Extracto
El cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales. El aumento de la incidencia y la mortalidad indica que todavía hay mucho que carecen en la detección y manejo de la enfermedad. Esto se debe en parte a la falta de síntomas específicos durante las etapas tempranas de la enfermedad. Varios receptores de factores de crecimiento se han asociado con el cáncer de páncreas. Aquí, hemos investigado si un enfoque de interferencia de ARN dirigida al IGF-IR podría ser eficaz y eficiente contra el crecimiento de cáncer de páncreas y metástasis. Para ello, se evaluaron los efectos de la inhibición de IGF-1R utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNAs) sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en HPAC y PANC-1 líneas celulares de cáncer de páncreas. Encontramos que el silenciamiento de IGF-1R inhibe el crecimiento del cáncer de páncreas y metástasis mediante el bloqueo de las vías de señalización claves tales AKT /PI3K, MAPK, JAK /STAT y EMT. Silenciamiento de IGF-1R se tradujo en un efecto antiproliferativo en líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y HPAC. invasión Matrigel, transwell migración y ensayos de curación de heridas también revelaron un papel para IGF-1R en las propiedades metastásicas de cáncer de páncreas. Estos resultados fueron confirmados mediante análisis de transferencia Western de los productos intermedios clave que participan en la proliferación epitelial, mesenquimal, la migración y la invasión. Además, los ensayos de agar blando mostraron que el silenciamiento de IGF-1R también bloquea la formación de colonias capacidades de células de cáncer pancreático
in vitro.
Transferencias de Western, así como, el análisis de citometría de flujo reveló la inducción de la apoptosis en IGF-1R Las células silenciadas. Curiosamente, silenciando IGF-1R también suprimió la expresión de receptor de insulina β. Todos estos efectos juntos controlan significativamente el crecimiento de células de cáncer de páncreas y metástasis. En conclusión, nuestros resultados demuestran la importancia de IGF-1R en el cáncer de páncreas
Visto:. Subramani R, López Valdez-R, Arumugam A, Nandy S, T Boopalan, Lakshmanaswamy R (2014) Orientación Similar a la Insulina El factor de crecimiento 1 de crecimiento del cáncer pancreático receptor inhibe y la metástasis. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10.1371 /journal.pone.0097016
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Enero, 2014; Aceptado: April 15, 2014; Publicado: May 8, 2014
Derechos de Autor © 2014 Subramani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio recibió el apoyo de Texas Tech University Health Sciences Center Paul L. Foster School de los fondos de Medicina. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer a pesar de que sólo es la neoplasia maligna más común XIII en el mundo [1]. La tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con cáncer de páncreas es la más baja reportada para cualquier tipo de cáncer, que está a menos de 1 [2]%. Esto es principalmente porque el cáncer de páncreas es difícil de detectar en etapas tempranas debido a la falta de señales de alerta temprana o síntomas [1]. Pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC), que es la forma más común de este tipo de cáncer muy agresivo, es altamente invasivo y metastásico y es altamente resistente a todas las formas de las terapias existentes [3]. Los pacientes que son diagnosticados con PDAC en etapas avanzadas tienen pocas esperanzas de resección quirúrgica efectiva [1] y otros tratamientos como la radioterapia, la quimioterapia (gemcitabina, 5-fluorouracilo, cisplatino, paclitaxel, docetaxel, etc.) o terapias dirigidas (Erlotinib con Tarceva) [4] actualmente no ofrecen mucho beneficio tampoco. La naturaleza asintomática de la enfermedad en sus primeras etapas ha asegurado que PDAC sigue siendo un cáncer mortal y casi intratable a pesar de múltiples intentos para encontrar mejores estrategias de tratamiento [5]. De acuerdo con el informe más reciente, aproximadamente 280.000 nuevos casos de cáncer de páncreas se diagnostican a nivel mundial y la incidencia de cáncer de páncreas sigue aumentando [6], [7]. El aumento de la incidencia y la mortalidad indica que todavía hay mucho que carecen en la detección y manejo de la enfermedad. Por lo tanto, es absolutamente necesario encontrar estrategias mejor diagnóstico y terapéuticos para el tratamiento de esta enfermedad.
