Extracto
Cada vez hay más pruebas de que muchos tumores sólidos se organizan jerárquicamente con las células tumorales a granel que tienen potencial de replicación limitada, pero son sostenidos por una célula madre similar al que perpetúa el tumor. Estas células madre de cáncer se han planteado la hipótesis de que proceden de la transformación de células madre de tejido adulto, o por medio de re-adquisición de propiedades madre-como por las células progenitoras. carcinoma adenoescamoso (ASC) es un tipo agresivo de cáncer de pulmón que contiene una mezcla de células con fenotipos escamosas (citoqueratina 5+) y adenocarcinoma (citoqueratina 7 +). El origen de estas mezclas no está claro como se cree carcinomas escamosos que surgen de las células basales en el tracto respiratorio superior, mientras que los adenocarcinomas se cree que forman a partir de células madre en la unión alveolar bronquial. Hemos aislado y caracterizado poblaciones madre, como el cáncer de ASC mediante la aplicación de un medio de cultivo selectivo definido inicialmente utilizado para hacer crecer células madre de pulmón humanos. células homogéneas seleccionados a partir de muestras tumorales ASC se ampliaron de manera estable
in vitro
. xenoinjertos primarios y lesiones metastásicas derivados de estas células en ratones GSN recapitular completamente tanto el adenocarcinoma y características escamosas del tumor del paciente. Curiosamente, mientras que la CSLC todos los co-expresado citoqueratinas 5 y 7, las células más de xenoinjertos expresan cualquiera de los dos, o ninguno, con & lt; 10% restante doble positivo. También demostramos el potencial de la CSLC para diferenciar a las estructuras de múltiples linajes con ramificación morfología de pulmón expresan marcadores bronquial, alveolares y neuroendocrino in vitro. Tomados en conjunto las propiedades de estos CSLC ASC derivadas sugiere que ASC puede surgir de una célula madre de pulmón primitivo distinto de las células bronquiales-alveolar o madre basal.
Visto: JP Mather, Roberts PE, Pan Z, Chen M, Hooley J, Young P, et al. (2013) Aislamiento del cáncer del tallo como las células de Human adenoescamoso El carcinoma de pulmón Soporta un origen monoclonal a partir de una célula madre de tejido multipotenciales. PLoS ONE 8 (12): e79456. doi: 10.1371 /journal.pone.0079456
Editor: Alan P Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2013; Aceptado: September 23, 2013; Publicado: 4 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Mather et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. No hay corriente fuentes externas de financiación para este estudio. El trabajo fue financiado en su totalidad por MacroGenics, Inc. a través de la recaudación de fondos de la empresa de capital privado. Los donantes no estaban involucrados en cualquier aspecto del diseño o la realización de la investigación
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: este trabajo fue financiado en su totalidad por MacroGenics, Inc. a través de la recaudación de fondos de la empresa de capital privado. Todos los autores fueron empleados por MacroGenics, Inc. cuando este trabajo se llevó a cabo y las propias opciones sobre acciones y /o acciones de la empresa. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La hipótesis de las células madre del cáncer afirma que los cánceres surgir de cambios mutacionales o epigenéticos en las células madre de tejido (o progenitor), que permiten a estas células a escapar de los controles de crecimiento intrínsecos y extrínsecos y se convierten en invasoras [1]. Además de las pruebas sólidas que apoyen esta hipótesis en los cánceres hematopoyéticos, existe una creciente evidencia de que una serie de tumores sólidos, incluyendo el cerebro, colon, mama y pulmón [2] se organizan jerárquicamente con un subconjunto de stem- auto-renovación como las células. Además, hay pruebas recientes directa de modelos animales que colon, cerebro, y cánceres de piel pueden surgir de células madre similares a tejidos presentes en los tejidos adultos [3-5]. Las características madre-como de auto-renovación, tumorigenicidad, resistencia a los medicamentos, y la capacidad para recapitular todos los tipos de células del tumor, han permitido a los investigadores para abordar cuestiones importantes sobre la biología de esta población de células, que llevan directamente en el tratamiento del paciente [3,6].
