Extracto
Fase III de ensayos del factor de crecimiento anti-similar a la insulina receptor (IGF1R) figitumumab anticuerpo -1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes se han suspendido debido a la falta de beneficio en la supervivencia. Se investigó si la inhibición del receptor de insulina altamente homóloga (IR), además de la IGF1R sería más eficaz que la inhibición de la IGF1R solo en la prevención de la proliferación de células de NSCLC. De señalización a través de IGF1R y IR en el NSCLC líneas celulares A549 y Hcc193 fue estimulada por una combinación de IGF1, IGF2 y la insulina. Se fue inhibida por anticuerpos que bloquean la unión del ligando, αIR3 (IGF1R) y IR47-9 (IR), y por los pequeños inhibidores de la quinasa de tirosina molécula de ATP a la competencia AZ12253801 y NVPAWD742 que inhiben tanto tirosina quinasas IR IGF1R y. El efecto de los inhibidores se determinó mediante un ensayo de proliferación independiente de anclaje y mediante análisis de la fosforilación de Akt. En Hcc193 células de la reducción en la proliferación celular y la fosforilación de Akt debido a anticuerpo anti-IGF1R se ha mejorado por la inhibición mediada por anticuerpos de la IR, mientras que en las células A549, con un IR relativamente bajo: relación de expresión IGF1R, no lo fue. En cada una proliferación de la línea celular y la fosforilación de Akt se inhibieron de manera más eficaz por AZ12253801 y que por NVPAWD742 combinado αIR3 y IR47-9. Cuando el IGF1R solo se inhibe, no comprometido de señalización a través de la IR puede contribuir a la continua proliferación de células de NSCLC. Llegamos a la conclusión de que los inhibidores de moléculas pequeñas de orientación tanto en el IR como IGF1R más efectivamente reducen la proliferación de células de NSCLC de una manera independiente del IR:. Ratio de expresión de IGF1R, proporcionando una justificación terapéutica para el tratamiento de esta enfermedad
Visto: Vicente EE, Elder DJE, Curwen J, e Kilgour, Hers I, Tavaré JM (2013) Orientación de células no pequeñas células cancerosas de pulmón por inhibición dual del receptor de la insulina y la insulina factor de crecimiento similar-1 receptor. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10.1371 /journal.pone.0066963
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2013; Aceptado: 14 de mayo de 2013; Publicado: 24 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Vincent et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo descrito fue financiado por subvenciones del Consejo de Investigación médica y AstraZeneca a JMT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Jon Curwen y Elaine Kilgour, son empleados de AstraZeneca y acciones propias en AstraZeneca. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer
pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo con-de células no pequeñas de pulmón carcinoma (CPNM) representa aproximadamente el 80% de todos los casos. La tasa de supervivencia de cinco años en general en Europa es del 8% [1] y la mediana de supervivencia después del diagnóstico es de 4-5 meses si no se trata [2]. La quimioterapia estándar en NSCLC avanzado proporciona sólo mejora marginal en la supervivencia global, sin embargo los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR mejorar la supervivencia en pacientes portadores de activación de mutaciones en el gen EGFR [3]. Otras dianas terapéuticas prometedoras en el CPNM son el linfoma anaplásico de quinasa (ALK), la desacetilación de histonas (HDAC) y el sistema [4].
El sistema IGF desempeña un papel crucial en la regulación de IGF (factor de crecimiento similar a la insulina) del metabolismo energético y el crecimiento [5]. Hay dos receptores de los padres en el sistema IGF que son activos en la señalización; la IGF1R y el receptor de insulina (IR), los cuales existen como homodímeros que comprenden dos receptores '' medio. Debido a la alta homología de secuencia también están presentes como receptores híbridos formados por un medio receptor de la insulina y un medio receptor de IGF1 en células que expresan ambos genes del receptor de [6], [7]. El IR y IGF1R son activadas por la insulina y el IGF-1, respectivamente, sin embargo tercera ligando, IGF-2, se une tanto a la IGF1R y una variante de empalme de la IR llamados IR-A [8]. Una tercera receptor, IGF2R, no tiene propiedades de transducción de señales conocidas y sirve como un receptor de autorización para IGF-2 [9]. proteínas de unión a IGF (IGFBP 1-6) también tienen un papel importante que desempeñar en la regulación de la concentración de ligando libre y la exposición de un ligando a su receptor [10]. En el suero, la mayoría de los circulantes de IGF-1/2 se compleja con IGFBP3. Esto protege a los factores de crecimiento de la degradación pero también puede inhibir su unión a receptores [11]. Cuando es activada por la unión del ligando a los receptores inician la transducción de señales a través de su actividad de tirosina quinasa de cascadas de aguas abajo tales como la vía RAS /RAF /MAPK y la vía PI3K /Akt. Estas vías son responsables de regular los procesadores tales como el desarrollo fetal, el crecimiento y el metabolismo de los tejidos [12].
