Extracto
Antecedentes
microARN-34a (miR-34a) es una transcripción diana de p53 y es el regulado en el cáncer de páncreas. Este estudio tuvo como objetivo investigar la importancia funcional de miR-34a en la progresión del cáncer de páncreas a través de su restauración epigenética con moduladores de la cromatina, agente de desmetilación 5-Aza-2'- desoxicitidina (5-aza-DC) y el inhibidor de HDAC vorinostat (SAHA).
Metodología /Principales conclusiones
Re-expresión de miR-34a en las células madre del cáncer de páncreas humano (CSC) y en líneas celulares de cáncer de páncreas humano tras el tratamiento con 5-aza-dC y SAHA inhiben fuertemente la proliferación celular, la progresión del ciclo celular, la auto-renovación, transición epitelio mesénquima (EMT) y la invasión. En células madre cancerosas pancreáticas, la modulación de miR-34a induce la apoptosis mediante la activación de la caspasa-3/7. El tratamiento de células madre cancerosas pancreáticas con los agentes moduladores de la cromatina como resultado la inhibición de Bcl-2, CDK6 y SIRT1, que son los supuestos objetivos de miR-34a. MiR-34a regulación al alza por estos agentes también inducida por p53 acetilado, p21
WAF1, p27
KIP1 y PUMA en células madre cancerosas pancreáticas. La inhibición de miR-34a por antagomir anula los efectos de la 5-aza-DC y SAHA, lo que sugiere que el 5-aza-DC y SAHA regulan las características de células madre a través de miR-34a. En los CAC, vía Notch inhibe SAHA, lo que sugiere su supresión puede contribuir a la inhibición de la capacidad de auto-renovación y la inducción de la apoptosis. Curiosamente, el tratamiento de células madre cancerosas pancreáticas con SAHA dio lugar a la inhibición de la EMT con el transcripcional sobre regulación de la E-cadherina y la baja regulación de la N-cadherina. La expresión de los inductores de la EMT (ZEB-1, caracoles y babosas) fue inhibida en células madre cancerosas tras el tratamiento con SAHA. 5-aza-DC y SAHA también retardar
in vitro
la migración y la invasión de las células madre cancerosas.
Conclusiones
El presente estudio demuestra así el papel de miR-34a como una crítica el regulador de la progresión del cáncer de páncreas en las características de regulación de CSC. La restauración de su expresión por la 5-aza-DC y SAHA en los CAC no sólo proporcionará una visión mecanicista y dianas terapéuticas para el cáncer de páncreas, pero también la promesa de reactivos para impulsar la respuesta del paciente a quimioterapias existentes o como un medicamento contra el cáncer autónomo mediante la eliminación de las características de CSC.
Visto: Nalls D, Tang SN, Rodova M, Srivastava RK, Shankar S (2011) Orientación de la regulación epigenética de miR-34a para el tratamiento del cáncer pancreático por la inhibición del cáncer pancreático Stem Cells. PLoS ONE 6 (8): e24099. doi: 10.1371 /journal.pone.0024099
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Junio, 2011; Aceptado: 31 de julio de 2011; Publicado: 31 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Nalls et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos nacionales de la Salud (R01CA125262, RO1CA114469, 3R01CA114469-05S1, y 3R01CA125262-03S1), Autoridad de Biociencia de Kansas, y la Fundación de cáncer de mama Susan G. Komen. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos y es una enfermedad devastadora invasivo y uno de los cánceres más agresivos [1]. El mal pronóstico de adenocarcinoma de páncreas se atribuye a su presentación tardía, la falta de biomarcadores precisos para el diagnóstico precoz de la posibilidad de la resección curativa, así como la propensión de las metástasis temprana. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas modalidades de diagnóstico para el diagnóstico precoz y las nuevas estrategias terapéuticas.