Hay evidencia de ambos modelos animales y las enfermedades humanas que los cánceres de pulmón están entre las que se derivan de las células madre similares a [7-10]. Sin embargo, la fuente de células madre (SC) que participan en el desarrollo normal de pulmón, el mantenimiento y la reparación después de una lesión es algo más complicado que los tejidos tales como la piel o el colon (para revisiones ver: [11,12]), donde múltiples "condicional "células madre han sido cree que participan en la reparación de diferentes porciones del pulmón después de la lesión [13]. Estos pueden, o no, ser las mismas células madre responsables de mantenimiento de los tejidos [14]. Se ha sugerido que en los cánceres de pulmón, NSCLC surgen (célula de cáncer de pulmón no pequeñas) adenocarcinomas de SC en la unión alveolar bronquial (BASC), surgen los carcinomas escamosos de SC basal de los bronquios y la tráquea, y carcinomas de células pequeñas surgen de neuroendocrino pulmonar células [11,12].
El carcinoma adenoescamoso (ASC) del pulmón es un subtipo poco frecuente de cáncer diagnosticados NSLC por tumores que contienen tanto células con fenotipos histológicos escamosas y el adenocarcinoma (AC) (definido como & gt; 10% de cada uno). ASC comprende 4-8% de NSCLC, pero es muy agresiva para que los pacientes con ASC tienen un peor pronóstico que los que tienen ya sea de células escamosas o adenocarcinomas [15]. Se ha planteado la hipótesis de que estos tumores surgen ya sea a partir de mezclas de células derivadas de los dos tumores de diferentes tipos, la mutación adicional de un tipo que da lugar a la otra, o un origen monoclonal donde ambos derivan de un común, aún no identificado, precursor [16-19]. Los estudios sobre tumores de ASC de pacientes han demostrado que las células de la adeno y porciones escamosas de un tumor tienen similar, pero, anomalías cromosómicas no necesariamente idénticas [16], o mutaciones [17] sugieren un origen monoclonal para este tipo de tumor. Sin embargo, esto no constituye una prueba de la capacidad de estos dos fenotipos que surgen de una sola célula, y la célula de la ASC podrían originarse permanece sin identificar.
En este reporte se describe madre del cáncer como las células (CSLC ) aisladas de pacientes con ASC utilizando condiciones de cultivo definido libre de suero. Por otra parte, hemos demostrado que estas células tienen las propiedades de auto-renovación, tumorigenicidad y metástasis. Los tumores derivados de estas células, designadas LUCA22 y LUCA35, incluyendo los derivados de células individuales clonados y de las metástasis contenidos ambos componentes con la diferenciación y áreas de diferenciación escamosa glandular (adeno), apoyando un origen monoclonal para este tumor. La propiedades de crecimiento CSLC, la expresión génica y la capacidad para formar estructuras ramificadas en 3D co-cultivo con estroma de pulmón apoyar la hipótesis de que estas células tienen CSLC propiedades similares al tallo. Adicionalmente, los xenoinjertos derivados de estos CSLC contienen células positivas para chromagranin A, mucina 5A, vimentina, la proteína surfactante D, acuaporina 5 y citoqueratinas 5, 7, 14 y 20, que demuestra la capacidad de estas células para experimentar diferenciación multi-linaje. Estos datos sugieren que la ASC son monoclonales en su origen y, posiblemente, se derivan de una célula madre de pulmón primitivo distinto de la célula madre alveolar bronquiolar (BASC) o la célula madre basal de las vías respiratorias superiores.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
tejidos de cáncer de pulmón se obtuvieron a través de la Nacional de Investigación de Enfermedades Intercambio de 1880 John F. Kennedy boulevard, 6th Floor, Philadelphia, PA 19103 (url: http://ndriresource.org/) . IRB institucionales aprobados los protocolos NDRI para la adquisición de tejidos y uso, y el consentimiento informado adecuado se obtuvo de los pacientes por ISRND. No había información disponible que de alguna manera comprometer el anonimato de los pacientes. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El Comité de Cuidado de Animales y el empleo MacroGenics West Institucional aprobó todos los protocolos que utilizan ratones. Toda la cirugía se realizó bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los animales fueron controlados diariamente y los animales enfermos retirados y sacrificados. Todos los animales fueron sacrificados al final del experimento antes de la recogida de tejidos. La eutanasia fue por asfixia con CO2 emitido en un cilindro de gas comprimido.
selección CSLC, expansión y caracterización
tejidos de cáncer de pulmón se obtuvieron a través de la Nacional de Investigación de Enfermedades Intercambio de 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6th Floor, Philadelphia, PA 19103. IRB institucionales aprobaron la protocolos para la adquisición de tejidos y uso, y el consentimiento informado adecuado se obtuvo de los pacientes por ISRND. El cáncer de pulmón derivada líneas celulares se expandieron a partir de ASC y los tumores de corriente alterna (o estroma tumoral) y maestro y bancos de células de trabajo preparados. Se utilizó el análisis de corto repetir tándem (STR) para su identificación.