Varios receptores de factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF-1R), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , etc., se expresan de manera aberrante en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas [8]. El aumento de los niveles de expresión de IGF-1R se asocian con un mayor riesgo de desarrollar diversas neoplasias [9]. El eje de señalización de IGF-1R es muy activa durante las primeras etapas de la carcinogénesis de pulmón, donde el papel de la señalización de IGF-1R se demostró no sólo en la formación de tumor primario, sino también en la progresión a adenocarcinoma de pulmón más agresivo [10]. Jie Tang et al., 2013 informó altos niveles de expresión de IGF-1R en las muestras de tejido tumoral de 25 de 36 pacientes con cáncer de ovario epitelial. También informaron de niveles consistentemente altos de IGF-1 en cultivos de células de cáncer primario (230 ng /ml) en comparación con cultivos de células de ovario normales de tejido (101,9 ng /ml) [11]. la señalización de IGF-1R activa de señalización intracelulares cascadas que incluyen fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K), AKT, Rac y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) [12], [13]. Estas vías regulan genes clave implicados en diversas funciones celulares tales como la proliferación, la supervivencia, la diferenciación, la transformación y la apoptosis [10]. Además, IGF-1R se dirige 70 a 100% de las rutas metabólicas centrales que a menudo están alterados en PDAC patogénesis [14]. Orientación de IGF-1R ya se ha demostrado para mejorar los efectos terapéuticos de los inhibidores de mTOR en el carcinoma de células renales metastásico, [15]. Del mismo modo, en el cáncer epitelial de ovario humano, dirigido a IGF-1R por nucleótidos antisentido proliferación reducida en un 70% y clonogenicidad por 10 veces [11]. Tanto en sistemas in vitro e in vivo, se demostró que un antagonista de IGF-1R (anticuerpo monoclonal MK-0646) para regular significativamente ligada al X inhibidor de proteína de apoptosis (XIAP), que se ha demostrado estar involucrados en la supervivencia celular y la inhibición de la muerte celular en el cáncer colorrectal [16]. Por otra parte, el IGF-1R terapias dirigidas ya han avanzado en la fase I de ensayos clínicos de próstata, mama, colorrectal, el hígado, el sarcoma sinovial, etc., [12], [17] - [19] con resultados iniciales prometedores. Sin embargo, el beneficio potencial del uso de IGF-1R terapia dirigida en el cáncer de páncreas no está totalmente explorado. Además, todavía existe una falta de conocimiento detallado sobre los mecanismos moleculares exactos por los que IGF-1R regula la carcinogénesis pancreática
.
Por lo tanto, en base a la creciente evidencia de la eficacia de la orientación de IGF-1R en un amplio espectro de cánceres , hemos determinado los efectos de la orientación de IGF-1R en el cáncer de páncreas en este estudio. El objetivo final de este estudio es identificar si la señalización de IGF-1R es una diana terapéutica eficaz para el cáncer de páncreas con el potencial de traducirse rápidamente en el uso clínico. Aquí se demuestra claramente que el bloqueo de la expresión de IGF-1R potencia la apoptosis y suprime la invasión celular, la migración y la metástasis a través de la modulación de la vía PI3K /AKT, MAPK y las vías de señalización JAK /STAT en células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos realizados fueron aprobados por y a cabo siguiendo las directrices del Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad de Texas Tech Health Sciences Center.
Líneas celulares y reactivos
líneas celulares ductal de adenocarcinoma pancreático humano, PANC-1 (carcinoma epitelioide), MIA PaCa-2 (carcinoma) y HPAC (adenocarcinoma) se adquirieron de la American Type Culture Collection, y se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10 % de FBS, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de dióxido de carbono.
TransIT- reactivo de transfección siQUEST se adquirió de Mirus Bio (Madison, WI, EE.UU.). El 6,5 mm Transwell de 8.0 micras de poro insertos de membrana de policarbonato se obtuvo de Corning Incorporated (Corning, NY, EE.UU.). BD Matrigel (Bedford, MA, EE.UU.) y BD Pharmingen Anexina V-FITC kit de detección de apoptosis I (San Diego, CA, EE.UU.) se obtuvo de BD Biosciences. BSA se adquirió de Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO, EE.UU.). siRNA dirigidos a IGF-1R se adquirió de Origene (Rockville, MD, EE.UU.). MTS reactivo [3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio] se obtuvo de Promega (Madison, WI, EE.UU.). reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (mPER) se adquirió de Thermo Scientific (Rockford, IL, EE.UU.)
Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados en este estudio:. pAKT (sc-101629), AKT (5298), Bcl 2 (SC-783), Perk, (sc-101760), ERK (SC-94) y STAT3 (H-190) (SC-7179) (Santa Cruz, CA, EE.UU.); IGF-1R (3027), Notch 2 (4530P), Caracol (3879), E-cadherina (3195), N-cadherina (4061), Zeb (3396), vimentina (5741), Slug (9585), Bax (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), p85 pPI3K (4228), p85 PI3K (4292), IR-β (3024), PIRS-1 (2388), el IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), la COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), mTOR (4517), p-p70s6kinase (9206) y p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, MA); Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.); β-actina (Sigma Aldrich, (St. Louis, MO, EE.UU.).. anticuerpos secundarios apropiados se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.)
páncreas adenocarcinoma de tejido de matriz
se obtuvo microarray páncreas tejido adenocarcinoma (TMA) de US Biomax, Inc, Rockville, MD El TMA contiene muestras incluidas en parafina fijadas con formalina de adenocarcinoma de páncreas y tejidos pancreáticos normales se sometió a inmunohistoquímica (IHC) para determinar IGF-1R niveles de expresión. no se requiere la aprobación del Consejo de Revisión Institucional para el uso de las TMA.
la inmunohistoquímica (IHC)
IHC para el antígeno de IGF-1R se ha realizado mediante el páncreas adenocarcionma TMA. TMA se incubaron primero en un horno a 58 ° C durante 2 h para mejorar la adhesión del tejido a los portaobjetos de vidrio cargados. a continuación, desparafinación se llevó a cabo para eliminar el medio de incubación implícito utilizando xileno durante 20 minutos. TMA se rehidrataron gradualmente en baños de alcohol en serie (100, 95, 70, 50 y 30%) seguido de un lavado con agua destilada durante 5 minutos. a continuación, el calor inducido por la recuperación de epítopo con la trilogía (Cell Marque, Rocklin, CA) se realizó para desenmascarar a los sitios antigénicos dentro de las secciones de tejido. TMAs fueron bloqueados en TBS que contiene 1% de suero de ternera fetal y 1% de albúmina de suero bovino durante 15 min. reactivo de bloqueo Perox libre (Cell Marque, Rocklin, CA) también se añadió durante 10 minutos para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. TMA se incubaron con anticuerpo de IGF-1R (dilución 1:50) durante la noche a 4 ° C. Diapositivas luego se lavaron tres veces en PBS durante 5 min y se incubaron con Ultra Marque Polyscan HRP Label (Cell Marque, Rocklin, CA) durante 1 h a temperatura ambiente. entonces TMA se lavaron tres veces en PBS y se tiñeron con solución de cromógeno (Cell Marque, Rocklin, CA) durante 20 min. reacción de tinción de cromógeno se detuvo mediante aclarado con agua destilada. Los núcleos celulares contratinción se realizó con hematoxilina de incubación durante 40 segundos. TMA se enjuagaron con agua destilada y se deshidrataron con baños de etanol en serie (30, 50, 70, 95 y 100%) seguido de un baño de xileno. Por último, TMA se cubrieron con los medios de montaje (Surgipath Medical Industries, Richmond, IL) y las imágenes digitales fueron capturados utilizando una Nikon Eclipse 50i Microscopio-.
