Extracto
asociados a metástasis gen 1 (MTA1) está altamente asociada con la metástasis de cáncer de próstata humano; sin embargo, las funciones moleculares de MTA1 que facilitan la metástasis no están claros. En este estudio, hemos demostrado que el silenciamiento de MTA1 por los resultados del tratamiento siRNA en la regulación positiva de la expresión de E-cadherina por la fosforilación de AKT (p-AKT) y disminuye la capacidad de invasión de las células del cáncer de próstata. Se demuestra que MTA1 se expresa en más del 90% de los tejidos de cáncer de próstata, especialmente cáncer de próstata metastásico de tejido, en comparación con la no expresión en el tejido prostático normal. análisis de RT-PCR y ensayo de transferencia Western mostraron que la expresión MTA1 es significativamente mayor en las células de cáncer de próstata PC-3M-1E8 altamente metastásico (1E8) que en las células de cáncer de próstata metastásico PC-3M-2B4 mal (2B4). Silenciamiento de la expresión MTA1 por tratamiento siRNA en células 1E8 aumentó los personajes malignas celulares, incluyendo la capacidad adhesiva celular, disminución de la capacidad invasiva celular y cambia la polaridad de citoesqueleto celular. 1E8 células que sobreexpresan MTA1 tenido una reducción de expresión de E-cadherina, mientras que las células tratadas con 1E8 MTA1 siRNA tenían una mayor expresión de E-cadherina. La expresión de la AKT fosforilada (p-AKT) o la inhibición de p-AKT mediante tratamiento wortmanina (100 nM) altera significativamente la función de MTA1 en la regulación de la expresión de E-cadherina. Las alteraciones en la expresión de E-cadherina cambiaron el papel de p-AKT en caracteres malignos celulares. Todos estos resultados demuestran que MTA1 juega un papel importante en el control de la transformación maligna de las células de cáncer de próstata a través de la vía de p-AKT /E-cadherina. Este estudio también proporciona una nueva función mecánica para MTA1 en la regulación de la metástasis del cáncer de próstata
Visto:. Wang H, L Fan, Wei J, Weng Y, Zhou L, Shi Y, et al. (2012) Akt media la metástasis gen asociado 1 (MTA1) La regulación de la expresión de E-cadherina y Promoción de la invasividad de las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (12): e46888. doi: 10.1371 /journal.pone.0046888
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de mayo de 2012; Aceptado: September 6, 2012; Publicado: 5 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973184) (www.nsfc.gov.cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres malignos más comunes y es la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses [1]. El fracaso del tratamiento se produce para el cáncer de próstata a menudo debido a los ganglios linfáticos y /o metástasis órgano distante. Los mecanismos moleculares de la metástasis del cáncer de próstata y la invasión no están bien dilucidado. aumento de la evidencia ha indicado que el gen de la metástasis asociada humana 1 (MTA1) es un factor clave en la metástasis tumoral [2]. Un estudio que utiliza un análisis serológico de bibliotecas de expresión de ADNc recombinante (SEREX) encontró que MTA1 se expresa preferentemente en un panel de tejidos de carcinoma de próstata malignos en comparación con los tejidos normales, lo que sugiere que MTA1 puede ser necesaria para el carcinoma de próstata metástasis [3] Otro estudio encontró que MTA1 fue selectivamente sobre-expresa en cáncer de próstata metastásico en comparación con el cáncer de próstata clínicamente localizado y tejido benigno de la próstata [4]. Estos estudios demostraron que MTA1 puede desempeñar un papel importante en la metástasis de cáncer de próstata; sin embargo, la función mecánica de MTA1 en el proceso de metástasis del cáncer de próstata aún es poco conocido.