Las condiciones apropiadas definidas para las células madre /progenitoras normales fetales humanos epiteliales del tejido pulmonar [20] fueron utilizados inicialmente y luego se optimizan empíricamente para el aislamiento y el crecimiento de tejido canceroso como se describe anteriormente [21]. condiciones libres de suero se obtuvieron a que enriquecen para, y permitir la expansión de, una pequeña población de células de ASC y AC (pero no el carcinoma de células escamosas (SCC)) del pulmón. La adición de 1 a 2% de suero a los suplementos hormonales o suplementación con alta 10% (v /v) de suero dio como resultado una población no tumorigénico de las células con potencial de crecimiento limitado
vitro
y las propiedades de las células del estroma . Ver Métodos S1 y el cuadro S1 para los métodos detallados para el aislamiento de las células de los tumores; y los medios de comunicación y las concentraciones de suplementos para la selección, la expansión, la clonación y la diferenciación de la ASC-CSLC definido; y la expansión de las células del estroma. Las condiciones para la diferenciación de las células madre de pulmón en 3 dimensiones Matrigel
TM culturas se modificaron de Delgado, et al como se describe en los métodos S1. Las muestras tumorales y líneas CSLC aislados se caracterizaron comercialmente por sus patrones únicos Short Tandem Repeat utilizando 16 STR regiones. Este análisis se describe en Métodos S1 y S2 resume en la tabla.
El tipo de tumor y la etapa (a partir de los informes de patología) de los 4 CSLC tumor y 3 del estroma culturas CSLC se resumen en la Tabla S3. Cinco líneas celulares ATCC, derivados de AC, SC y ASC uso de los medios que contienen suero, se utilizaron como controles en varios experimentos. Las características de estas líneas se resumen en la Tabla S4
analiza
Genética análisis
La transcriptasa inversa (RT-PCR).
Se aisló el ADN a partir de muestras de animales utilizando el Wizard SV Genomic kit de purificación de ADN siguiendo el protocolo del fabricante (Promega). El ADN humano se cuantificó mediante PCR utilizando cebadores y sondas de genes [22] RPL19 específicos de humanos. Los cebadores se compraron de Biociencias SA como "RT
2 qPCR ensayos de cebador". La lista de los cebadores y los números de catálogo se da en la Tabla S5. Para evaluar la expresión de genes específicos, las reacciones de RT-PCR se realizaron en ADNc generado a partir de ARN total aislado de los cultivos individuales usando CSLC RT² qPCR Primer Ensayos y
GAPDH
(gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) como un gen constitutivamente activa control y RT² SYBR verde /ROX qPCR Mastermix (Qiagen). La expresión de genes seleccionados se determinó también en pulmón humano normal y las células epiteliales bronquiales normales humanos aislados. Ciclo umbral (Ct) para cada conjunto de cebadores se determinó mediante la ejecución de las reacciones de RT-PCR en el sistema ABI PRISM 7000 Sequence sistema de detección (Life Technologies Corporation). DCT para cada gen se determinó como ISC (Ct [gen] - Ct [GAPDH]).., A continuación, Expresión relativa a GAPDH determinado como 2
-DCt
repetición en tándem corto análisis gratis (STR)
dieciséis-locus corto de repetición en tándem (STR) análisis se realizó sobre las muestras de tumor de origen, cuando se disponía de suficiente material de (7/9 de los casos), en el maestro y los bancos de células de trabajo, y longitudinalmente en varios intervalos de cada línea, y sobre los tejidos extirpados de xenoinjertos tumorales de ratón para evaluar identidad. Análisis STR se realizó con el Kit AmpFℓSTR® Identifiler® Amplificación por PCR (Applied Biosystems, Foster City CA). loci amplificados se cargaron en 3730xl de Applied Biosystem Automated Sequencer y se analizaron usando la versión de software GeneMapper de Applied Biosystem 4. MSI-H fue diagnosticado por la presencia de inestabilidad alélica en más de 5 de 15 autosómica loci STR [23].
el análisis de mutaciones.
el análisis de mutaciones en las líneas celulares se llevó a cabo por dos métodos complementarios. Análisis de
KRAS
exón 2,
BRAF
exón 15,
PIK3CA
exones 9 y 23, y la región de la mutación grupo (MCR) de
APC
exón 15 se realizó por secuenciación de ADN genómico amplificado como se ha descrito anteriormente [24,25]. La plataforma de espectrometría de masas MALDI-TOF y el panel OncoCarta se utilizaron para detectar mutaciones en 238 sitios en 19 loci de genes, incluyendo los de arriba, como se describe anteriormente [26].