Como un regulador central del crecimiento y la supervivencia, la desregulación del sistema IGF es común en el cáncer humano (revisado en [13 ]. el exceso de autocrina /producción paracrina de IGF-1 e IGF-2 y /o bajos niveles de IGFBP3 están asociados con un mayor riesgo de cáncer de varios tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama [14], de endometrio [15] y de la vejiga [16]. Los estudios en este área han investigado principalmente el papel del IGF1R. la inhibición de la IGF1R utilizando anticuerpos resultados inhibitorios en una reducción considerable en la proliferación de líneas de células tumorales [17] y se ha encontrado que es hiperactiva en los cánceres incluyendo el de próstata [18], de mama [19 ..], colon [20] y el carcinoma de la vesícula biliar [21] el conjunto de pruebas es tal que se ha llevado a la investigación de inhibidores de IGF1R en más de 70 ensayos oncológicos [22] Estos inhibidores se clasifican en dos clases; anticuerpos monoclonales de orientación el dominio extracelular y los inhibidores competitivos con ATP de molécula pequeña tirosina quinasa diseñados para inhibir selectivamente la IGF1R por encima del IR, pero la actividad que poseen contra ambos receptores.
las preocupaciones que co-inhibición del IR por moléculas pequeñas inhibidores de la quinasa IGF1R tendrían indeseables consecuencias metabólicas han dado lugar a anticuerpos monoclonales IGF1R selectivo siendo favorecido por el desarrollo y utilización en ensayos clínicos. Sin embargo, se ha sabido por algún tiempo que la insulina puede estimular el crecimiento de líneas celulares de cáncer humano [23] - [26], y que 80% de los cánceres de mama sobreexpresan el IR en comparación con el tejido normal de mama [27]. Además, la expresión de la isoforma fetal del IR, IR-A, es elevada en varias malignidades humanas y, en contraste a las señales mediadas por IR-B, que tienen un efecto predominantemente metabólica, IR-A tiene un efecto predominantemente proliferativa [ ,,,0],28]. Zhang et al han demostrado que la regulación a la baja de la IR inhibe la metástasis de células de cáncer de mama en un modelo de ratón atímicos [29], y las investigaciones recientes han comenzado a evaluar el beneficio de la doble inhibición de la IGF1R y IR en modelos de osteosarcoma [30] y en la carcinogénesis pancreática neuroendocrino [31]. En cada caso el IR contribuyó al efecto de supervivencia de células del sistema de IGF y el aumento de la progresión del tumor de múltiples etapas en el sistema neuroendocrino de páncreas. Estos estudios sugieren un papel para el IR en la tumorigénesis.
En CPNM la participación del sistema IGF se apoya en una serie de estudios. El IGF1R se expresa con frecuencia [32] - [34], y los altos niveles bajos de IGF-1 IGFBP3 y se asocian con un mayor riesgo y una mayor gravedad del cáncer de pulmón [35], [36]. IGF1 tiene efectos mitogénicos en algunas líneas celulares de cáncer [37], [38], y IGF2 derivado de fibroblastos promueve el crecimiento de células de NSCLC in vivo [39]. Por lo tanto en el CPNM se ha razonado que la IGF1R puede ser una diana terapéutica viable. En un estudio de fase II de NSCLC avanzado, el tratamiento de primera línea con el figitumumab anticuerpo monoclonal totalmente humanizado IGF1R (CP-751,871) aumentó la tasa de respuesta y el beneficio en la supervivencia libre de progresión de paclitaxel y carboplatino [40]. Sin embargo, la reciente fase III de los ensayos NSCLC figitumumab prueba, ya sea con quimioterapia o el inhibidor de EGFR erlotinib se suspendieron debido a la falta de beneficio en la supervivencia [41]. Dada la evidencia emergente para un papel de la IR en otros tipos de tumores, es posible que esta falta de beneficio clínico de figitumumab en NSCLC era debido, al menos en parte, de la señalización no comprometido a través de la IR.