El silenciamiento de IGF-1R en PANC-1 y HPAC células
siRNA dirigidos a IGF-1R se transfectaron transitoriamente en células PANC-1 y HPAC usando el reactivo de transfección Mirus Bio TransIT siQUEST. Revueltos siRNA (secuencia no silenciamiento) se utilizó como control. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10
5 células /pocillo. Las células se transfectaron con diferentes concentraciones y diferentes subtipos (A, B y C) de ARNsi que van de 10 a 50 nM durante 48 h o 72 h, usando Mirus siQUEST reactivo de transfección. La relación de siRNA a reactivo de transfección se mantuvo como 1:0.5 para el silenciamiento eficaz sin la toxicidad de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las concentraciones finales de siRNA se eligieron basándose en los estudios de dosis-respuesta. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se utilizaron para el aislamiento de proteínas o clonogenicidad, invasión, y la migración, los estudios. Se estudió la apoptosis a las 48 y 72 horas después de que el silenciamiento de IGF-1R.
viabilidad celular Ensayo
células PANC-1 y HPAC se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 0,3 × 10
4 células /pocillo y 0,5 × 10
4 células /pocillo, respectivamente, y transfectadas con IGF-1R a una concentración final de 30 nM de subtipo "B" y 50 nM de subtipo "a" durante 48 h junto con los controles revueltos. Después de 48 h de transfección, la viabilidad celular se midió usando el ensayo de MTS. La absorbancia se leyó a 490 nm con el fin de calcular las células viables porcentuales.
Ensayo
clonogenicidad /formación de colonias en agar blando
ensayo de formación de colonias se llevó a cabo con el fin de medir la capacidad de supervivencia in vitro de una sola célula para crecer en una colonia en un entorno de crecimiento independiente de anclaje. En pocas palabras, después de la transfección de las células PANC-1 y HPAC con IGF-1R siRNA o revueltos de control durante 48 h, estas células transfectadas se sembraron en medio completo a una densidad de 2 × 10
4 células en placas de 60 mm que contiene una parte superior capa de agar 0,7% y una capa inferior de 1% de agar. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 3 a 4 semanas y luego se tiñeron con 0,2% de cristal violeta. Las colonias de más de 20 células fueron contadas manualmente.
Curación de Heridas Ensayo
Cell la migración de la capacidad de IGF-1R silenciados se midieron células de cáncer pancreático usando el ensayo cero. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3,5 x 10
5 células /pocillo para IGF-1R transfección. A esta densidad, PANC-1 y HPAC células alcanzaron la confluencia monocapa después de 48 × h. a continuación, una herida o rasguño recta fue creado con suavidad en las monocapas celulares con una punta de pipeta estéril. Células desprendidas por el cero se lavaron dos veces con PBS y cultivos se complementaron con medio fresco y monitoreados durante 96 horas a 37 ° C utilizando el Biostation CT (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, EE.UU.) para la observación continua. El Biostation se programa automáticamente para capturar fotografías a intervalos de 2 h hasta las 96 h. migración imágenes fueron capturados y documentados en diferentes puntos de tiempo usando el software de NIS-Elemento AR.
migración y la invasión de ensayo
El efecto del IGF-1R siRNA en las propiedades invasivas de las células de cáncer de páncreas se evaluó usando transwell ensayos de migración e invasión. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células PANC-1 y células HPAC se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de FBS de libre RPMI-1640. Para el ensayo de migración, un total de 5 × 10
3 Las células se sembraron en la cámara superior de la transwell con una membrana no revestido policarbonato (inserto de 6,5 mm de diámetro, 8,0 ìm de tamaño de poro; Corning Incorporated). Para el ensayo de invasión, 2 × 10
4 células se sembraron en la cámara superior de la transwell con una membrana de policarbonato matrigel recubierto (1 mg /ml). medio RPMI-1640 con FBS al 10% se añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de la incubación durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO
2, las células en la superficie inferior de la membrana se fijaron con formalina al 5% y se tiñeron con 0,2% de cristal violeta. Las células no migradas en el lado superior del inserto fueron borradas con un hisopo de algodón. Las imágenes de las células que migraron a la superficie inferior de la membrana fueron capturados en una forma ciega a los 5 campos microscópicos diferentes con 20 × magnificación. El número de células migradas o invadido fue contado a partir de cinco o seis campos seleccionados al azar en una forma ciega. Los experimentos se realizaron por triplicado para la significación estadística.