Los microARN (miRNA) son endógenas, no codificante ARN pequeños de 19-25 nucleótidos de longitud, que ahora son reconocidos como importantes reguladores de la transcripción de genes de post expresión [2], [3], [4]. La capacidad de miRNAs para regular múltiples genes que se ajustan a desempeñar un papel importante en los procesos biológicos que la progresión del tumor efecto incluyendo la migración, invasión, transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la metástasis [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. MiRNAs son muy prometedores como biomarcadores tempranos, indicadores de pronóstico y dianas terapéuticas basadas mecanismo para tratamientos contra el cáncer [11], [12], [13], [14], [15] porque sus expresiones aberrantes están relacionados con las células madre del cáncer (CSC) desregulación y por lo tanto la oncogénesis [16].
las células madre del cáncer dan lugar a la mayor parte del tumor a través de auto-renovación y diferenciación [17] continua. Células madre cancerosas pancreáticas son altamente tumorigénicas y la auto renovación subpoblación que expresan el CD133 marcador de superficie celular + /CD44 + /CD24 + /+ ESA [17], [18], [19]. Se están desarrollando estrategias dirigidas hacia la destrucción de estas células madre tumorales sin afectar a las células madre fisiológicos, que pueden conducir a una mejora notable en la evolución del paciente. Al alterar la expresión de miRNAs específicos que pueden desempeñar un papel importante en la renovación CSC pancreática y por lo tanto pueden contribuir al desarrollo de carcinoma de páncreas, ayudaría a lograr una eliminación selectiva y específica de las células madre cancerosas pancreáticas. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan la autorrenovación es de la mayor importancia para el descubrimiento de fármacos anticancerígenos dirigidos células madre cancerosas.
TP53 es un importante gen supresor de tumores cuyos efectos biológicos se deben en gran parte a su función como regulador transcripcional [20 ]. TP53 mutaciones son relativamente comunes y ocurren en hasta el 70% de los casos con adenocarcinoma pancreático y se observa con mayor frecuencia en los tumores pobremente diferenciados [21], [22], [23], [24], [25]. El supresor de tumores TP53 ha sido identificado como un regulador transcripcional de miR-34a y varios estudios recientes han implicado la familia miR-34 de miRNAs en la red supresor de tumores p53 [20], [26]. miR-34a es altamente expresado en los tejidos normales, como los testículos, pulmón, glándula adrenal y el bazo, aunque su función fisiológica es desconocida. miR-34a se localiza en el cromosoma humano 1p36, que es una región asociada con una variedad de tipos de cáncer, y se ha demostrado que ser reguladas por el cáncer de páncreas [20]. La reducción de expresión de miR-34a en el cáncer de páncreas podría ser una resultante de cualquiera de regulación transcripcional debido a las mutaciones de p53, ya que son muy frecuentes [22] o mediante el silenciamiento epigenético. Por lo tanto, la comprensión de las contribuciones de estos mecanismos en la regulación a la baja de miR-34a en el cáncer de páncreas, que pueden contribuir a la enfermedad maligna del páncreas, podría ser de relevancia.
miR-34a actúa como un supresor del neuroblastoma tumorigénesis por la orientación del ARNm que codifica E2F3 y la reducción de los niveles de proteína E2F3 [27]. También se ha demostrado que es hiper-metilado en mama, ovario, colon, pulmón y tumores malignos hematológicos y regular a la baja traducción CDK6 lo que demuestra la función supresora de tumores de miR-34a [28], [29], [30]. Los genes de respuesta miR-34a son altamente enriquecido para las que regulan la progresión del ciclo celular, la proliferación celular, apoptosis, reparación del ADN, y la angiogénesis proporcionando de este modo una base funcional para la inactivación epigenética de este miARN en el cáncer de páncreas [31].
está bien establecido que muchos genes supresores de tumores en los cánceres humanos son silenciados por la metilación del promotor acompañado por alteraciones de cromatina debido a la contratación de deactylases histonas por proteínas de unión a CpG metilado residuos. Estos marcadores epigenéticos asociados con el silenciamiento de genes supresores de tumores pueden contribuir en la progresión tumoral y pueden ser terapéuticamente reversible, sirviendo como objetivos para el tratamiento del cáncer de páncreas. Partiendo de esta premisa, se cuantificó la expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas humanas y líneas celulares de cáncer de páncreas, independientemente del estado de la mutación de p53, en comparación con las células epiteliales ductales pancreáticas normales usando ensayos TaqMan miARN.
señales Notch son sabe que afectan selfrenewal y la diferenciación celular del tallo, y se ha sugerido que desempeñar un papel durante la carcinogénesis pancreática [32], [33]. Varios miembros de la ruta de señalización Notch se expresan en el páncreas [32]. Los receptores Notch son activados por Delta y Serrate /ligandos dentados [34], que promueven la escisión proteolítica y la liberación del dominio intracelular Notch (ICD). El activado Notch-ICD se transloca en el núcleo e interacciona con el factor de transcripción CSL /RBP-Jκ y el co-activador Mastermind (MAM) para activar genes diana tales como Hes1 y Hes5 [35], [36], y la expresión Hes puede por lo tanto, ser utilizado como una lectura de la actividad de Notch [37].