La citometría de flujo análisis
Las células cultivadas se eliminan con colagenasa /dispasa (Roche Applied Science) o tripsina /EDTA (Invitrogen), se lavaron y se resuspendieron en medio F12 /DMEM (Gibco /Invitrogen) + 1,0% de BSA (Rockland Immunochemicals). Los recuentos de células se obtuvieron utilizando reactivos de guayaba ViaCount (Guava Technologies). Cincuenta mil células viables se dividen en partes alícuotas en de fondo redondo, bajo HTS de unión placas de 96 pocillos (Beckton Dickinson), se incubaron con anticuerpo a 4 ° C durante 20 min., Se lavaron en tampón de análisis, y contra-teñidas, cuando sea necesario, con 2 g /ml GAM-IgG (H + L) conjugado con Alexafluor532 o PE (Invitrogen). Las células se lavaron y, o bien fijadas en tampón de análisis + 0,1% de formaldehído (Polysciences), o re-suspendieron en tampón de análisis, a continuación, se analizaron en un Guava-PCA96 o un FACScan (Becton Dickinson). Los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo (TreeStar Inc.). Los resultados se calcularon como la intensidad de unión (log
10 [manchado] - log
10 [isotipo de control]). Ver Métodos S1 para obtener detalles adicionales. ALDH se evaluó mediante el flujo basado ALDEFLUOR
® ensayo (Stem Cell Technologies) [27] con el sustrato valorada de 1:10 a 1:. 100 dilución
Para el análisis de doble inmunotinción de CK5 /7 unión, placas confluentes de células se disociaron con tripsina al 0,05% /EDTA, se neutralizó con inhibidor de tripsina de soja, y se lavaron por centrifugación. El sedimento resultante se fija en 4% de paraformaldehído (PFA) seguido de permeabilización en 0,1% de Triton-X se añadió 100. antisuero primario a una dilución 1:50 de ratón anti-humano citoqueratina 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459), añadido al mismo tiempo como 0.5μg /ml de ratón anti-citoqueratina humana 5 (BioCare médica,#PM234AA). antisuero secundario fue ml de cabra anti-conejo /1μg Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) añadido simultáneamente con 1μg /ml de cabra anti-ratón de R-ficoeritrina (Life Technologies ™). muestras sin teñir, muestras secundaria de sólo, y controles de la muestra primaria individuales se utilizaron en el análisis.
En vivo tumorigenicidad
líneas CSLC se implantaron bajo la cápsula renal (SRC) de ratones knockout de receptores cadena de ratones NOD SCID inmunológico γ común (NSG) como células de colágeno-incrustado como se describe anteriormente [ ,,,0],22,28] y se dejaron crecer durante hasta 32 semanas. Los animales fueron examinados a 2-8 meses para los tumores y metástasis. Los tumores fueron removidos y embebidos para IHC, o separados de células individuales y se usaron para PCR o análisis de marcadores como se indica.
La inmunohistoquímica
Los tejidos fijados.
tejido de xenoinjerto de tumor resecado fue fijado en formalina neutra al 10% (Sigma), incrustado en un bloque de parafina y las secciones de 5μm cortar. Las láminas fueron des-con parafina y rehidratada, previamente tratada con una solución de recuperación de antígeno (tampón de citrato pH 6) en una cámara de destape (Biocare Médico), y se tiñeron durante 1 hora con indicados anticuerpos anti-humanos (por ejemplo, CD34, CD44) usando el protocolo del proveedor ( Biocare médica). Los portaobjetos se enjuagaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos con HRP de cabra anti-ratón (MACH2, Biocare médico) y sustrato cromógeno diaminobencidina, a continuación, ligeramente a contratinción con hematoxilina y eosina.
Los tejidos congelados.