MTA1 se identificó originalmente por cDNA diferencial cribado utilizando líneas celulares de cáncer de mama altamente metastásicas [5]. El gen MTA1 codifica una nueva proteína que contiene una región rica en prolina (SH3 de unión a motivo), un putativo motivo dedo de zinc, un motivo de cremallera de leucina y 5 copias del motivo de unión a ADN SPxx [6]. La proteína MTA1 se ha encontrado en el complejo nucleosoma remodelación de la histona desacetilasa (NuRD), que se ha demostrado que modificar o cromosomas remodelación [7]. MTA1 interacciona físicamente con la histona deacetilasa (HDAC), que desempeña un papel importante en la desacetilación de histonas y la alteración de control transcripcional [8]. Como un importante regulador de destino de las células con un papel en la oncogénesis y la progresión de muchos tumores malignos, MTA1 ha atraído la atención general [2].
(A-C) Los resultados típicos para el patrón de tinción MTA1 determinada por inmunohistoquímica se muestran en el tejido normal de próstata (a), localizada tejido de cáncer de próstata (B), y tejido de cáncer de próstata metastásico (C). Los resultados en B y C mostraron una expresión MTA1 en ambos núcleos y citoplasma. El aumento original de A-C es de 200 veces y detallado con vista a mayor escala es 400 veces. (D) Un RT-PCR cuantitativa análisis de los niveles de ARN MTA1 en 2B4 y células 1E8 (arriba). Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células 2B4. (E) Los niveles de expresión de proteínas de MTA1 en 2B4 y 1E8 células se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos específicos, y se cuantificaron los resultados (la parte superior). Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células 2B4. Los experimentos se repitieron tres veces.
Para las células epiteliales se conviertan en células cancerosas, debe producirse la transición epitelio mesenquimal (EMT) [9]. La EMT lleva capas de células epiteliales que perder de polaridad y los contactos célula-célula y desencadena la remodelación del citoesqueleto celular [10], [11]. E-cadherina es considerado como un indicador principal de la aparición de la EMT [12]. E-cadherina juega un papel importante en fenotipos malignos, incluyendo la adhesión celular, la diferenciación celular, y la estructura celular. La regulación al alza de E-cadherina se ha implicado en la inactivación de la EMT [13], [14]. Por lo tanto, E-cadherina se ha sugerido para servir como un fuerte supresor de tumores en el desarrollo del cáncer [14], [15]. desacetilación de histonas y /o la hipermetilación de las islas CpG en la E-cadherina han demostrado ser los principales mecanismos de silenciamiento de E-cadherina en los tumores [15], [16], [17]. MTA1 se ha demostrado que tiene un papel en la desacetilación de histonas, la alteración de la estructura de la cromatina y el control transcripcional [18], [19]. Estos resultados sugieren que MTA1, posiblemente, puede regular la E-cadherina. Por otra parte, MTA1 se ha demostrado que influyen en los fenotipos de EMT [20], [21]. Anteriormente, hemos demostrado que la expresión de cadherina E está regulada positivamente en melanoma y células de cáncer cervical tratado con MTA1 siRNA [22]. Sin embargo, estos estudios no se centraron en el mecanismo de regulación de los cambios en la expresión génica E-cadherina por MTA1. El fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt se cree que juega un papel importante en la progresión del cáncer humano, incluyendo la progresión del cáncer de próstata [23], [24]. MTA1 se ha encontrado para regular la expresión de AKT [25]. Para cambiar el fenotipo maligno de las células cancerosas, la vía MTA1 /AKT puede activar genes y antagonizar genes que suprimen la proliferación y /o célula metástasis. Recientemente, la vía PI3K /AKT se ha demostrado que es un regulador central de la EMT [26], [27]. E-cadherina es también un regulador clave de la EMT y un inhibidor del desarrollo del cáncer que puede ser regulado por la vía PI3K /AKT [28]. En este estudio, hemos demostrado que MTA1 cambia el fenotipo maligno de las células de cáncer de próstata y regula la expresión de E-cadherina por un mecanismo dependiente de la fosforilación de AKT. Este estudio preclínico proporciona una mejor comprensión de las funciones de MTA1 y forma la base para un mayor estudio clínico de MTA1 como un gen diana.