Análisis de muerte celular
El efecto de IGF-1R de silenciamiento sobre la apoptosis se midió utilizando los I. Células del kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC se cosecharon 48 h y 72 h después de la transfección y luego se tiñeron con yoduro de Anexina V-FITC y de propidio según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de muerte celular o apoptosis se cuantificó usando un citómetro de flujo (FACS Accuri C6) [20].
análisis de transferencia Western
células PANC-1 y HPAC fueron transfectadas con IGF-1R siRNA por 48 h. Después de la incubación, la proteína se extrajo de las células transfectadas mediante lisis de la membrana celular usando proteína de mamífero reactivo de extracción (mPER) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de proteína se cuantificó usando metodología estándar de BSA. Igual cantidad de proteína se cargaron y se separaron mediante geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de BSA en 1 X TBST durante 1 h y se sondaron con un panel de anticuerpos primarios contra pAKT, AKT, Bcl-2, Perk, ERK, STAT3, IGF-1R, Notch 2, Snail, E-cadherina , N-cadherina, Zeb, vimentina, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K p85, p85 PI3K, IR-β, PIRS-1, IRS-1, pSTAT3, la COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 o β-actina. Después de lavar con TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpos con peroxidasa de rábano picante acoplada secundaria y luego bandas positivas se visualizaron usando quimioluminiscencia potenciada.
Análisis estadístico
Las diferencias entre grupos se analizaron por desapareado la prueba t de Student. El software GraphPad Prism versión 5.03 5 paquete se utiliza para hacer todos los cálculos estadísticos. los valores & lt probabilidad; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
IGF-1R es altamente expresado en el cáncer de páncreas
Se examinaron los niveles de expresión de IGF-1R en. líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático (HPAC, MIA Paca-2 y PANC-1) mediante Western blot. Todas las tres líneas celulares tenían un alto nivel de expresión de IGF-1R en comparación con páncreas normal. HPAC tenía la más alta expresión de IGF-1R entre las tres líneas de células pancreáticas que analizados, mientras que Panc1 tenía la menor expresión. Por lo tanto se optó por utilizar HPAC y células Panc1 para todos nuestros experimentos basados en su expresión de IGF-1R (Figura 1A). El análisis inmunohistoquímico de IGF-1R en microarrays de tejido del páncreas adenocarcinoma (TMA) se realiza para confirmar aún más el papel fisiopatológico de IGF-1R en PDAC patogénesis. tejidos tumorales PDAC en varias etapas mostraron un aumento de expresión de IGF-1R en comparación con los tejidos normales de páncreas (Figura 1B).
(A) Los niveles de expresión de IGF-1R en PANC-1, HPAC y MIA PaCa-2 eran en comparación con las células normales de páncreas de rata mediante Western blot. (B) Análisis inmunohistoquímico Representante de IGF-1R por el estadio del tumor en los tejidos de adenocarcinoma de páncreas y el tejido normal del páncreas. (C) PANC-1 y las células HPAC se transfectaron con tres prediseñado IGF-1R siRNAs (A, B y C) a tres concentraciones diferentes (10, 30 y 50 nM) junto con el control revueltos siRNA. Silenciando eficacia de IGF-1R siRNA se determinó mediante Western blot en células HPAC PANC-1 y. (D) Efecto de la IGF-1R siRNA sobre la viabilidad celular de PANC-1 y HPAC. Las células fueron transfectadas con 30 nM y 50 nM de IGF-1R siRNA en PANC-1 y células HPAC respectivamente. La viabilidad celular se ensayó a las 48 h después de la transfección utilizando el kit de ensayo de MTS. Los resultados representan como media ± desviación estándar (n = 3). (E) La inhibición de la expresión de bloques IGF1R capacidades de formación de células de cáncer pancreático, PANC-1 y HPAC colonia. Un ensayo de agar blando se utilizó para estudiar la capacidad de formación de colonias de las células PANC-1 y HPAC. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de ARNsi, se permitió que las células PANC-1 y HPAC de crecer en 0,7% de agarosa en medio RPMI-1640-suplementado con 10% de FBS durante 16 y 22 días, respectivamente. Aquí se presentan las imágenes representativas de la formación de colonias de dos experimentos independientes realizados por triplicado. (F) Porcentaje colonias en ambas células PANC-1 y HPAC se calcularon con control mezclado (SCR) que sirve como línea de base.
