesta después de la exposición in vitro durante 30 minutos de las células SW480 CRC, HT28, HCT116 y HCT8 con la combinación de GEM y raltitrexed.
Farmacocinética
Después de 30 min de perfusión, la concentración GEM fue mayor para la alta dosis que para el grupo de dosis regular cuando se mide en el circuito (74,29 ± 18,06 vs 22,85 ± 6,51 mg /ml, respectivamente, p = 0,0001) y en el parénquima pulmonar (141.46 ± 117.07 mg /g vs 56,91 ± 28,06 mg /g, respectivamente, p = 0,014). Ensayo de citotoxicidad mostró un efecto citotóxico mantenido del efluente de pulmón al final de ILP, sin diferencia entre la dosis regular y el grupo de dosis alta, incluso para la dilución del 10% del efluente de pulmón (Figura 2). En la circulación sistémica, la concentración máxima de GEM después de la ILP fue 0,638 ± 0,27 g /ml para el grupo de dosis alta y 0,248 ml grupo ± 0,15 mg /dosis normal (Tabla 2).
Las células se expuestos a diferentes diluciones (10%, 50% y 100%) del efluente de pulmón.
Toxicidad sistémica aguda
En cuanto a la tolerancia hemodinámica sistémica, no se observó ningún cambio significativo de la presión arterial, la frecuencia cardíaca, y el electrocardiograma como se determina antes, durante y después del procedimiento (Tabla 3). No importante del hígado o toxicidad renal aguda se observó (Tabla 4).
pulmonar aguda Toxicidad
Antes de sujeción, las variaciones individuales en la presión media LMPA se observó al inicio del estudio, con valores que van de 18 a 34 mmHg. Después de sujeción, el flujo de entrada de perfusión se incrementó progresivamente para alcanzar un flujo de entrada de 500 a 600 ml /min. En los grupos de GEM, la presión media LMPA aumentó gradualmente, lo que conduce a disminuir el flujo de entrada de la bomba extracorpórea para mantener la presión LMPA media inicial (Figura 3A). Como consecuencia, la presión media LMPA no fue significativamente diferente entre los tres grupos (Figura 3B), pero el flujo de entrada de perfusión media en 30 min fue menor en los grupos de GEM que en el grupo control (Figura 3A). Hubo una correlación inversa entre la concentración de GEM en el circuito de perfusión y el flujo promedio después de 30 minutos de perfusión (p = 0,0158). No hubo diferencia en la presión media LMPA antes y después de ILP (p = 0,7187, Figura 3C). Los análisis histológicos revelaron una puntuación media de 5,05 Chiang ± 3,52 en el grupo control, con una diferencia significativa en los grupos del Movimiento. Tampoco hubo correlación entre la puntuación de Chiang y la dosis infundida GEM (p = 0.7491, Tabla 5) o la concentración de GEM en el parénquima pulmonar (p = 0,7278).
A- entrada de perfusión en el pulmón aislado perfundidos con gelatina (580 ± 178,88 ml /min), GEM 20 g /ml (257,14 ± 202.62 ml /min) y GEM 100 g /ml (210 +/- 138,92 ml /min) durante 30 min (p = 0,0055). presión B- perfusión en el pulmón aislado perfundido con gelatina, GEM 20 g /ml, y el IPG 100 g /ml durante 30 min. C- izquierda media de la presión arterial pulmonar antes y después de la ILP con gelatina, GEM 20 mg /ml y GEM 100 g /ml durante 30 min (p = 0,7187).
Toxicidad a largo plazo
ni se observó necrosis pulmonar ni fibrosis, macroscópicamente o microscópicamente. Con mayor frecuencia lesiones descritas fueron edema peribronquial y la infiltración de células intersticiales. lesiones graves tales como la infiltración celular alveolar sólo se observaron para los primeros tres animales en el grupo control, que presentó un edema pulmonar al final del procedimiento ILP relacionado con un rápido aumento de la entrada. No hubo correlación entre la concentración de GEM en el parénquima pulmonar y la puntuación de Chiang (p = 0,0846) (Tabla 5).
comentarios sobre las
Inicialmente desarrollado como un tratamiento adyuvante de las metástasis pulmonares procedentes de sarcomas, ILP ha generado un interés considerable debido a la alta tasa de recurrencia pulmonar y disminución de la supervivencia a largo plazo en esta patología, incluso después de la resección quirúrgica completa [3]. Las ventajas potenciales de ILP incluyen la entrega de altas dosis de quimioterapia en el pulmón, lo que lleva a una rápida saturación del parénquima pulmonar y la fuga sistémica limitada [14], [27] - [29]
El interés de la.
in vitro
ensayo citotóxico in es elegir un fármaco de quimioterapia para el procedimiento ILP, según lo sugerido por estudios anteriores. Enlace
et al
. demostrado que
in vitro
ensayos podrían identificar fármacos activos para la infusión de la arteria hepática individualizado [30]. Kornmann
et al
. mostraron que los pacientes con CCR que demostró
in vitro
sensibilidad puede beneficiarse de la quimioterapia regional de páncreas y los cólicos con GEM [31]. Al establecer este ensayo preliminar, se optó por un panel de células que representan la diversidad de la CRC relativo a los factores de crecimiento vías de señalización [32]. Estas vías están dirigidos en caso de enfermedad metastásica, solo o en combinación con agentes citotóxicos que incluyen oxaliplatino e irinotecan [33]. Sin embargo, estos dos fármacos eran menos eficientes que GEM después de la exposición a corto, probablemente porque GEM presenta un efecto dependiente de la dosis mientras que el efecto de oxaliplatino e irinotecán es más dependiente del tiempo [24], [34], [35].