(A) El tratamiento con siRNA MTA1 disminución de la expresión MTA1 eficiente y una mayor expresión de E-cadherina . Los niveles de proteína se analizaron mediante transferencia Western y se normalizaron a beta-actina. Se muestra la cuantificación de las intensidades de las bandas (arriba). Un asterisco (*) o de diamante (◊) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los niveles MTA1 o E-cadherina, respectivamente, en comparación con las células no tratadas y las células siRNA transfectadas de control negativo, n = 3. (B) el tipo de adhesivo se cuantificó mediante el ensayo de MTT, y se muestra un experimento representativo. La capacidad de las células para adherirse a una superficie sólida se upregulated significativamente en las células que habían sido tratados con MTA1 siRNA. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células no tratadas y las células transfectadas con siRNA de control negativo. (C, D, y E) El uso de un TM-revestido sistema transwell Matrigel
, se ensayó la capacidad invasiva de las células tratadas MTA1 siRNA. La cuantificación del número de células invasoras de la parte inferior de los insertos transwell se muestra en el panel inferior. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células no tratadas y las células transfectadas con siRNA de control negativo. (F, G, y H) Los cambios en la estructura del citoesqueleto se detectaron mediante microscopía confocal: tinción con rojo representa α-tubulina. La tinción con azul representa los núcleos. se acortaron los "pies", y la polarización se debilitó en las células tratadas con MTA1 siRNA. Estos cambios indican una capacidad reducida para moverse (400 veces). Un resultado representativo de tres experimentos independientes se muestra para todos los datos.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y colorantes
Todos los reactivos de este estudio fueron de grado analítico y están disponibles comercialmente. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron adquiridos de las siguientes empresas: el anticuerpo MTA1 era de Santa Cruz Biotech, EE.UU.; el anticuerpo E-cadherina era de Epitomics Inc, EE.UU.; la α-tubulina y los anticuerpos de ß-actina fueron de Sigma, Alemania, y el (Ser473) anticuerpo p-AKT fue de Señalización Celular Tecnología, EE.UU.. Las IgG conjugada con fosfatasa alcalina anti-conejo, anti-ratón o anti-cabra también se adquirieron de Sigma. Las IgG FITC y Cy3 conjugados fueron adquiridos del laboratorio PTG, EE.UU.. DAPI (4, dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol, (2 mg /ml de metanol)) se adquirió de Taufkirchen, Alemania. La wortmanina también se adquirió de Sigma.
(a) los resultados de transferencia Western demostraron que el tratamiento con MTA1 siRNA aumento de la expresión de cadherina E después de 48 horas. Un asterisco (*) o de diamante (◊) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los niveles MTA1 o E-cadherina, respectivamente, en comparación con las células siRNA transfectadas de control negativo. (B) Un análisis de transferencia Western demostró también que la transfección transitoria con un plásmido que codifica longitud completa MTA1 disminución de la expresión de cadherina E después de 48 horas. Un asterisco (*) o de diamante (◊) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los niveles MTA1 o E-cadherina, respectivamente, en comparación con las células transfectadas con un vector vacío. Se cuantificaron los cambios (parte superior). Todos los experimentos se repitieron tres veces.
Muestras de tejidos y líneas celulares
Las muestras de tejidos de la próstata normal, cáncer de próstata localizado y cáncer de próstata metastásico se obtuvieron del Departamento de Patología del hospital de Tongji, que está afiliada a la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología. Todos los tejidos de cáncer de próstata metastásico fueron tomadas de pacientes que habían documentado enfermedad metastásica y se les realizó una resección transuretral de la próstata (RTUP) para aliviar una obstrucción urinaria (metástasis a distancia y la gammagrafía ósea positiva, M1 en el tumor-nódulo-metástasis de estadificación TNM) . Este estudio fue aprobado por el comité local de ética de investigación (REC) en el Hospital de Tongji de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología de conformidad con el principio de la Declaración de Helsinki II. Se obtuvieron todos los documentos de consentimiento informado por escrito de cada participante durante la fase de inscripción. La línea de mal metastásico humano adenocarcinoma de próstata PC-3M-2B4 celular (2B4) y el adenocarcinoma de próstata humano altamente metastásico línea celular PC-3M-1E8 (1E8) fueron adquiridos de Profesor Zhengjie (Universidad de Pekín, China). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco-BRL, EE.UU.) con 10% (v /v) de suero bovino fetal (Si Jiqing, Hangzhou, China).