En el presente estudio hemos determinado si la señalización a través del IR admite proliferación de células tumorales de NSCLC cuando se inhibe la IGF1R. Hemos utilizado anticuerpos monoclonales neutralizantes que se unen selectivamente la IGF1R o el IR, además de inhibidores de moléculas pequeñas de ATP competitivos que a la vez inhiben ambos receptores. Este enfoque también permitió una comparación de las eficacias de anticuerpos e inhibidores de molécula pequeña de orientación del eje IGF-señalización en la inhibición de la proliferación de células tumorales.
Materiales y Métodos
Materiales
AZ12253801 (Astra Zeneca, Macclesfield, Cheshire, Reino Unido), NVP-ADW742 (Selleck químicos, Houston, TX, EE.UU.) y Akti-1/2 (Merck, Darmstadt, Alemania) se hicieron en DMSO (concentración final en los experimentos fue de 0,5% ( v /v)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd, Nottingham) y IR47-9 (amablemente suministrada por Ken Siddle (Universidad de Cambridge, Reino Unido)) se prepararon en PBS. La insulina (Sigma, Poole, Reino Unido), IGF1 (Gro-Pep, Adelaide, Australia) y el IGF-2 (I + amp; D Systems, Abingdon, Reino Unido) se manejan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Anticuerpos: p-Akt S473 y IGFRβ fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Boston, MA, EE.UU.), IRβ de Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y α-tubulina de Sigma. Burro HRP-conjugado anti-IgG de ratón y los anticuerpos IgG anti-conejo eran de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor, ME, EE.UU.).
Cultivo celular y el uso de factor de crecimiento Combinaciones
células A549 fueron de ATCC (Teddington, Reino Unido) y células Hcc193 [42] - [44] eran un regalo de Michael Seckl (Imperial College, Londres). Las líneas celulares se cultivaron de forma rutinaria en "medio de cultivo" que consiste en DMEM (A549) o RPMI (Hcc193) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 20.000 U /ml de penicilina, estreptomicina 7 mM y glutamina 200 mM. Las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada suplementada con 5% (v /v) CO
2.
Para la mayoría de los ensayos descritos, las células fueron expuestas a una combinación de 1 nM de insulina , 50 nM de IGF-1, IGF-2 50 nM (denominado '3GF') con el fin de representar mejor el microambiente tumoral. Aquí la insulina y el IGF son entregados por la circulación y los IGF también son producidas por las células del estroma y del tumor a actuar de una manera autocrina y paracrina y. La concentración de IGF-1 y IGF-2 en 3GF se basó en la que se encuentra en experimentos preliminares para mejorar la proliferación celular en ensayos de crecimiento independiente de anclaje, mientras que tomando en cuenta el aumento de la biodisponibilidad de IGF en el microambiente del tumor debido a la producción local y de las proteasas secretadas-tumorales causando la hidrólisis de las proteínas de unión a IGF [5].
para evaluar el efecto de los factores de crecimiento e inhibidores de la fosforilación de Akt y de la expresión del receptor, las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos experimentales para alcanzar el 90% de confluencia después de 24 h. Se incubaron las células con diversos inhibidores de 2 h en medio libre de suero antes del tratamiento con factores de crecimiento para 10 min. Después de la incubación, la proteína se extrajo a partir de células como se describe anteriormente [45].
independiente de anclaje Ensayo de Crecimiento
A partir de células de cultivo adherentes se tripsinizaron y pasado a través de una aguja 18G para formar una sola célula suspensión. Estas células se suspendieron en 0,4% (w /v) de agar noble en medio de crecimiento que contiene 0,1% (v /v) de FBS y 150μ l de la suspensión por pocillo de una placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One, las células A549: 15000 células /pocillo, células Hcc193: 25000 células /pocillo) durante un capa de base 40 l solidificado de 0,6% (w /v) de agar. Cuando sea necesario, se añadieron inhibidores y factores de crecimiento a las células en el momento de la suspensión en la solución de medio de crecimiento de agar. Los cultivos en suspensión se incubaron durante 5 días en cuyo punto 10% en volumen de se añadió a los pocillos azul Alamar (Serotec, Kidlington, Reino Unido) y los cultivos se incubaron durante 2-5 h. Las células metabólicamente activas convierten Alamar Blue a un indicador fluorescente de modo que la cuantificación de la fluorescencia es una medida del número de células vivas. La fluorescencia se analizó usando un lector de placas Perkin Elmer fusión con filtros de emisión de 544 nm de excitación y 590 nm.