Hasta la fecha, GEM no es un tratamiento sistémico estándar de metastastic CRC [33]. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, algunas publicaciones justifican el uso de la HTCA para elegir la quimioterapia activa en las células de CCR durante una corta exposición de 30 min [30], [31]. Es de notar que los fármacos utilizados en la perfusión aislada de órganos, como el pulmón o hígado de perfusión aislada, no son necesariamente las moléculas utilizadas para tratamientos intravenosos. En oncología torácica, Hendricks et al. han informado de resultados alentadores en una fase I de ensayos clínicos usando melfalán durante la ILP para el tratamiento de metástasis de pulmón [22]. En este estudio, los cánceres primarios fueron carcinoma colorrectal, carcinoma de células renales y sarcoma, y melfalán no era una terapia estándar de cualquiera de estos tipos de cáncer. Del mismo modo, en oncología hepática, se ha informado melfalán estar asociado con la respuesta clínica y la supervivencia prolongada tras la perfusión aislada del hígado, a pesar de su limitada eficacia después de la administración intra venosa [28]. Perfusión aislada de órganos sigue siendo una técnica experimental realizado solamente por pocos equipos quirúrgicos en la clínica, y todos los medicamentos disponibles para la administración sistémica no se han probado para la perfusión de órgano aislado. Una de las principales ventajas de la perfusión aislada del órgano es permitir el uso de dosis mayores de agentes citotóxicos, ampliando así el número de moléculas disponibles para obtener un efecto antitumoral. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ninguna publicación en la evaluación de la eficacia de la gemcitabina en metástasis de pulmón de CRC en el ámbito clínico.
En cuanto a la perfusión de órganos aislados, el diseño clásico de escalada de dosis es inútil si el plomo circuito extracorpóreo a un establo estado exponiendo el parénquima órgano a concentraciones activas asociadas con saturación de los tejidos normales [36]. En nuestro estudio, las concentraciones de GEM utilizados durante ILP había dieciocho a cuarenta veces mayor que
in vitro
IC50, dando lugar a concentraciones estables de GEM en el circuito a lo largo de la perfusión, con fugas sistémica mínima. Para ambos grupos, las concentraciones de GEM en el circuito fueron mucho más altos (de tres a veinte veces) al que se encuentra en el plasma de los pacientes tratados con IV GEM [24]. Además, la actividad citotóxica de los efluentes de pulmón demostró la persistencia de concentraciones altas de GEM y actividad citotóxica conservada. Estos tres elementos indican una saturación del parénquima pulmonar en su conjunto por el GEM durante el procedimiento ILP, pero la distribución espacial sigue siendo dudosa.
Durante la ILP, la presión de entrada se mantuvo equivalente a la presión arterial pulmonar media medida antes de la sujeción para prevenir el edema pulmonar y lesión pulmonar aguda [37], [38]. Adjunción de GEM al circuito se asoció con un aumento de la resistencia vascular intrapulmonar y posterior aumento de la presión arterial pulmonar media (PAPm). Esta toxicidad vascular transitoria de GEM ya ha sido reportado después de la administración sistémica, y se describe como una vasoconstricción transitoria asociada a un síndrome de fuga capilar [39]. Hemos demostrado que durante la ILP este fenómeno vascular es dependiente de la dosis y reversible, siempre y cuando la reducción de la afluencia ILP controla la PAP media. Por último, encontramos concentraciones heterogéneas de GEM en el parénquima pulmonar de acuerdo a la región y sea cual sea el grupo considerado, como ya se ha observado con otros agentes citotóxicos [40]. Esta heterogeneidad se puede interpretar como una consecuencia de una vasoconstricción inducida por fármacos irregular, y puede ser contrarrestado por la adjunción de vasodilatadores durante la ILP usando GEM.
puntuación más alta histológico Chiang se encontraron en el grupo control que en el GEM grupo, al final del procedimiento y después de un mes de la supervivencia. Franke et al. han demostrado que el aumento de la presión pulmonar en un entorno de ILP dará lugar a efectos nocivos sobre la morfología [37], pero en nuestro estudio, la presión de la perfusión fue significativamente diferente en los grupos de control y de GEM. La única diferencia significativa en la hemodinámica pulmonar entre los grupos fue significativa una mayor entrada de perfusión en el grupo de control. Este aumento de la afluencia de perfusión puede ser responsable de los efectos deletéreos histológicos.
Este estudio demostró que la ILP con GEM es una técnica segura y reproducible, lo que permite ofrecer alta dosis de quimioterapia para el parénquima pulmonar, con muy limitada sistémico fugas. Sin embargo, transitoria GEM-asociado y la vasoconstricción pulmonar dependiente de la dosis llevó a la distribución heterogénea de GEM en el parénquima pulmonar. Se necesitan más experimentos para optimizar la distribución de la droga en el parénquima pulmonar y para probar la eficacia de este enfoque antes de considerar los estudios clínicos.
Reconocimientos
Agradecemos a Paul Van Schil (Amberes, Bélgica ) por su amable acogida y la enseñanza precisa de la técnica quirúrgica. Agradecemos también a Valentin Derangère, Jean-Baptiste Lequeu, Thierry Benard, Philip Bastable y Pablo Ortega-Deballon por su entusiasta apoyo a esta labor.