(A) Un análisis de transferencia Western mostró que MTA1 tratamiento con siRNA podría inhibir la fosforilación de AKT después de un tratamiento siRNA 48 horas. Un asterisco (*) y el diamante (◊) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los MTA1 y E-cadherina niveles, respectivamente, en comparación con las células siRNA transfectadas de control negativo. (B) Las células se incubaron con la wortmanina p-AKT inhibidor (100 nM) o DMSO durante varios tiempos desde 24 horas hasta 48 horas, y se extrajeron las proteínas celulares. Un análisis de transferencia Western mostró que el tratamiento wortmanina promovió la expresión de E-cadherina y se inhibe la expresión de MTA1 después de 24 horas. Un asterisco (*), diamante (◊), o un triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en el MTA1, E-cadherina o los niveles de p-AKT, respectivamente, en comparación con las células tratadas con DMSO. (C) El forzada sobre la expresión de p-AKT por transfección transitoria del plásmido myr-AKT disminuyó la expresión de E-cadherina y el aumento de la expresión de MTA1 después de 24 horas. Se muestra la cuantificación de las bandas (arriba). (D) Las células fueron transfectadas con siRNA MTA1 en presencia o ausencia del plásmido myr-AKT o wortmanina durante 48 horas. Se utilizó un análisis de transferencia Western para evaluar los cambios en la expresión de E-cadherina. Un asterisco (*), el diamante (◊), o en el triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en los MTA1, E-cadherina o p-AKT niveles, respectivamente, en comparación con el control negativo siRNA-transfectadas Células. Se muestra la cuantificación de las intensidades de las bandas (arriba). Todos los experimentos se repitieron tres veces.
La inmunohistoquímica
Se realizó un análisis inmunohistoquímico de MTA1 utilizando el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa. Desparafinado y secciones de tejido rehidratadas se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo anti-MTA1 humano monoclonal de ratón a una dilución 1:100 y después se lavaron con PBS. a continuación, se añadió biotina de cabra anti-inmunoglobulina de conejo (DAKO, Kyoto, Japón) a las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después las secciones se lavaron con PBS, a continuación, se aplicó avidina conjugada con peroxidasa (DAKO). La actividad de la peroxidasa se detectó mediante la exposición de las secciones a una solución de 0,05% 3, 3-diaminobencidina y 0,01% H
2O
2 en tampón Tris-HCl (3, solución de 3-diaminobencidina) durante 3 a 6 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina.