Análisis de transferencia Western
NSCLC lisados celulares (15 mg de proteína) se sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western como se describe anteriormente [45]. En pocas palabras, después de la separación de los lisados utilizando geles de gradiente de 4-12% Bis-Tris (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido), las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Hertfordshire, UK). Las membranas se incubaron con el anticuerpo primario (1 mg /ml) durante la noche antes del lavado y la incubación con los anticuerpos secundarios apropiados para 1 h. Las inmunotransferencias se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL; Amersham Biosciences). Todos los anticuerpos primarios utilizados aquí detectan una banda prominente en el peso molecular predicho de la proteína del anticuerpo se eleva contra. Las imágenes escaneadas de las inmunotransferencias se recortan para ofrecer la banda prominente.
Análisis estadístico
La significación estadística se determinó mediante dos colas no apareada
t
prueba. p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
AZ12253801 Inhibe señalización Aguas abajo del IGF1 R e IR con Igualdad de potencia inhibitoria mientras que los anticuerpos monoclonales (αIR3 y IR47-9) son específicos a su receptor diana.
En este estudio hemos utilizado los anticuerpos inhibidores monoclonales αIR3 y IR47-9, dirigidos a IGF1R [46] e IR [7], respectivamente, y el inhibidor competitivo AZ12253801 pequeña molécula de quinasa ATP que tiene actividad inhibitoria frente a ambos receptores . Se llevaron a cabo experimentos iniciales para evaluar la eficacia y especificidad de αIR3, IR47-9 y AZ12253801 en la línea celular Hcc193 NSCLC. 24 h después de la siembra, las células se trataron con αIR3, IR47-9 (0,5 a 10 g /ml) o AZ12253801 (2-100 nM) y después se estimularon con factor de crecimiento. Se utilizó una concentración baja (5 nM) de factor de crecimiento por lo que los factores activados sólo su receptor afín. La fosforilación de la corriente abajo de serina /treonina cinasa, Akt, en serina-473 (S473) se utilizó como medida de la actividad de señalización de insulina y de IGF1-inducida.
La estimulación con cualquiera de insulina o IGF-1 han causado un aumento la fosforilación de Akt en S473 (Figura 1A). El anticuerpo monoclonal inhibidor IGF1R, αIR3, inhibe IGF-1, pero no la insulina mediada por la fosforilación de Akt. Por el contrario, el anticuerpo monoclonal inhibitorio IR, IR47-9, inhibe la insulina, pero no IGF-1, mediada por la fosforilación de Akt (Figura 1B). Esto confirmó que estos anticuerpos inhiben sólo a sus respectivos receptores a las concentraciones de anticuerpos utilizadas en este estudio. El tratamiento con αIR3 redujo el nivel de expresión del IGF1R (Figura 1A, el panel derecho), lo cual es consistente con observaciones anteriores en la línea celular MCF7 ([47]; Djee, EK, JMT observaciones no publicadas).
se trataron las células ya sea Hcc193 αIR3 (a), IR47-9 (B) o AZ12253801 (C) a las dosis indicadas para 2 h antes de 10 min de incubación, ya sea con 5 nM de insulina o 5 nM de IGF-1. La fosforilación de Akt en S473 y la expresión de IGFRβ y IRβ se determinó por transferencia de Western usando anticuerpos específicos. Un anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas. Todos los anticuerpos primarios utilizados aquí detectan una banda prominente en el peso molecular predicho de la proteína del anticuerpo se eleva contra. Las imágenes escaneadas de las inmunotransferencias se recortan que cuenta con esta banda prominente.