En las secciones congeladas de pulmón y cáncer de pulmón humano normal, xenoinjertos derivados de LUCA, sedimentos celulares procedentes de cultivos 2D o 3D organoides de la cultura fueron embebidas en OCT, a continuación, se seccionaron a criostato 7 micras. Las secciones seriadas se fijaron en 4 ° C acetona durante 10 minutos, y se secó al aire durante 30 minutos. Los portaobjetos se incubaron en 3% H
2O
2 durante 10 minutos, seguido de dos enjuagues en tampón. 5% de suero de cabra normal se aplicó a los portaobjetos durante 10 minutos después se infla apagado. Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos de ensayo (concentraciones y tiempos de incubación determinados por los protocolos optimizados anteriores) y se lavó dos veces con tampón. Los controles se incubaron con un anticuerpo de control de isotipo correspondiente a cada anticuerpo experimental probado. Después de la incubación del anticuerpo primario, los portaobjetos se incubaron con Dako Envision HRP contra polímero de conejo o ratón durante 30 minutos, seguido de dos enjuagues en tampón. Diaminobencideno tetrahidrocloruro (DAB) se utilizó como cromógeno para visualizar la tinción.
inmunofluorescencia de cultivos monocapa.
Las células fueron cultivadas en cualquiera de cubreobjetos de vidrio o cristal de la cámara de diapositivas (Lab-Tek), a continuación, fija con 4% PFA y se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100. antisuero primario fue 1μg /ml de ratón anti-citoqueratina humana 5 (BioCare médicos,#PM234AA), añadido al mismo tiempo como una dilución 1: 100 de conejo anti-humano citoqueratina 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459). antisuero secundario fue 2μg ml de cabra /anti-ratón Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) Añadido simultáneamente con 2μg /ml de cabra anti-conejo Rodamina Red ™ -X (Life Technologies ™). IgG1 de ratón se usó como un control de isotipo, y secundaria de sólo condiciones se utilizaron para los controles de la tinción no específica. La inmunotinción se visualizó en un microscopio Nikon TE300 con un filtro ET Sedat Quad Set y una cámara CCD Retiga EXi. iVision de software se utiliza para capturar imágenes.
Resultados
LUCA CSLC caracterización
El tejido tumoral, se enviaron en hielo, se recibió de una resección en cuña de los tumores primarios de pulmón. El tejido se dispersó y células cultivadas en placas en condiciones libres de suero (o medios que contienen suero para la expansión de las células del estroma). Este medio definido seleccionan y se expanden una pequeña proporción de las células epiteliales de 3 de 4 adenocarcinomas de pulmón (AC) (LUCA 32, Luca33) y 2 de 2 carcinomas adenoescamosos (ASC) (LUCA22, LUCA35) tejidos. En contraste, no hay culturas exitosas se obtuvieron de muestras de tejido de carcinoma escamoso (4 intentos separadas) utilizando este mismo medio. La adición de suero a la iniciación de los cultivos primarios de los resultados tumorales en el temprano expansión de las células del estroma en 3 de 3 casos (por ejemplo, LUCA11 (1% de suero + hormona aditivos), LUCA36 (10% de suero)), que puede ser ampliado para el paso limitado y en bancos. Estas células estromales tienen una apariencia fibroblástica en el 10% de SFB y no son tumorigénicas cuando se implanta en el 5x10
5 bajo la cápsula sub-renal de un ratón inmunodeficiente.
STR Caracterización y análisis mutacional de los cultivos de células derivadas de tumores
análisis
Breve repetición en tándem (STR) en 16 sitios dio un patrón único para cada una de las 6 líneas, que eran distintas unas de otras y desde cualquier línea de ATCC (ver Tabla S2). Tres de 4 líneas mostraron alguna pérdida de heterozigosidad cuando se compara la muestra de tumor (que incluiría células no tumorales) y la CSLC. Algunos ganancia de heterocigosidad fue visto con extenso pasaje (p47 = & gt; 150 duplicaciones de la población)
Los análisis mutacional reveló que el 100% de la ASC (LUCA22) exposiciones CSLC un único punto de mutación G12V dentro de las regiones codificantes de
KRAS
, sin mutaciones encontradas en
APC
o
PIK3CA
. Las líneas de corriente alterna (LUCA32 y Luca33) también tenían un único punto de mutación en KRAS solamente (G12V y G12C, respectivamente) (Tabla S3).