(A) Se trataron las células con el plásmido myr-AKT o vector vacío durante 48 horas en presencia o ausencia de E-cadherina siRNA. La capacidad adhesiva se ensayó usando el ensayo MTT, y se muestra un resultado típico experimental. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células transfectadas con un vector vacío. Un triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células transfectadas con el myr-AKT-codificación plásmido en ausencia de E-cadherina siRNA. (B) Las células se incubaron con wortmanina (100 nM) o DMSO durante 24 horas y después se trataron con o sin la E-cadherina siRNA durante 48 horas. Usando el ensayo de MTT, se ensayó la capacidad de adherencia de las células. Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células tratadas con DMSO. Un triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células tratadas con wortmannina en ausencia de la E-cadherina siRNA. (C, D, y E) Las células se trataron con el plásmido myr-AKT o un vector vacío durante 48 horas en la presencia o ausencia del plásmido de E-cadherina. Un sistema transwell TM recubierto Matrigel
se utilizó para analizar la capacidad invasiva de las células. La cuantificación del número de células invasoras de la parte inferior de los insertos transwell se muestra (panel derecho). Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células transfectadas con un vector vacío. Un triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células transfectadas con un myr-AKT-codificación plásmido en ausencia de E-cadherina siRNA. (F, G, y H) Se trataron las células con el plásmido myr-AKT o un vector vacío durante 48 horas en la presencia o ausencia del plásmido de E-cadherina. Los cambios en el citoesqueleto celular se controlaron mediante microscopía confocal. tinción con rojo representa α-tubulina, y tinción con azul representa los núcleos (400 veces). (I, J, y K) Las células se trataron con wortmanina (100 nM) o DMSO durante 24 horas y después se trata con o sin la E-cadherina siRNA durante 48 horas. Un sistema transwell TM recubierto Matrigel
se utilizó para medir los cambios en la capacidad invasiva celular. La cuantificación del número de células invasoras de la parte inferior de la pieza de inserción transwell se muestra (panel derecho). Un asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células tratadas con DMSO. Un triángulo (Δ) indica una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05) en comparación con las células tratadas con wortmannina en ausencia de la E-cadherina siRNA. (L, M y N) se trataron las células con wortmanina (100 nM) o DMSO durante 24 horas y después se trató con o sin la E-cadherina siRNA durante 48 horas. Los cambios en el citoesqueleto celular se controlaron mediante microscopía confocal. tinción con rojo representa α-tubulina, y tinción con azul representa los núcleos (400 veces). Un resultado representativo de tres experimentos se muestra para todos los datos.
RT-PCR e inmunotransferencia
Para el análisis de RT-PCR, el ARN total fue aislado de las líneas celulares utilizando el Trizol reactivo (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), y el cDNA fue sintetizado con M-MLV transcriptasa inversa (Promega, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó con un sistema de amplificación PCR (Biometra, EE.UU.). Los cebadores fueron diseñados utilizando el software Oligo 6, identificados por la alineación herramienta de búsqueda local Básica (BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y compraron de Invitrogen. El primer secuencias mta1 fueron los siguientes: Delantero: 5'-CTCTGCGCATCTTGTTGGACATA -3 'y Reverso: 5'-TCAGCTTCGTCGTGTGCAGATAG -3'. Para un patrón interno, las secuencias de los cebadores de ß-actina fueron los siguientes: Delantero: 5'-GCACCACACCTTCTACAATG -3 'y retroceso: 5'-TGCTTGCTGATCCACATC TG 3'