El silenciamiento de IGF-1R utilizando siRNAs en líneas celulares de cáncer de páncreas
para silenciar la expresión de IGF-1R, se utilizó 3 siRNAs diferentes en concentraciones que van de 10 a 50 nM. siRNA revueltos que no se dirige ni a ningún gen se utilizó como control. la eficiencia de transfección de ARNsi variar basado en el subtipo y la concentración de siRNA para ambas líneas celulares. Por consiguiente, los niveles de expresión de IGF-1R se redujeron significativamente a una concentración de 30 nM "B" y 50 nM "A" para las células de cáncer de PANC-1 y HPAC, respectivamente (Figura 1C). Por lo tanto, se seleccionaron estos dos dosis siRNA para todos los estudios posteriores.
IGF-1R Silenciamiento induce efecto anti-proliferativo en líneas celulares de cáncer de páncreas
Desde IGF-1R se sabe que estimula la proliferación celular, se examinó el efecto de silenciar IGF-1R sobre la proliferación de células de adenocarcinoma de páncreas. Silenciamiento de IGF-1R se redujo la viabilidad de las células de cáncer pancreático a 48 h después de la transfección en comparación con revueltos siRNA transfectadas las células de control. Sólo 45,24% & amp; 47.28% de células eran viables a la inhibición de IGF-1R en las células Panc1 y HPAC, respectivamente (Figura 1D). El efecto anti-proliferativo de la orientación de IGF-1R es altamente significativo en ambas de las líneas celulares de cáncer de páncreas altamente agresivos. Estos resultados sugieren un papel fundamental para el IGF-1R en la proliferación de células de cáncer pancreático agresivos.
Silenciamiento de IGF-1R inhibe el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer pancreático
potencial de crecimiento independiente de anclaje de las células del cáncer es uno de los rasgos característicos importantes y conocidos de las células transformadas. Se llevaron a cabo ensayos de agar blando en las células PANC-1 y HPAC para evaluar si IGF-1R knockdown colonia influido potencial de estas células formadoras. Silenciamiento de IGF-1R reduce drásticamente la colonia capacidad en ambas líneas celulares de cáncer de páncreas (Figura 1E) de conformación. Los resultados de tres experimentos independientes se cuantificaron, que revela & gt; 85% de inhibición de formación de colonias en la capacidad de IGF-1R silenciado células de cáncer pancreático (Figura 1F)
IGF-1R silenciamiento suprimida la migración de células del cáncer de páncreas /motilidad
(i) herida ensayo de curación.
capacidad de formación de colonias reducida se asocia generalmente con la correspondiente pérdida de la invasión de las capacidades de las células del cáncer [20]. El ensayo clásico de cicatrización de la herida se realizó para probar la función de IGF-1R en la regulación de la capacidad migratoria de células de cáncer pancreático. monocapas de células se rascaron para crear una herida para controlar la capacidad de migrar de tanto de control como de IGF-1R suprimen las células de cáncer de páncreas. IGF-1R suprime las células PANC-1 y HPAC exhibidos reducen capacidades migratorias comparación con los controles revueltos. HPAC revueltos células de control reformaron una monocapa completa dentro de las 48 h y PANC-1 revueltos células de control reformaron una monocapa completa dentro de 96 h. En el IGF-1R suprimido las células PANC-1 y HPAC, una monocapa completa no se reformó incluso después de 96 h (Figura 2A, B & amp; C).
(A) Herida ensayo de curación se realizó para evaluar la migración de las células PANC-1 y HPAC después de silenciar IGF-1R. Cuarenta y ocho horas después de la transfección siRNA, heridas capacidad de las células de curación fueron controlados con automatizado Nikon Biostation CT cada 2 h durante hasta 96 h. (B & amp; C): La migración celular se determinó por la velocidad de las células que se mueven hacia la zona de rayado. La migración porcentaje se calculó mediante el software NIS-Element AR. Resultados similares fueron obtenidos en tres experimentos independientes. (D) Silenciamiento de la expresión de IGF-1R inhibe la migración de las células PANC-1 y HPAC. Cell capacidades migratorias se determinaron utilizando cámaras de Boyden transwell sin recubrir. Se dejó que las células después de la transfección PANC-1 y HPAC a migrar a través de los poros a la superficie inferior de transwell. Las células migradas se fijaron y se tiñeron con 0,2% de cristal violeta en 5% de formalina. Los datos son representativos de cinco imágenes microscópicas de campo tomadas al azar de 20 aumentos (E) se muestra la migración transwell Porcentaje de ensayos para el IGF-1R silenciados células PANC-1 y HPAC a partir de los resultados de tres experimentos independientes.