Pre-tratamiento de las células con AZ bloquearon la fosforilación de Akt y la insulina inducida por IGF1 en una forma dependiente de la dosis y con una potencia similar (Figura 1C ). A diferencia de pre-tratamiento con anticuerpos monoclonales inhibidores, AZ12253801 (a 25 nM y superiores) inhibió la fosforilación de Akt a niveles inferiores que en células no tratadas (Figura 1C). Ni αIR3 o IR47-9 lograrse esto incluso en la concentración más alta utilizada (10 mg /ml) o cuando el tiempo de pre-tratamiento (a 2 g /ml) se extendió a 24 h (Figura 1A, B y los datos no se muestra). En contraste con αIR3, AZ12253801 no disminuyó el nivel de expresión del IGF1R.
Combined La inhibición de la IGF1R y Bloques IR crecimiento celular más potente que la inhibición de la IGF1R solo en Hcc193 células
Para investigar una posible contribución de la IR en el apoyo a la proliferación de células tumorales cuando el IGF1R se inhibe, las células Hcc193 NSCLC se cultivaron en condiciones independientes de anclaje en la presencia de IGF1, IGF2 (en concentraciones que activan simultáneamente ambos receptores) e insulina (3GF, ver Materiales y métodos). Los efectos sobre la proliferación de la inhibición de la IGF1R y el IR, solo y en combinación, se determinaron. Como máximo se seleccionaron concentraciones efectivas del inhibidor en base a los datos de la Figura 1.
Figura 2A ilustra los datos de proliferación de células en cultivo Hcc193 independiente de anclaje. 3GF potenció la proliferación de células Hcc193 por 1,6 veces en comparación con la observada con vehículo solo. La inhibición de la IGF1R por αIR3 o el IR por IR47-9 redujo la proliferación observada en presencia de 3GF (proliferación 3GF) por 22% (
p
& lt; 0,0001) y 17% (
p
& lt; 0,01), respectivamente. El bloqueo de tanto el IGF1R y IR con αIR3 y IR47-9 resultó en una reducción del 48% en la proliferación 3GF, un efecto significativamente mayor que el obtenido por el bloqueo de cualquiera de receptor solo (
p
& lt; 1 × 10
-5 en cada caso). El hallazgo de que IR47-9 bloqueado proliferación inducida por 3GF ya sea solo o en combinación con αIR3 sugiere que el receptor de la insulina es directamente capaz de promover la proliferación de células Hcc193.
Hcc193 células (A) se cultivaron en Anchorage- condiciones independientes en 0,1% de suero en presencia de 3GF (1 nM de insulina, 50 nM de IGF-1, 50 nM de IGF-2) solo y en combinación con αIR3 (2 mg /ml), IR47-9 (2 mg /ml) , αIR3 (2 mg /ml) y IR47-9 (2 mg /ml), y AZ12253801 (50 nM), como se indica. Después de 5 días de células viables se estimó por la fluorescencia del producto de la reducción metabólica de Alamar azul. Cada barra representa la media de fluorescencia de cuatro pocillos replicados ± desviación estándar de un solo experimento. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes. ***,
p Hotel & lt; 1 × 10
-5; **,
p Hotel & lt; 0,0001; *,
p Hotel & lt; 0,01 (válido para todas las repeticiones); desapareado
t
prueba de dos colas. las células (B) Hcc193 fueron tratados con αIR3 (2 mg /ml), IR47-9 (2 mg /ml), αIR3 (2 mg /ml) y IR47-9 (2 mg /ml), y AZ12253801 (50 nM) como se indica por 2 h antes de 10 min de incubación con vehículo o 3GF. La fosforilación de Akt en S473 y la expresión de IGFRβ y IRβ se determinó por Western Blot. Un anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas. Todos los anticuerpos primarios utilizados aquí detectan una banda prominente en el peso molecular predicho de la proteína del anticuerpo se eleva contra. Las imágenes escaneadas de las inmunotransferencias se recortan que cuenta con esta banda prominente.
bloqueo simultáneo de la IGF1R y el IR usando AZ12253801 dio como resultado una mayor inhibición de la proliferación (75%) que el obtenido con αIR3 y IR47-9 en combinación (
p Hotel & lt; 1 × 10
-5) (Figura 2A). Esto puede explicarse por el aumento de la eficacia de AZ12253801 en la inhibición inducida por 3GF fosforilación de Akt (Figura 2B). Además, los anticuerpos combinados fueron más eficaces en la inhibición de la fosforilación de Akt que era cada anticuerpo solo (Figura 2B). Por lo tanto, el efecto de los inhibidores sobre la fosforilación de Akt inducida por 3GF, cuando se añade solo o en combinación, en paralelo a su efecto sobre la proliferación inducida por 3GF.