tumorigenicidad y metástasis
Para probar el potencial tumorigénico, células LUCA22 en varios inóculos (5x10e4, 5x10e3, o 5x10e2) estaban integrados en los botones de colágeno y se implanta debajo de la cápsula sub-renal (SRC) de su sistema inmunológico gravemente los ratones deficientes en GSN. No se observaron tumores en todos los inóculos de células por 31 semanas (Figura 1, Tabla S6). Al mayor de células se observaron metástasis inóculos en múltiples órganos a los 10 semanas después de la implantación SRC. Las metástasis se incrementaron en la distribución y tamaño con el tiempo con todos los animales inoculados con el número de células más alta que muestra metástasis a las 16 semanas o más. Las metástasis se observaron en el hígado, bazo, páncreas, mesenterio, diafragma y, de vez en cuando, en sitios distantes tales como el pulmón y el cerebro (Figura 1). Las células inoculadas subcutáneamente crecieron en los tumores pero no metastatizan (5x10e5, hasta 24 semanas).
Comparación de la morfología y la histopatología del tumor del paciente original de la que se derivó LUCA22 y xenoinjertos y metástasis deriva de la LUCA22 CSLC. Las secciones de los tumores se tiñeron con H & amp; E para mostrar el adenocarcinoma (flechas gruesas) y de células escamosas (flechas finas) morfologías (Top 2 filas, izquierda). Arriba a la derecha 2 filas muestra metástasis en el pulmón y el hígado (flechas) y H & amp; E secciones de estos órganos que presenten nódulos metastásicos (flechas). Las secciones adicionales se tiñen para citoqueratinas 5 (CK5), 7 (CK7) y 18 (CK18), o vimentina (VIM). La fila inferior se doble manchada por el factor de células madre (SCF-marrón) y c-kit (CD117 (rojo). El cuadro de inserción en las esquina inferior derecha muestra crecientes aumentos de células LUCA22 humanos (caja, flechas) que han hecho metástasis de un sub tumor renal al cerebro, manchado para el tumor pulmonar específica Napsin (rojo) /TTF1 (marrón) doble mancha.
un elemento que define los CAC es que pueden formar un tumor de una sola célula y recapitular la morfología del tumor original paciente. para probar si una sola célula podría dar lugar a tumores diferenciados, ocho clones de células individuales derivados de LUCA22 fueron elegidos para la expansión e implantación en el SRC. los tumores crecieron a partir de los 8 clones seleccionados para la prueba (Figura 2 , Tabla S6). Dos de los clones mostró metástasis por 8 semanas
in vivo
. por lo tanto, la línea de LUCA22 es capaz de dar lugar a un tumor metastásico de una sola célula. a continuación comparó los xenoinjertos derivados de LUCA22 ASC al tumor original del paciente mediante IHC para mirar marcadores característicos del ASC.
las células clonadas LUCA22 dan lugar a los xenoinjertos de carcinoma de tinción como adenovirus y escamosas. Los xenoinjertos derivados de la LUCA22 CSLC, 5 LUCA22 clones, y una metástasis del clon 2G1 se muestran tiñeron con H & amp; E, Napsin /TTF1, o p63 /CK5 después de 8 semanas en el animal (A). Los clones que hizo metástasis se indican con *. B. xenoinjertos derivados del tumor del paciente (parte superior) de la LUCA 22 y xenoinjertos derivados de LUCA22 5E11 clon en los tiempos y aumentos indicados. Estas secciones son de doble tinción para CK5 (rojo) y CK7 (marrón).
Análisis comparativo de los pacientes y de xenoinjertos de tumores por IHC
Desde CK5 y expresión CK7 en diferentes partes de un mismo tumor es patognomónica de ASC, se comparó la distribución de CK5 y CK7 tinción dentro del tumor original paciente, xenoinjertos derivados de las células, LUCA22 LUCA22 clones, y metástasis de estos xenoinjertos. LUCA 22 xenoinjertos derivados aparecieron como ASC pobremente diferenciado que se parecía mucho a la histología del tumor original del paciente (Figura 1). Algunas áreas de la tumor tenía la apariencia de un adenocarcinoma y fueron positivos para la tinción CK7, mientras que otras áreas del tumor tenían características de un carcinoma escamoso y se tiñeron positivamente para CK5, reproduciendo así el fenotipo ASC visto en el tumor original paciente. Incluso los tumores derivados de 500 células exhiben el patrón de ASC de tanto CK5 y tinción CK7 (datos no mostrados). Las metástasis en el pulmón y el hígado también contenían células que eran positivas para la tinción de CK5 y CK7 (Figura 1).