Nuestros estudios actuales han revelado que los niveles de expresión de miR-34a se redujeron significativamente en células madre cancerosas y las células tumorales pancreáticas cáncer de páncreas, independientemente de su estado mutacional de p53, en comparación con las células epiteliales ductales pancreáticas normales. Esto nos lleva a la hipótesis de que el miR-34a, por lo tanto puede ser silenciado epigenético en cáncer de páncreas. Reducción de la metilación del gen miR-34a y el patrón de acetilación alterada por el uso de agentes modificadores de la cromatina resultó en la reactivación concomitante de la expresión de miR-34a. La expresión de miR-34a en células madre cancerosas y líneas de células de páncreas se indujo significativamente en el tratamiento con modificadores de la cromatina, agente de desmetilación 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC) o el inhibidor de la histona desacetilasa, SAHA (vorionostat). 5-Aza-dC y SAHA también inhibió el crecimiento y la apoptosis inducida en células madre cancerosas pancreáticas. Además, para comprender el papel funcional de miR-34a en la regulación de la progresión del cáncer de páncreas se examinó el efecto de 5-aza-DC y SAHA en la expresión de la proteína de los supuestos objetivos de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas. 5-Aza-dC inhibió la expresión de la ciclina D1 y CDK4 y por el contrario indujo la expresión de p27
/KIP1, y estos efectos fueron abrogadas en presencia de antagonista de miR34a. Del mismo modo, SAHA el regulado la expresión de SIRT1, ciclina D1, survivin, Bcl-2, VEGF y CDK6, y hasta regulado la expresión de p21 y PUMA de una manera dependiente de la dosis. Además, el tratamiento de células madre cancerosas pancreáticas con los modificadores de la cromatina dio lugar a la inhibición de la auto-renovación, EMT, la migración y la invasión de células madre cancerosas pancreáticas
in vitro
. La modulación de la expresión de miR-34a por SAHA inhibió la expresión de ARNm de varios componentes de la vía de Notch, lo que sugiere que miR-34a puede estar implicado en pancreático CSC auto-renovación. Zeb-1, caracoles y babosas expresión transcripcional se redujo significativamente en células madre cancerosas pancreáticas humanas y líneas celulares de cáncer de páncreas tras el tratamiento con SAHA. Nuestros resultados demuestran que el miR-34a podría desempeñar un papel importante en la regulación de la tumorigénesis pancreática. Esto es hasta el momento, la primera demostración de la inhibición de las características de páncreas CSC mediante la modulación epigenética de miR-34a por la intervención terapéutica utilizando 5-aza-DC y SAHA. Por lo tanto, la restauración de la expresión de miR-34a por 5-aza-DC y SAHA en células madre cancerosas pancreáticas proporcionará no sólo herramientas únicas para la investigación de los genes miARN función, sino también la promesa de reactivo para impulsar la respuesta del paciente a quimioterapias existentes o como medicamento contra el cáncer independiente.
resultados
expresión y restauración de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas y líneas celulares
en primer lugar, mide la expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas humanas derivadas de tumores primarios y el cáncer de páncreas líneas celulares [ASPC-1 (p53wt) y MiaPaCa-2 (p53mutant)] y se compararon con las células epiteliales ductales pancreáticas normales usando reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR-Taqman) y Taqman Tiempo real ensayos. Se utilizó el método comparativo Ct (ΔΔCt) para determinar el cambio de expresión pliegue de miR-34a en las células de cáncer de páncreas en comparación con las células epiteliales pancreáticas normales. Entrada total de ARN se normalizó sobre la base de los valores de Ct obtenidos para RNU48 utilizado como control endógeno. De acuerdo con estudios anteriores en el cáncer de páncreas [20], se observó una disminución global de la expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas y líneas de células independientes de su p53 estado mutacional relativa a las células epiteliales pancreáticas no neoplásicas (Fig. 1A).