(ii) ensayo de migración Transwell.
Suprimida la migración de las células HPAC obtenidos mediante el bloqueo de la expresión de IGF-1R PANC-1 y se confirmó mediante ensayos de migración transwell. Una vez más, en comparación con los controles, IGF-1R siRNA transfectadas PANC-1 y las células HPAC mostró una disminución significativa en el número de células que migraron (Figura 2D & amp; E). Esto indica fuertemente que el bloqueo de la expresión de IGF-1R suprime las capacidades migratorias de las dos líneas celulares de cáncer de páncreas agresivos.
Desmontables de IGF-1R Inhibe Cell Invasion
invasión celular es uno de los pasos críticos implicados en la metástasis de células de cáncer. Escape de las células de cáncer de sitio primario de origen a sitios distantes se produce cuando las células adquieren la capacidad de penetrar la membrana basal tumor e invaden en el tejido circundante y, finalmente, en la sangre y los sistemas linfáticos. En vitro matrigel ensayos de invasión Transwell utilizando cámaras de Boyden que imitan la membrana basal interna del microambiente del tumor se utilizaron para investigar el potencial invasor de IGF-1R siRNA transfectadas células de cáncer pancreático. Consistente con la reducción de capacidad migratoria, las células tratadas con IGF-1R siRNA demostraron una reducción significativa en la capacidad de invasión de células de más de 85% en las células HPAC PANC-1y comparación con las células tratadas con siRNA revueltos (Figura 3A & amp; B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que el silenciamiento de IGF-1R no sólo disminuye la capacidad de migración, sino también las propiedades invasivas de las células de adenocarcinoma ductal pancreático.
(A) PANC-1 y células HPAC invasión se evaluó en transwell cámaras recubiertos con matrigel. Las células que invadieron el inserto de Matrigel recubierto de se fijaron, se tiñeron y se capturaron a 20 × magnificación. (B) Número de células invadidas se contaron y se expresa como porcentaje de la invasión. Los experimentos se realizaron por triplicado (C) IGF-1R silenciamiento inhibe la expresión de varios marcadores de la transición epitelio-mesenquimales. Total de lisados de proteínas de control mezclado y el IGF-1R silenciados PANC-1 y se analizaron las células HPAC para la expresión de Notch-2, Caracol, E-cadherina, N-cadherina, Zeb, vimentina, y Slug junto con el control β-actina interna. (D) los valores Densitometic de marcadores de EMT se muestran como expresión%. PS-PANC-1 revueltos, PI-PANC-1 de IGF-1R silenciada, HS-HPAC revueltos, HI-HPAC IGF-1R silenciada.
El silenciamiento de transición de IGF-1R Bloques epitelio-mesenquimal (EMT ) en células de cáncer de páncreas
el proceso de invasión de las células cancerosas se activa de EMT, que es el iniciador de la cascada metastásica [21]. Las células que se someten a EMT alcanzarán propiedades de células madre que aumentan la proliferación celular, la metástasis, etc. [22]. Los factores relacionados con la EMT-como Notch-2, Caracol, N-cadherina, Zeb, vimentina y Slug se redujeron significativamente en el silenciamiento de IGF-1R en las células PANC-1 y HPAC (Figura 3C & amp; D). Curiosamente, el análisis de transferencia de Western en las células suprimidas de IGF-1R mostró un incremento en la expresión de E-cadherina; pérdida de esta molécula de adhesión célula-célula se considera que promueve la invasión y metástasis [23]. Estos datos indican claramente que el silenciamiento de IGF-1R en células de cáncer pancreático como resultado la inhibición de las proteínas que favorecen EMT cáncer de páncreas.