Para caracterizar mejor estos tumores, teñidas los tejidos con dos combinaciones de anticuerpos utilizados por los patólogos para diferenciar los adenocarcinomas de pulmón (Napsin A + TTF1) [29] y carcinomas de células escamosas (p63 + CK5) [30]. Se observaron Estos dos conjuntos de anticuerpos para teñir diferentes áreas del tumor parental y los 8 xenoinjertos y metástasis derivadas clonalmente (Figura 2 A, Figura S1). xenoinjertos derivadas clonalmente, dobles teñidas para CK5 y CK7, también se expresaron en distintos, pero las regiones adyacentes del tumor (Figura 2 B). Curiosamente, el tumor del paciente, así como xenoinjertos, expresan CK18, un marcador epitelial y vimentina, un marcador mesenquimal (Figura 1), con la porción del estroma del tumor del paciente, pero no el xenoinjerto, también la tinción positiva con el anti- anticuerpo vimentina humana.
Además, se examinaron los tumores para el factor de células madre (SCF) y su receptor CD117 (c-KIT) y ALDH1A1 [9], proteínas informado a desempeñar un papel en la tumorigénesis de pulmón. Tanto el tumor del paciente y los tumores de xenoinjertos fueron positivos tanto para SCF y CD117, que se encuentra en las zonas adyacentes de la tumor (Figura 1), aunque SCF tinción fue más extenso que CD117 tinción (Figura S2 A). ALDH1A1 también se encontró tanto en el tumor y los xenoinjertos derivados de LUCA22 así como metástasis en el pulmón (Figura S2 A, B) del paciente. El LUCA22 CSLC fueron positivos para la actividad de ALDH, una parte de lo que podría ser neutralizado por el DEAB inhibidor específico ALDH1 (Figura S2 C)
expresión cytokeration en CSLC
Dado que la expresión de CK5 y tanto CK7, dentro de las diferentes áreas del tumor, es característico de la ASC que tinción doble LUCA22 y LUCA35 CSLC monocapas de CK5 y CK7 utilizando rodamina o anticuerpos marcados con FITC. Sorprendentemente, la mayoría de las células eran CSLC CK5 + CK7 positivo doble +. Las células doblemente teñidas parecía tener niveles variables de CK5 y CK7 en las células (Figura 3). Esto también fue el caso de la línea clonal derivada 5E11 (Figura 3 D). La cuantificación de las células teñidas dobles CK5 y CK7 se realizó mediante citometría de flujo de células permeabilizadas, fijados y teñidos (Figura 4 A). Una vez más, la LUCA 22, las células LUCA22 -5E11 y LUCA35 clonados todos eran predominantemente doble positivo para CK5 y CK7. Como controles, cuatro ATCC suero de las células derivadas de líneas fueron doble manchadas para IHC y el análisis de flujo (Ver resultados S1). Ninguno mostró este patrón de tinción doble de la CSLC. Curiosamente, cuando la LUCA22 CSLC (incluyendo clones de células individuales) se permiten para formar tumores la CK5 y expresión CK7 ordena en diferentes poblaciones de células (Figura 2 B). Así, hay CK5 + /CK7-, CK5- /CK7 +, y una pequeña población de células CK5 + + /CK7 en los tumores (Figura S4). La gran población CK5- /CK7- visto en el SQ dispersa y tumores SRC puede estar contaminando las células del estroma murino, ya que no seleccionamos activamente contra estas células para este análisis.
La inmunofluorescencia (paneles AG) y contraste de fases (H) de cultivos en monocapa permeabilizadas teñidas para CK5 (rojo), CK7 (verde), o ambos. se muestran LUCA22 (A-C), el clon 5E11 LUCA22 (D) y LUCA35 (E-G). Los paneles A-C y E-G muestran el mismo campo manchado de forma individual y la superposición de ambos. Panel H muestra el mismo campo que (E-G) una imagen de contraste de fase como. Todas las imágenes son un aumento de 40X.