(a) expresión relativa de miR-34a se cuantificó en líneas celulares de cáncer de páncreas humanos ASPC-1 (p53wt), MIAPaCa-2 (p53mutant), las células humanas pancreáticas madre del cáncer (PanCSC) y del epitelio normal ductal pancreático humano células (HPNE). (B) Restauración de miR34a por SAHA y Aza-5DC. líneas celulares de cáncer pancreático ASPC-1 (p53wt), MIAPaCa-2 (p53mutant) y células madre de cáncer de páncreas se trataron con SAHA (3 M) o Aza-5DC (4 M) durante 24 h. La expresión de miR-34a se cuantificó utilizando la reacción en cadena de la transcriptasa inversa cuantitativa de la polimerasa (RT-PCR-Taqman) y Taqman Tiempo real ensayos, y normalizado a RNU48 expresión. Los datos representan la media ± SD. * = Significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (C), Anti-miR34a inhibe la capacidad de SAHA y Aza-5DC para restaurar miR34a. CSC pancreáticas fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de control negativo (codificado) o anti-miR34a oligonucleótido, y se trataron con SAHA (3 M) o Aza-5DC (4 M) durante 24 h. Se extrajo el ARN para medir la expresión de miR34a por Q-RT-PCR como se describe anteriormente. NC = control negativo. (D), la actividad de reportero miR34a-luciferasa. CSC pancreáticas fueron transfectadas ya sea con el control negativo (codificado) o oligonucleótidos antisentido de miR34a junto con miR34a-Luc construir, y tratados con SAHA (1 M) o Aza-5DC (2 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. * = Significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05
Mir-34a está estrechamente asociado con una gran isla CpG que sugiere que puede ser silenciado epigenético en cáncer de páncreas. Para probar esta hipótesis, hemos examinado si la reducción de la expresión de miR-34a en el cáncer de páncreas podría ser restaurada tras el tratamiento con un inhibidor de la metilación del ADN, 5-aza-DC y /o un inhibidor de la histona deacetilasa, SAHA. Curiosamente, la expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas y líneas celulares de cáncer de páncreas [ASPC-1 y MiaPaCa-2] se incrementó significativamente después del tratamiento con estos cromatina modificadores en comparación con los controles tratados mock, medido por qRT-PCR (Fig. 1B) usando Tiempo real TaqMan ensayos usando método comparativo Ct (ΔΔCt). Entrada total de ARN se normalizó sobre la base de los valores de Ct obtenidos para RNU48. Estos resultados demuestran que el 5-Aza-dC y SAHA induce la restauración de miR-34a en las células de cáncer de páncreas. Los datos también sugieren que la modificación epigenética de secuencias reguladoras en las islas CpG y la desacetilación de las histonas puede contribuir al silenciamiento miR-34a en el cáncer de páncreas. Además la inhibición de miR-34a por antgomiR anula los efectos de la 5-aza-DC y SAHA en la restauración de la expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas que sugieren que el 5-aza-DC y SAHA regulan la característica de células madre a través de miR-34a ( Fig. 1C).
a continuación examinó la regulación transcripcional de miR-34a en células madre cancerosas mediante ensayo de indicador de miR-34a-luciferasa (Fig. 1D). SAHA y 5-aza-DC inducida por la actividad de miR-34a-luciferasa, lo que sugiere un papel funcional de miR34a en células madre cancerosas pancreáticas.
Regulación al alza de miR-34a inhibe la proliferación celular, e induce la apoptosis y la detención del ciclo celular en pancreática humana los CCC
Hemos investigado el efecto de 5-aza-dC y SAHA sobre la proliferación de células madre cancerosas pancreáticas mediante tinción con azul de tripano. 5-Aza-dC y SAHA inhiben significativamente la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis en células madre cancerosas pancreáticas (Fig. 2A). Además, se examinaron los efectos de estos moduladores de la cromatina en la inducción de apoptosis y la caspasa-3/7 actividad en células madre cancerosas pancreáticas por anexina-V y tinción PI, y kit de ensayo de la caspasa-3/7 actividad, respectivamente. 5-aza-DC y SAHA inducen apoptosis en células madre cancerosas en una forma dependiente de la dosis que se asoció con un aumento de la actividad de caspasa-3/7 (Fig. 2B y C).