Para los análisis de Western blot, las células. se lisaron en tampón RIPA (50 mM Tris /HCl, pH 7,2, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,1% SDS, y 0.5% (w /v) de desoxicolato de sodio). cantidades equivalentes de los extractos de células (150 g) se separaron en un 10% de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon en Tris 25 mM (pH 8,0) que contiene NaCl 125 mM, 0,1% de Tween 20, y 5% de leche descremada durante 1 hora y después se incubaron con los anticuerpos primarios (diluidas MTA1: 1:200, E-cadherina y p -AKT: 1:2000 y β-actina: 1:1000) a 4 ° C durante la noche. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, se añadieron los anticuerpos secundarios a una dilución 1:1000. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron con fosfatasa alcalina y tinción con BCIP /NBT.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Para cuantitativa en tiempo real PCR, el ARN total fue aislado de las líneas celulares en reactivo Trizol (Invitrogen , Cergy Pontoise, Francia). la síntesis de ADNc de primera cadena se realizó con un kit de síntesis de ADNc (Amersham Bioscience, NJ). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un sistema ABI PRISM 7700 de detección de secuencias (Applied Biosystems, CA) mediante el uso de un kit de QuantiTect SYBR Green (Qiagen, CA). Los cebadores fueron diseñados utilizando el software Primer Express 3.0, identificado por Básico alineación herramienta de búsqueda local (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y compraron de Invitrogen. Cada muestra se realizó por triplicado. Condiciones para la reacción de PCR cuantitativa fueron como sigue, un ciclo de 50 ° C durante 15 min, un ciclo de 94 ° C durante 2 min, 40 ciclos de 94 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 20 s, y 70 ° C durante 20 s. Al final de la reacción de PCR, las muestras se sometieron a un análisis de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. El primer secuencias MTA1 fueron: Delantero: 5'-GCAGCTGAAGCTGAGAGCAAGTTA-3 '; Reverso: 5'-CCTTGACGTTGTTGACGCTGA -3 '. Las secuencias de los cebadores E-cadherina fueron: Delantero: 5'-TACACTGCCCAGGAGCCAGA -3 '; Reverso: 5 'TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3'; Para el estándar interno, las secuencias de los cebadores GAPDH fueron: Delantero: 5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3 '; Reverso:. ACCCTGTTGCTGTAGCCA 5'-3 '
transfección celular
Las líneas de células se cultivaron en placas de 6 pocillos de cultivo de tejidos o frascos a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador humidificado (Heraeus, Alemania). Para la transfección siRNA, las células se transfectaron con 200 pmol /ml de dúplex de siRNA con 5 l de Lipofectamine
TM 2000 (Invitrogen) cuando las células eran 20% confluentes según el protocolo del fabricante. Los controles incluyeron células no transfectadas y las células que habían sido transfectadas con un control negativo revueltos siRNA (Ruibo, China). Para la transfección del plásmido, 4 × 10
5 células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se transfectaron usando 4 g de plásmido y 10 l de Lipofectamine
TM 2000 por pozo. El plásmido MTA1 de longitud completa (pEGFP-C1 /MTA1) fue proporcionado amablemente por el Profesor Mi Mahoney (Thomas Jefferson University), y el vector vacío (pEGFP-C1) fue preservado por nuestro laboratorio. El plásmido E-cadherina pCMV-SPORT6 se adquirió de YRBIO (China), y el gen de la E-cadherina se subclonó en el vector pcDNA por nuestro laboratorio. El pcDNA myr-HA-AKT2 plásmido (myr-AKT) se adquirió de Addgene (http://www.addgene.org/; Addgene plásmido 9016), y el vector vacío pcDNA también se conservó en nuestro laboratorio. Las células se recogieron 48 h después de la transfección, y los niveles de proteínas se midieron mediante transferencia Western. Las secuencias de siRNA mta1 fueron los siguientes: Delantero: 5 'CCCUGUCAGUCUGCUAUAA dTdT 3' y Reverso: 3 'DTDTGGGACAGUCAGACGAUAUU 5'. Las secuencias de siRNA E-cadherina fueron los siguientes: Delantero: 5'CAGACAAAGACCAGGACUA dTdT 3 'y Reverso: 3' dTdT GUCUGUUUCUGGUCCUGAU 5 '
La invasión de ensayo
Para el ensayo de invasión, 5 ×. 10
3 las células se sembraron en 100 l RPMI 1640 en la parte superior de tereftalato de polietileno (PET) membranas recubiertas con Matrigel
TM (1,5 mg /ml, BD Biosciences) en transwell insertos de cultivo celular (insertos de 24 pocillos , 8 micras de tamaño de poro; Corning Life Sciences, Corning, NY). La cámara inferior se llenó con 600 l de RPMI 1640 que contienen 20% de FBS y el sobrenadante de células NIH3T3 (embrionario línea celular de fibroblastos de ratón) para actuar como un factor quimiotáctico (CF). Las células se incubaron durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO
2. Posteriormente, las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5% (v /v) y se tiñeron con cristal violeta. Las células invasoras en la parte inferior de gel se visualizaron bajo un microscopio (Leica, Alemania) y se cuantificaron contando el número de células en tres campos elegidos al azar con una ampliación de 100 veces.