El panel A es los datos del análisis de flujo del clon LUCA22 permeabilized 5E11 y LUCA 35 células ASC doble tinción para CK5 y CK7. El% de células positivas y registrar la señal de análisis de flujo de las proteínas de la superficie celular (B) se muestra para la CSLC derivado de ASC 2 (LUCA22 (oscuras barras verdes), LUCA35 (verde claro)), la CSLC derivado de AC 2 (LUCA32 ( amarillo), Luca33 (naranja)) y las células del estroma del cáncer de pulmón (LUCA11 (azul oscuro), LUCA36 (azul claro)) en el panel B. La unión de registro (símbolos) y vinculante sobre el control de isotipo ciento (barras) se muestra para cada uno. El panel C muestra una única población que las etiquetas duales con anticuerpos CD24 y CD44 de las células LUCA22 y LUCA35.
La superficie celular marcador análisis
Para caracterizar mejor las poblaciones derivadas de forma selectiva de los tumores de pulmón de células, las células de las líneas 4 CSLC (ASC: LUCA22, LUCA35; CA: LUCA32, Luca33) y 2 líneas del estroma (LUCA11, LUCA36) se analizaron por citometría de flujo para la unión de un panel de anticuerpos a marcadores humanos a menudo se utilizan para seleccionar o identificar, CSLC de tumores sólidos (Figura 4 B). CD44 y CD29 estaban presentes en todas las líneas, incluyendo las líneas del estroma. CD24 estaba presente en todos los 4 de las líneas CSLC, pero no las células del estroma. Ninguna de las líneas consolidadas cualquiera de los anticuerpos monoclonales CD133 que se han reportado para seleccionar para CSC en algunos tumores, aunque la universalidad de CD133 como marcador de células madre en los cánceres de pulmón ha sido cuestionado [12]. La mucina 1 (MUC1) y etapa específica embrionaria antígeno 1 (SSEA1) se expresaron a un nivel más alto en las líneas de corriente alterna que las líneas de ASC mientras ABCG2 se encuentra en LUCA22, pero no las otras líneas. Para buscar la homogeneidad de las poblaciones, el clon LUCA22-5E11 y la línea celular LUCA35 se marcaron doble para CD24 /CD44 (Figura 4 C). El doble etiquetado mostró que una población obligado ambos anticuerpos. Se seleccionaron cuatro clones de LUCA22 y se analizaron en paralelo con la línea parental LUCA22. La unión fue muy similar para los clones y la línea parental para la mayoría de los marcadores con distribuciones unimodales, aunque se observó unión alguna variación en el pico. (Figura S5 A-C). Dado que el marcador de células madre CD117 fue encontrado en sólo una pequeña porción de la CSLC, se intentó para enriquecer en esta población mediante FACS. Después de 4 clases sucesivas, no fuimos capaces de aumentar el porcentaje de células positivas para CD117, lo que sugiere que estas células no representan una subpoblación separables de las células en el CSLC (Figura S5 D).
La expresión génica en líneas CSLC
Para caracterizar más ampliamente la expresión génica en estos CSLC, nos fijamos en un conjunto de 23 genes seleccionados de entre los que según los informes se expresa en los cánceres de pulmón de CA y SCC y tipos de células pulmonares normales diferenciadas por RT-PCR. El patrón de expresión de las líneas de ASC era único en que co-expresada (incluyendo clones) múltiples genes que se consideran característicos de AC y SCC, así como un número de marcadores de linaje normales de pulmón. La expresión de un número de genes era fuertemente regulado hasta en las líneas de ASC en comparación con las líneas de corriente alterna (Figura 5), incluyendo:
MAGEA3, MAGEA6, CSTA, TFPI2
,
KRT5, TWIST1
y
PTHLH
. De estos, sólo la expresión MAGEA3 /A6 se restringió por completo a las células de cáncer de pulmón (& gt; 30X mayor en ASC de AC) y no se ve en absoluto en el estroma del tumor o muestras de pulmón normales. Marcadores de otros tipos de células diferenciadas se expresaron en niveles bajos en el CSLC (
SCGB1A1
, células de Clara;
MUC5AC
, células caliciformes;
AQP5
, neumocitos de tipo I; y
SFTPC
, BASC) o en niveles muy bajos (
SFTPD
, neumocitos tipo II;
CHGA
, las células neuroendocrinas). Como era de esperar, todos estos genes que son marcadores de diferenciación se expresaron en el ARN de control de cualquiera de pulmón normal humano (NH pulmón) o células epiteliales bronquiales humanas (HBE).
Apoyo a la Información
Figura S1.