(A), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SAHA (3 y 5 M) y 5-aza-dC (2 y 4 mM) y la viabilidad celular se midió a las 48 h por tinción con azul usando analizador Vi-CELL tripano (Beckman contador). (B), células madre cancerosas pancreáticas eran sin tratar (A) o tratados con SAHA (b) o 5Aza-dC (c) durante 48 h, y la apoptosis se midió por tinción con anexina-PI utilizando Accuri citómetro de flujo. (C), se midió la actividad de la caspasa-3/7 en células madre cancerosas pancreáticas tratadas con SAHA (0,5 y 2 M) o 5-Aza-dC (1 y 3 M) durante 24 h. Los datos representan la media ± SD. * Y $ = significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05
Para comprender mejor el significado biológico de la restauración de miR-34a, células ASPC-1 se trataron con o sin SAHA y sus efectos sobre el la distribución del ciclo celular se examinó mediante la tinción PI usando citometría de flujo (datos no mostrados). SAHA indujo la detención del crecimiento en en G2 /M fase del ciclo celular a las 24 h en células AsPC-1. Además, la detención SAHA G2 inducida /M fue abrogada en presencia de miR-34a antagonista con respecto a los oligonucleótidos de control negativo que sugiere la participación de miR-34a en la detención del ciclo celular por SAHA (datos no mostrados).
Efecto de 5-aza-dC y SAHA en los supuestos objetivos de la miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas
Dado que el miR-34a está implicada en la capacidad de uno mismo y la metástasis de células madre cancerosas pancreáticas, la expresión de los supuestos objetivos de la renovación miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas en el tratamiento con 5-aza-dC y SAHA fue examinado por Western blot (Fig. 3A y B). Nuestros resultados indican que el 5-aza-DC y SAHA modulan los niveles de expresión de proteínas de los genes conocidos objetivo directo de miR-34a. Curiosamente, SAHA inhibió la expresión de la ciclina D1 y CDK6 y hasta regulada la expresión de p21 /CIP1 en células madre cancerosas pancreáticas (Fig. 3A). SAHA también inhibió la expresión de SIRT1, survivin, Bcl-2, VEGF, y se indujo la expresión de p53 acetilado y PUMA de una manera dependiente de la dosis. De manera similar, 5-Aza-dC inhibió la expresión de Notch3, CDK6, survivina y Bcl-2, y se indujo la expresión de p21 /CIP1 y PUMA de una manera dependiente de la dosis. Desde SAHA inhibe la expresión de SIRT1 a través de la regulación de miR34a, el próximo examinó los efectos de SAHA sobre la actividad de SIRT1 reportero 3'UTR-luciferasa. SAHA inhibió la actividad de SIRT1 3'UTR-luciferasa de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). En comparación, SAHA no tuvo ningún efecto sobre la actividad de la luciferasa mutante 3'UTR-SIRT1 (que no contiene ningún sitio de unión miR34a funcional). Estos datos sugieren que el miR-34a inhibe la expresión de SIRT1 a través de un sitio de miR-34a de unión dentro de la UTR 3 'de SIRT1.
(A), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con o sin SAHA durante 48 h. La expresión de p53-acetilado, p21, PUMA, SIRT1, CDK6, CyclinD1, survivina y Bcl-2 se midió por el análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. (B), de páncreas CSC se trataron con o sin 5Aza-dC durante 48 h. La expresión de p21, PUMA, Notch 3, CDK6, survivina y Bcl-2 se midió por el análisis de transferencia de Western. β-actina se utilizó como control de carga. , La actividad de SIRT1 3'UTR-luciferasa (C). CSC pancreáticas fueron transducidas ya sea con SIRT1 3'UTR-Luc construir o SIRT1 mutante 3'UTR-Luc construir, y se trataron con SAHA (0-3 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. *,#O% = significativamente diferente de control, P & lt;. 0.05
Además, la manipulación de la expresión de miR-34a mediante el uso de miR-34a antagomir alteró la expresión de la proteína de sus genes diana (Fig. 4A y B). 5-Aza-dC y SAHA inhiben la expresión de proteínas del ciclo celular reguladoras (ciclina D1 y CDK2) y VEGF, y hasta regula la expresión de p27 /KIP1 en células madre cancerosas pancreáticas. La transfección con antagomir de miR-34a estaba solo suficiente para derogar este efecto. Estos datos sugieren un mecanismo importante y novedoso mediante el cual 5-Aza-dC y SAHA median sus efectos sobre el crecimiento celular y la apoptosis en células madre cancerosas pancreáticas
.