Silenciamiento de IGF-1R induce la apoptosis
regulación de la apoptosis en células de cáncer pancreático se analizó al silenciamiento de IGF-1R utilizando anexina V-FITC apoptosis Kit de detección de flujo I. análisis de citometría mostró una inducción de la apoptosis la muerte pronunciada /célula por el IGF-1R silenciamiento en las células de cáncer de páncreas (45,4%, 55,4% en PANC-1 y 47,7%, se observó un 59,5% en HPAC después de 48 hy 72 h después de la transfección de, respectivamente) (Figura 4A & amp;. B)
(a la inhibición de IGF1 R) induce la apoptosis en Panc1 & amp; células HPAC. Pon transfección las células se tiñeron con yoduro de Anexina-V-FITC y propidio seguido de citometría de flujo. El porcentaje de apoptosis temprana (abajo cuadrante derecho), apoptosis (cuadrante superior derecho), a finales de células apoptóticas y necróticas (cuadrante superior izquierda), y vivir las células sanas (parte inferior izquierda) cuadrante se muestran. (B) Porcentaje de apoptosis y muerte celular se resumen para tres experimentos independientes en las células PANC-1 y HPAC. inhibición (C) IGF-1R induce receptor de muerte mitocondrial y la apoptosis mediada en Panc1 & amp; células HPAC. Bax, Bcl-2, caspasa 8, caspasa 3 y PARP escindida y la expresión β-actina se analizó mediante Western blot en las células PANC-1 y HPAC transfectadas con siRNA IGF-1R. (D) análisis de densitometría Representante muestra potenciación significativa de la apoptosis a través de vías intrínsecas y extrínsecas. PS-PANC-1 revueltos, PI-PANC-1 de IGF-1R silenciada, HS-HPAC revueltos, HI-HPAC IGF-1R silenciada.
Para identificar el mecanismo molecular implicado en esta inducción de la apoptosis , se investigó el patrón de expresión de varias moléculas de señalización de apoptosis en células de cáncer pancreático. Las células transfectadas con IGF-1R siRNA habían aumentado significativamente la expresión de Bax, la caspasa 8, y se escindió Caspase3 PARP en comparación con las células tratadas con ARNsi revueltos (Figura 4C & amp; D). Silenciamiento de IGF-1R también disminuyó la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 tanto en células HPAC (Figura 4C & amp; D) PANC-1 y. Estos datos ponen de manifiesto que el IGF-1R siRNA induce apoptosis a través de las dos vías del receptor de muerte y mitocondrial mediada por la apoptosis.
El silenciamiento de IGF-1R Altera clave moléculas de señalización
La inhibición de un solo miembro de una señalización especial vía o la orientación sólo una función celular particular puede ser insuficiente para el tratamiento de enfermedades complejas como el cáncer. Por lo tanto, la orientación moléculas con el mayor impacto en múltiples vías de señalización oncogénicas tendrá un mayor potencial para el tratamiento de traslación PDAC clínica. En este sentido, se optó por realizar un análisis más exhaustivo de los efectos de IGF-1R silenciamiento en las células y PANC-1 y HPAC han verificado que el IGF-1R no en el hecho de coordinar la regulación de múltiples vías celulares implicadas en la supervivencia, proliferación , metástasis, EMT, la apoptosis y la señalización del ciclo celular (Figura 5)
(a, C & amp; e):. El efecto de la supresión de IGF-1R en la señalización de AKT /PI3K se examinó en las células de cáncer de páncreas. células PANC-1 y HPAC fueron tratados con IGF-1R siRNA durante 48 h. Se recogieron las células y la expresión de fosfo-AKT, AKT, fosfo-PI3K, PI3K, fosfo-PTEN, fosfo-mTOR, mTOR, fosfo-p70s6kinase, p70s6kinase y el control de β-actina interna se midió por transferencia de Western. (B, D & amp; F): El análisis densitométrico también se muestran a la derecha de cada imagen representativa
AKT es una de las moléculas más constitutivamente expresado en muchos tipos de cáncer y se ha demostrado para mejorar maligno. la proliferación celular [24].