El ensayo de adhesión en fase sólida
el ensayo de adhesión se realizó mediante el ensayo colorimétrico basado en tetrazolio (MTT). Números iguales de células (4 × 10
4 células por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos que habían sido recubiertas previamente con 1 g /ml de fibronectina (FN) (Sigma, Alemania). Como comparación, un número igual de células también se sembró en placas recubiertas con albúmina de suero bovino (1% w /v). Después de 1 hora, las placas se sumergieron en PBS que contenía MgCl 1 mM
2 para eliminar las células no adherentes. A continuación, se midió el número de células adherentes con el ensayo de MTT y se leyó a 490 nm. Los valores de DO reflejan la proporción de células que se adhirieron a la placa de 96 pocillos recubierta-FN. La tasa de adherencia se calculó mediante la siguiente ecuación: el valor de la DO del experimento /el valor de la DO del control x 100%
imágenes microscopía confocal
Para la tinción de inmunofluorescencia. , se sembraron 1 × 10
4 células en cubreobjetos de vidrio (13 mm de diámetro). Después las células se fijaron con 4% de paraformaldehído en PBS, las membranas de las células se permeabilizaron con 0,2% (v /v) de Triton X-100 en PBS, y los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA al 5% (w /v) en PBS. El primer anticuerpo se aplicó a los portaobjetos a 4 ° C durante la noche (α-tubulina: 1:50, MTA1: 01:20, y E-cadherina: 1:100). Después de la incubación con el primer anticuerpo, las células se lavaron tres veces con PBS frío y se incubaron con FITC o IgG Cy3 conjugado a una dilución 1:50 en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron durante 5 min a temperatura ambiente con DAPI. Las células fueron lavadas con PBS y se observaron con un microscopio confocal (Olympus, Japón).
Co-inmunoprecipitación (Co-IP)
1E8 células crecieron en placas de 10 cm y luego se cosecharon en la no -denaturing tampón de lisis (inhibidores de la proteasa cocktail Tris 20 mM ,, pH 8, NaCl 135 mM, 10% de glicerol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), EDTA 2 mM, Roche completos de mini. Todos los siguientes procedimientos eran llevaron a cabo en el hielo. lisados tampón de lisis-solubles, se recogió después de la extracción durante 4 horas y centrifugación a 12.000 rpm 20 minutos a 4 ° C. en un lisado celular de 1 mg tubo se añadió con anticuerpo MTA1 40 l, y se incubaron durante la noche a 4 ° C . el día siguiente, lisado celular que contiene anticuerpo se aplicaron a perlas de sefarosa acoplados a la proteína G (Abcam) durante 4 horas a 4 ° C. las perlas se lavaron 3 veces en tampón de lisis. Finalmente, se añade el sobrenadante a 25 l 2 × tampón de carga . Western Blot se realizó después de separar las proteínas y los granos con la ebullición.
El análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante un ANOVA. La estadística analyse se ha realizado mediante el programa SPSS versión 13.0.
Resultados
La expresión de MTA1 en el carcinoma de próstata
Para confirmar la expresión de MTA1 en cáncer de próstata humano, una inmunohistoquímica análisis de tinción para MTA1 se realizó en próstata normal, cáncer de próstata localizado y muestras de tejido de cáncer de próstata metastásico (los recursos y los criterios para la designación de tejido se describen en la sección de materiales y métodos). Los resultados revelaron que en las muestras normales de la próstata, la expresión MTA1 era apenas detectable (Figura 1A). Sin embargo, en las muestras de cáncer de próstata localizado, se observó tinción positiva para MTA1 en los núcleos de 6 de los 15 tejidos examinados (Figura 1B). Además, en 27 de los tejidos de cáncer de próstata metastásico 30 tumorales, se observó un alto nivel de tinción MTA1 tanto en el citoplasma y núcleos de las células cancerosas (Figura 1C). Un análisis cuantitativo para la tinción positiva de MTA1 en la Figura 1A-C se muestra en la Figura S1. Una RT-PCR y análisis de transferencia Western se realizaron para medir la expresión de los niveles de ARN MTA1 y proteínas, respectivamente, en PC-3M-1E8 (1E8) y PC-3M-2B4 (2B4) las células [29], [30]. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 1D y E, que demuestran que los niveles de ARN MTA1 y proteínas estaban presentes en ambas líneas celulares pero a diferentes niveles de expresión. Los niveles de expresión de ARNm de MTA1 fueron 0,38 ± 0,01 y 0,83 ± 0,02 para las células 2B4 y 1E8, respectivamente, y los niveles de expresión de proteínas en la 2B4 y células 1E8 eran 0,58 ± 0,04 y 0,83 ± 0,02, respectivamente (p & lt; 0,05, n = 3 para cada uno). Se encontró que las células 1E8 expresan aproximadamente dos veces mayores niveles de ARN MTA1 y 1,5 veces más altos niveles de proteína-MTA1 en comparación con las células 2B4. Por lo tanto, la línea celular 1E8 se eligió para investigar las propiedades biológicas de MTA1 en carcinoma de próstata in vitro.