(A), de páncreas células madre cancerosas fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de control negativo (revueltos ) u oligonucleótido y se trató con Aza-5DC (4 M) durante 48 h anti-miR34a. Se realizó análisis de transferencia de Western para medir la expresión de la ciclina D1, CDK2, p27 y VEGF. β-actina se utilizó como control de carga. (B), células madre cancerosas pancreáticas fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de control negativo (codificado) o un oligonucleótido anti-miR34a y tratados con SAHA (3 M) durante 48 h. Se realizó análisis de transferencia de Western para medir la expresión de la ciclina D1, CDK2, p27 y VEGF. β-actina se utilizó como control de carga. (C), el Reglamento de la actividad de VEGF-B 3'UTR-luciferasa por Aza-5DC. CSC pancreáticas fueron transfectadas ya sea con el control negativo (codificado) o oligonucleótidos antisentido de miR34a junto con VEGF-B 3'UTR-LUC, y se trataron con Aza-5DC (0-3 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. *, @ O#= significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (D), el Reglamento de la actividad de VEGF-B 3'UTR-luciferasa. CSC pancreáticas fueron transfectadas ya sea con el control negativo (codificado) o oligonucleótidos antisentido de miR34a junto con VEGF-B 3'UTR-LUC, y se trataron con SAHA (0-3 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. *, @,#= Significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05
Desde 5-aza-DC inhibe la expresión de VEGF a través de la regulación de miR34a, el próximo examinó los efectos de 5- aza-dC sobre la actividad de reportero 3'UTR-luciferasa VEGF-B (Fig. 4C). 5-Aza-dC inhibió la actividad de reportero VEGF-B 3'UTR-luciferasa de una manera dependiente de la dosis. En comparación, anti-miR34a bloqueó los efectos inhibidores de la 5-aza-DC sobre la actividad de la luciferasa. Desde SAHA inhibe la expresión de VEGF a través de la regulación de miR34a, que también examinó los efectos de SAHA sobre la actividad de reportero 3'UTR VEGF-B-luciferasa. Como se demuestra en la Fig. 4D, SAHA inhibió la actividad VEGF-B 3'UTR-luciferasa de una manera dependiente de la dosis. En comparación, anti-miR34a bloqueado los efectos inhibidores de SAHA sobre la actividad de luciferasa. Estos datos sugieren que la regulación de miR-34a por 5-aza-DC y SAHA pueden tener importancia funcional en la regulación de Notch y auto-renovación.
Efecto de la restauración de miR-34a en la expresión de células madre genes de renovación
señalización Notch se ha demostrado que desempeñan un papel en la determinación de renovación de células madre y el destino de las células en los nervios, hematopoyéticas y células madre embrionarias [38]. Jagged 1 expresión en las células progenitoras induce la auto renovación de las células madre debido a Notch de señalización de activación [39]. receptores Notch, ligandos, así como objetivos de abajo han sido identificados que se upregulated en las lesiones preneoplásicas a los cánceres de páncreas invasoras en humanos y ratones, lo que sugiere que la señalización Notch puede ser un evento temprano que conduce a la acumulación de células precursoras indiferenciadas en el cáncer de páncreas. Se demuestra que la re-forzada expresión de miR-34a en células madre cancerosas pancreáticas tras el tratamiento con SAHA, causa una inhibición en la expresión de mRNA de todos los componentes de la vía de Notch, receptor Notch Notch1, Notch 3 y su ligando Jagged1 y aguas abajo del gen diana Notch Hes1 expresión (Fig. 5A). La regulación por disminución de Notch puede así contribuir a la inhibición de la renovación de células madre y la capacidad invasiva de células madre cancerosas pancreáticas.