El IGFR a IR ratio de expresión pueden predecir la dependencia de las células en la IR para la supervivencia
a continuación examinó si la expresión relativa de los receptores de IGF1R e IR afectada la capacidad de IR47-9 para inhibir la proliferación de células tumorales o la eficacia comparativa de AZ12253801 y los anticuerpos neutralizantes combinados. Con este fin otra línea NSCLC, se usó A549 como se expresa número aproximadamente igual de IR como células Hcc193 pero significativamente más IGF1R, según lo determinado por cantidades iguales de transferencia Western de lisado (Figura 3A). El análisis densitométrico indica que las células Hcc193 tienen un IR:. ratio de expresión IGF1R ~ 15 veces la de las células A549
(A) Comparación de la expresión de IGF1Rβ y IRβ en Hcc193 y líneas de células A549 se determinó por Western Blot utilizando 15 g de proteína extraída de cada línea celular. (B) células A549 se cultivaron en condiciones independientes de anclaje en 0,1% de suero en presencia de 3GF solo y en combinación con αIR3 (2 mg /ml), IR47-9 (2 mg /ml), αIR3 (2 mg /ml ) y IR47-9 (2 mg /ml), y AZ12253801 (50 nM), como se indica. Después de 5 días de células viables se estimó por la fluorescencia del producto de la reducción metabólica de Alamar azul. Cada barra representa la media de fluorescencia de cuatro pocillos replicados ± desviación estándar de un solo experimento. Los resultados mostrados son representativos de 3 experimentos independientes. ***,
p Hotel & lt; 1 × 10
-6; **,
p Hotel & lt; 0,0001; *,
p Hotel & lt; 0,05 (válido para todas las repeticiones); desapareado
t
prueba de dos colas. células A549 (C) se trataron con αIR3 (2 mg /ml), IR47-9 (2 mg /ml), αIR3 (2 mg /ml) y IR47-9 (2 mg /ml), y AZ12253801 (50 nM) como se indica por 2 h antes de 10 min de incubación con vehículo o 3GF. La fosforilación de Akt en S473 y la expresión de IGFRβ y IRβ se determinó por Western Blot. Un anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas. Las imágenes escaneadas de las inmunotransferencias se recortan para ofrecer la banda prominente.
Las células A549 se cultivaron en las condiciones descritas para Hcc193 (Figura 2). 3GF potenció la proliferación de células A549 por 2 veces sobre la observada para el control del vehículo (Figura 3B). La inhibición de la IGF1R por αIR3 reduce la proliferación estimulada por 3GF por 40% (
p
& lt; 1 × 10
-6) aproximadamente 2 veces la reducción observada en las células Hcc193. En contraste, la inhibición de la IR por IR47-9 tuvo un efecto modesto reducción de la proliferación 3GF por 10% (
p
& lt; 0,05) y, a diferencia con Hcc193 células, la presencia de IR47-9 fallidos para mejorar la efecto de αIR3 sobre la proliferación 3GF (Figura 3B). Por lo tanto en las células A549 el IR es mucho menos eficaz en el apoyo a la proliferación independiente de anclaje que se observa con las células Hcc193. Sin embargo, como se observa con las células Hcc193, el grado de inhibición de la proliferación de células A549 por AZ12253801 fue significativamente mayor que la observada en presencia de la combinación de anticuerpos (p & lt; 0,0001; Figura 3B).