La influencia de silenciamiento MTA1 en el fenotipo maligno de las células 1E8
Utilizamos siRNA a abajo -regulate la expresión de MTA1 en las células 1E8. Tres pares de siRNAs contra MTA1 fueron diseñados. Verificamos la eficacia del ARNsi por transferencia Western (Figura S2). Al menos se obtuvo una caída del 60% del nivel de proteína MTA 1 utilizando el siRNA-3 #, así que elegimos este par para nuestro estudio más a fondo (Figura 2A). También sobre-expresado MTA1 en el fondo de MTA1 siRNA, que confirmó el efecto traído por siRNA-3#en células (Figura S3). También se analizaron las células siRNA transfectadas para la expresión de la proteína E-cadherina. Un análisis de transferencia Western mostró el nivel de expresión de E-cadherina fue mayor en las células tratadas con siRNA MTA1 (48 horas después de la transfección), lo que indica que MTA1 puede jugar un papel en la regulación negativa de la E-cadherina. A continuación, analizamos la capacidad de adhesión de las células 1E8 siRNA tratados con MTA1 utilizando un ensayo en fase sólida combinado con el ensayo MTT (véase la sección de materiales y métodos). Para la misma concentración con recubrimiento de superficie de FN, la capacidad de adhesión de las células tratadas con ARNsi MTA1 fue significativamente mayor que las células de control. Se muestra una imagen representativa. Los tipos de adhesivos para las células no tratadas, de control negativo siRNA tratados y MTA1 siRNA tratados fueron 40,07 ± 6,23, 50,22 ± 4,99 y 99,62 ± 9,62, respectivamente (p & lt; 0,05, n = 3, la Figura 2B). También estudiamos los efectos de MTA1 en la invasividad de las células 1E8 usando un Matrigel
TM recubierto modelo transwell. Las cantidades de células en la parte inferior de la membrana, lo que refleja la invasividad de las células fueron 597 ± 6,24, 590 ± 5,77 y 201 ± 2,40 para las células no tratadas, negativos de control de siRNA tratados y MTA1 siRNA tratados, respectivamente (p & lt; 0,05, n = 3 Figura 2C-E). Las alteraciones de la organización del citoesqueleto celular y la polaridad también están involucrados en la metástasis de las células tumorales [31] Por lo tanto, se examinaron las estructuras del citoesqueleto de las células siRNA tratados con mta1 por microscopía confocal y se encontró que eran los "pies" de las células siRNA tratados con mta1 acortado y que la polaridad celular se debilitó en comparación con las células control (Figura 2F-H mta1: rojo, núcleos: azul). Estos resultados sugieren, además, que MTA1 puede estar implicada en los fenotipos malignos de células cancerosas, incluyendo la adhesión, invasión, la estructura del citoesqueleto y la polaridad celular.
MTA1 regula la expresión de E-cadherina
Para confirmar el papel de MTA1 en la regulación de la expresión de e-cadherina, las células tratadas con 1E8 MTA1 siRNA y un plásmido de longitud completa MTA1 durante varios tiempos de 24 a 48 horas (nivel de traducción).