(A), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SAHA (1 y 3 M) durante 24 h, y el expresión de Notch1, JAGGED1, NOTCH3 y HES1 se midió mediante qRT-PCR. Los datos representan la media ± SD. * O $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (B), la actividad del indicador RBP-Jκ. CSC pancreáticas fueron transfectadas ya sea con el control negativo (codificado) o oligonucleótidos antisentido de miR34a junto con RBP-Jκ-LUC, y se trataron con SAHA (0-3 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. *,#O @ = significativamente diferente de control, P & lt;. 0.05
Desde SAHA inhibió la expresión de varios componentes de la vía Notch, A continuación mide la actividad de reportero RBP-Jκ por ensayo de luciferasa ( la Fig. 5B). SAHA inhibió la actividad RBP-Jκ-luciferasa de una manera dependiente de la dosis. En comparación, anti-miR34a bloqueado los efectos inhibidores de SAHA sobre la actividad RBP-Jκ-luciferasa. Estos datos sugieren que la regulación de miR-34a por SAHA pueden tener importancia funcional en la regulación de VEGF.
Efecto de la restauración de miR-34a en la transición epitelio-mesenquimal de células madre cancerosas pancreáticas
EMT inducción en las células cancerosas da como resultado la adquisición de propiedades invasivas y metastásicas [40]. Por ello, investigó el papel de la restauración de miR-34a en la regulación de la EMT en células madre cancerosas pancreáticas. Zeb-1 es un activador EMT crucial y suprime la expresión de los componentes de la membrana basal y los factores de la polaridad celular promoviendo así la metástasis de las células tumorales. Zeb-1 de transcripción se inhibió significativamente en células madre cancerosas pancreáticas y líneas celulares de cáncer tras el tratamiento con SAHA (Fig. 6A y B). A continuación se investigó el efecto de SAHA en la expresión de otros factores de transcripción EMT para caracoles y babosas en células madre cancerosas pancreáticas. Tomados en conjunto, SAHA como resultado la inhibición de Snail, Slug y la transcripción ZEB1 (Fig. 6B), lo que sugiere un papel de miR-34a en la reversión de la transición EMT en células madre cancerosas pancreáticas. Curiosamente, 5-Aza-dC también inhibió la transcripción de Slug (datos no mostrados), que posiblemente pueden desempeñar un papel en la inhibición de la invasión.
(A), las líneas celulares de cáncer de páncreas [ASPC-1 (p53wt ) y MiaPaCa-2 (p53mutant)] y pancreáticas CSC se trataron con SAHA (1 M) durante 24 h, y la expresión de ZEB1 se midió mediante qRT-PCR. Los datos representan la media ± SD. * = Significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (B), células madre cancerosas pancreáticas fueron tratados con SAHA (1 M) durante 24 h, y la expresión de Snail, Slug y ZEB1 se midió mediante qRT-PCR. HK-GAPD fue utilizado como el control de normalización endógeno. Los datos representan la media ± SD. * = Significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (C), el Reglamento de Zeb-1 actividad de reportero 3'UTR. CSC pancreáticas fueron transfectadas ya sea con el control negativo (codificado) o oligonucleótidos antisentido de miR34a junto con ZEB1 constructo 3'UTR-luciferasa, y se trataron con SAHA (0-3 M) durante 24 h. La actividad de luciferasa se midió según las instrucciones del fabricante (Promega). Los datos representan la media ± SD. *, #,% = Significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (D), de páncreas células madre cancerosas fueron tratados con SAHA (1 M) o 5-aza-DC (2 M) durante 24 h y la expresión de E-cadherina y N-cadherina se midió mediante qRT-PCR. Los datos representan la media ± SD. * = Significativamente diferente del control, p. & Lt; 0,05
Desde SAHA inhibe la expresión de Zeb-1 a través de la regulación de miR34a, que también examinó los efectos de la SAHA en ZEB1 3'UTR-luciferasa reportero de la actividad. Como se demuestra en la Fig. 6C, SAHA inhibida Zeb-1 actividad 3'UTR-luciferasa de una manera dependiente de la dosis. En comparación, anti-miR34a bloqueado los efectos inhibidores de SAHA sobre Zeb-1 actividad 3'UTR-luciferasa. Estos datos sugieren que la regulación de miR-34a por SAHA pueden tener importancia funcional en la regulación de la EMT mediante la inhibición de Zeb-1.