El efecto de los inhibidores en el ensayo de A549 independiente de anclaje fue de nuevo consistente con su efecto sobre la fosforilación de Akt (Figura 3C); αIR3 inhibe la fosforilación de Akt inducida por 3GF, no se observó efecto adicional cuando IR47-9 se combinó con αIR3, y AZ12253801 fue más eficaz que αIR3 (o combinado αIR3 y IR47-9). αIR3 causó una reducción en la expresión de IGF1Rβ pero no de IRβ en células A549 (Figura 3C), como ya se observó en las células Hcc193 (Figura 1 y 2).
inhibición eficaz de la proliferación celular por un IR de moléculas pequeñas /IGF1R inhibidor estructuralmente distinto al AZ12253801
tanto en líneas celulares A549 y Hcc193 AZ12253801 tiene un mayor efecto inhibitorio sobre la proliferación independiente de anclaje que se combina αIR3 y IR47-9. Para investigar si los inhibidores competitivos con ATP de IGF1R /IR proporcionar un modo más eficaz de inhibir la proliferación celular del factor de crecimiento inducido por que los anticuerpos neutralizantes, el efecto de un estructuralmente distinta ATP a la competencia de moléculas pequeñas IGF1R inhibidor /IR NVP-ADW742 en el crecimiento de se evaluó también Hcc193 y A549. dependiente de la dosis NVP-ADW742 reducido 5 células de IGF-1 y 5 nM de insulina estimulada por la fosforilación de Akt en Hcc193 y A549 nm con una concentración eficaz máxima alcanzada en 1 M (Figura 4A).
(A) y Hcc193 las células A549 se trataron con NVP-ADW742 (0,1-3 M) durante 2 h antes de 10 min de incubación con 5 nM de insulina o 5 nM de IGF-1. La fosforilación de Akt en S473 se determinó por Western Blot. Un anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas. (B) células Hcc193 y A549 se cultivaron en condiciones independientes de anclaje en 0,1% de suero en presencia de 3GF solo y en combinación con αIR3 (2 mg /ml) y IR47-9 (2 mg /ml), AZ12253801 (50 nM ), NVP-ADW742 (1 M), o Akti-1/2 (10 mM) como se indica. Después de 5 días de células viables se estimó por la fluorescencia del producto de la reducción metabólica de Alamar azul. Cada barra representa la media de fluorescencia de cuatro pocillos replicados ± desviación estándar de un solo experimento. Los resultados mostrados son representativos de 2 experimentos independientes. ***,
p Hotel & lt; 0,001; **, P & lt; 0,01 (válido para cada experimento); desapareado
t
prueba de dos colas. las células (C) Hcc193 y A549 se trataron con αIR3 (2 mg /ml) y IR47-9 (2 mg /ml) AZ12253801 (50 nM), NVP-ADW742 (1 M) o Akti (10 mM) como se indica por 2 h antes de 10 min de incubación con vehículo o 3GF. La fosforilación de Akt en S473 y la expresión de IGFRβ y IRβ se determinó por transferencia de Western usando anticuerpos específicos. Un anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control para la carga de proteínas.
Figura 4B ilustra la proliferación independiente de anclaje de células Hcc193 y A549, respectivamente, en la presencia de 3GF y el efecto de αIR3 y IR47-9, AZ12253801 y NVP-ADW742 sobre esta. NVP-ADW742 inhibida inducida por 3GF Hcc193 y la proliferación de células A549 en un grado similar a AZ12253801 y a un mayor grado que el observado con una combinación de αIR3 y IR47-9. Esto se reflejó en el mayor grado de inhibición de la fosforilación de Akt por los inhibidores competitivos con ATP en comparación con αIR3 /IR47-9 (Figura 4C)
.
La estrecha correlación entre el efecto de AZ12253801, NVP-ADW742, y αIR3 IR47-9 sobre la proliferación celular y sobre la fosforilación de Akt sugirió que Akt podría contribuir a la proliferación estimulada por 3GF de las células. Para explorar más a fondo se utilizó un inhibidor alostérico selectiva de Akt, Akti-media en Hcc193 y células A549. Akti-media fue tan eficaz como AZ12253801 y NVP-ADW742 en la inhibición de la proliferación celular independiente de anclaje (Figura 4B) y de manera similar eficaces para inhibir la fosforilación de Akt (Figura 4C). Este resultado es consistente con la mediación de Akt proliferación independiente de anclaje de estas líneas celulares aguas abajo de la IGF1R y IR.