Interruptor
cadherina se ha demostrado que se producen durante la regulación de la EMT. El tratamiento de células madre cancerosas pancreáticas con SAHA y 5-aza-DC solo indujo la expresión de E-cadherina y se inhibe la expresión de N-cadherina, demostrando con ello que el miR-34a es un potente inductor de un fenotipo epitelial (Fig. 6D).
5-aza-dC y SAHA inhiben la migración, la formación de colonias, la invasión y la formación de esferoides
Para comprender mejor el efecto de la sobre regulación de la expresión de miR-34a en el potencial invasor de las células madre cancerosas pancreáticas, el próximo investigó el efecto de 5-aza-dC y SAHA sobre las células madre cancerosas pancreáticas utilizando la migración cero, la formación de colonias en agar blando, y los ensayos de cámara de Boyden invasión transwell. microfotografías representativas de células invasoras a través rayado generado para el control y 5-aza-DC y SAHA tratados células madre cancerosas pancreáticas mostraron significativamente menos migración en el panel grupo tratado en comparación con el grupo control (Fig. 7A).
(A ), fotomicrografías que demuestran los resultados de la migración in vitro de células madre cancerosas pancreáticas utilizando la técnica de cero simple. Células madre cancerosas pancreáticas fueron cultivadas en monocapa, rayados y tratados con SAHA y 5-aza-DC durante 24 h. (B), SAHA y 5-aza-DC inhiben la formación de colonias por células madre cancerosas. CSC pancreáticos se sembraron en agar blando y se trataron con SAHA (1 y 3 M) o 5-aza-DC (2 y 4 mM) durante 21 días. Al final del periodo de incubación, se contaron las colonias. Los datos representan la media ± SD. * Y $ = significativamente diferente de control, P & lt; 0,05. (C), los CAC se sembraron sobre la membrana recubierta con Matrigel en la cámara superior de la transwell y se trataron con SAHA (1 y 3 M) o 5-aza-DC (2 y 4 mM) durante 48 hrs. Células invadidas a la recámara inferior se fijaron con metanol, se tiñen y se fotografiaron. (D), de páncreas CSC se sembraron en suspensión y se trató con SAHA (1 y 3 M) o Aza-5DC (2 y 4 mM) durante 7 días. Imágenes de esferoides formados en suspensión fueron tomadas por un microscopio
& gt;. 5-Aza-dC y SAHA reducen la capacidad de las células madre cancerosas pancreáticas para formar colonias en agar blando en comparación con el control (Fig. 7B) y la transfección con anti-miR-34a anuló los efectos de la 5-Aza-dC y SAHA sobre la formación de colonias (datos no mostrados). La invasión de células madre cancerosas pancreáticas a través de la membrana recubierta matrigel mostró que el número de células invasoras se inhibió significativamente en 5-Aza-dC y SAHA células tratadas y fue de aproximadamente 75% menor que el número de células invasoras en el grupo de control (Fig. 7C) . Además, 5-Aza-dC y SAHA inhibió la formación de esferoides en células madre cancerosas pancreáticas como se ve en la Fig. 7D. Estos resultados demuestran que el miR-34a podría desempeñar un papel importante en la regulación de la tumorigénesis pancreática mediante la inhibición de la capacidad de auto-renovación de células madre cancerosas pancreáticas, la metástasis y la invasión.
Discusión
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión de otros genes por inhibición de la transcripción o la represión de traducción. La acumulación de pruebas sugiere un papel para microRNAs en la carcinogénesis humana como nuevos tipos de supresores de tumores u oncogenes [41], [42]. Recientemente, se han encontrado miembros de la familia miR-34a ser regulados directamente por TP53, y la actividad funcional de miR-34a indican un posible papel como un supresor tumoral. Demostramos en este estudio que la expresión de miR-34a es el regulado en células madre cancerosas pancreáticas humanas y líneas celulares derivadas de tumores pancreáticos, independientemente de su estado mutacional de p53.