Discusión
El IGF1-R tiene un papel bien establecido en la tumorigénesis, sin embargo, la reciente fracaso de la figitumumab anticuerpo monoclonal IGF1-R en los ensayos con CPNM ha cuestionado si la orientación de esta vía solo dará lugar a un beneficio terapéutico. Nuevas evidencias sugieren que la señalización a través de la IR relacionada proporciona un mecanismo por el cual las células tumorales resisten los efectos de la inhibición de IGF1-R en osteosarcoma humano y cáncer de mama. En consonancia con esto, nuestros datos apoyan un posible papel de la IR en la proliferación de líneas celulares de cáncer con una alta IR: Índice de IGF1R. Además aportar pruebas de que el bloqueo dual del IR y el IGF-1R utilizando una pequeña molécula inhibidora IR /IGF-1R ATP-competitiva ha mejorado la eficacia en la inhibición de la proliferación de células NSCLC sobre el obtenido por la inhibición simultánea de la IR y IGF1-R utilizando anticuerpos monoclonales selectivos.
en consonancia con el papel establecido de IGF1 en el apoyo a la proliferación de las células tumorales [17], [30], [31], [38], [48], la neutralización de bloqueo dirigida por anticuerpos del IGF1 -R en cada una de las líneas celulares de cáncer analizadas dio como resultado una inhibición parcial de la proliferación (Figuras 2-4). las células A549 fueron más sensibles que Hcc193 a este respecto que posiblemente refleja la mayor expresión de IGF1R en A549 y el bajo IR resultante: relación de expresión IGF1R. bloqueo selectivo del IR utilizando un anticuerpo específico también redujo la proliferación en cada línea celular. En las células Hcc193, que tienen una relativamente alta IR: relación de expresión IGF1R, el grado de esta reducción fue similar a la causada por la inhibición de IGF1R, pero en las células A549 de la reducción de la proliferación por el bloqueo de la IR fue notablemente menor que la observada en IGF1R inhibición. Estos resultados son consistentes con un informe anterior que muestra que una línea celular de cáncer de mama con alta IR: ratio de expresión de IGF1R (MDAMB231) fue más sensible al bloqueo de IR que una línea celular con un IR baja: ratio de expresión de IGF1R (MCF7) [31]. Supresión de la expresión de IR por la interferencia de ARN también se ha demostrado que inhibe la proliferación celular, la medida en la que esto ocurre varía con el tipo celular y la naturaleza del ensayo [29], [30]. Por tanto, el IR es compatible con proliferación de células tumorales de varios tipos de células, independientemente del IGF1R, y aquí les ofrecemos otras estas observaciones a las células de NSCLC.
inhibición combinada de la IGF1R e IR con anticuerpos monoclonales en la proliferación línea celular Hcc193 reducida a una mayor medida que la inhibición de cualquiera de receptor solo. Esto indica que en NSCLC el IR tiene el potencial de contribuir a la resistencia a la inhibición IGF1R mediante el apoyo a la proliferación celular. Tal un papel para el IR en el contexto de IGF1R objetivo se ha demostrado en un modelo de ratón transgénico de la carcinogénesis neuroendocrino de páncreas y células de cáncer de mama humano [31], y en líneas celulares de osteosarcoma [30]. En ambos estudios IGF2, en lugar de IGF1, se definió como el factor de crecimiento de señalización a través de la IR para causar este efecto protumorigénicos. Esto también puede ser el caso en donde NSCLC IGF2 se conoce para apoyar el crecimiento del tumor [39], [49]. Además, es posible que la insulina en sí puede contribuir a este respecto ya que se ha establecido bien las propiedades mitogénicas [23] - [26] y se incluye, con IGF1 y IGF2, en el medio de crecimiento en el estudio actual. El bloqueo de la IR no para mejorar el efecto de la inhibición de IGF1R en células A549 que sugieren que en los casos de NSCLC donde las bajas proporciones de IR: existen expresión IGF1R, y cuando esas células se exponen a IGF1 además de IGF2 y la insulina, co-dirigidos a la IR puede no ser beneficiosa.
pequeños inhibidores de la quinasa de tirosina molécula tales como AZ12253801, NVP-ADW742 y BMS754807 [50], [51] inhibir tanto la IGF1R y el IR y, como tal, tienen el potencial de ser más agentes anti-neoplásicos eficaces que los anticuerpos contra IGF1R. De hecho, en el presente estudio el efecto de AZ12253801 en células Hcc193 fue consistente con el de la doble IGF1R y bloqueo IR por anticuerpos como el grado de inhibición de la proliferación fue mayor que la observada en el bloqueo del IGF1R solo.