Extracto
La tiorredoxina reductasa 1 (TR1) es un importante regulador de redox en células de mamíferos. Como un importante selenoprotein antioxidante, se cree que TR1 a participar en la prevención del cáncer, pero también se sabe que es sobreexpresado en muchas células cancerosas. Numerosos fármacos contra el cáncer inhiben TR1, y esta proteína se ha propuesto como un objetivo para la terapia del cáncer. Hemos informado anteriormente de que la reducción de los niveles de TR1 en las células cancerosas malignas revirtió muchas de las características que sugieren que la deficiencia en la función TR1 es antitumoral. La base molecular para el papel de TR1 en el desarrollo del cáncer, sin embargo, no se entiende. En este documento, se encontró que, entre selenoproteínas, TR1 se sobreexpresa de forma única en las células cancerosas y su caída en una línea celular de cáncer de ratón impulsada por oncogénicos
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dio lugar a cambios morfológicos característicos de las células parentales (normal), sin efecto significativo sobre el crecimiento celular en condiciones de crecimiento normales. Cuando se cultiva en un medio de suero deficiente, las células cancerosas deficientes TR1 pierden autosuficiencia de crecimiento, manifestar una progresión defectuosos en su fase S y una disminución de expresión de α ADN polimerasa, una enzima importante en la replicación del ADN. Estas observaciones proporcionan evidencia de que TR1 es fundamental para la autosuficiencia en las señales de crecimiento de las células malignas, que TR1 actúa en gran medida como una proteína pro-cáncer y de hecho es un objetivo primario en la terapia del cáncer
Visto:. Yoo MH , Xu XM, Carlson BA, Patterson AD, Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Orientación de la tiorredoxina reductasa 1 Reducción de las células del cáncer inhibe el crecimiento autosuficiente y replicación de ADN. PLoS ONE 2 (10): e1112. doi: 10.1371 /journal.pone.0001112
Editor Académico: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Septiembre, 2007; Aceptado: 12 Octubre 2007; Publicado: 31 Octubre de 2007
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Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa de investigación Intramural de los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional del cáncer, Centro de investigación del cáncer, y por subvenciones NIH CA080946 y GM065204 a GNV. ADP fue patrocinado por la Beca PRAT, NIGMS, NIH
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Selenio en la dieta tiene la prevención del cáncer potente actividad [1] y ambas proteínas contienen selenio (selenoproteins) [2,3 y referencias en él] y compuestos que contienen selenio de bajo peso molecular (selenocompounds) [2 y las referencias en él] se han implicado en esta actividad. El principal papel del selenio en el suministro de beneficios para la salud es probablemente a través de la acción de selenoproteins [1]. La tiorredoxina reductasa 1 (TR1) es uno de los 24 selenoproteins conocidos en roedores [4], es un importante regulador de antioxidante y redox en células de mamífero [5,6 y referencias en él] y tiene un papel esencial en el desarrollo de mamíferos [7]. Sin embargo, esta enzima parece tener efectos opuestos en el desarrollo del cáncer, ya que se ha implicado tanto en la prevención del cáncer [8] y la promoción del cáncer [9] - [12]. Por ejemplo, TR1 es compatible con la función de p53 y tiene otras actividades supresores de tumores, y su focalización por compuestos cancerígenos, electrófilos argumentar a favor de su papel en la prevención del cáncer [13]. Alternativamente, TR1 está sobreexpresado en muchas células de cáncer [9] - [12] y su inhibición por una variedad de fármacos contra el cáncer potentes propiedades alteradas relacionados con el cáncer de numerosos tumores y las células malignas que sugiere que esta enzima es un objetivo para la terapia del cáncer [9] -. [12], [14], [15]
no está claro si TR1 para prevenir el cáncer o propiedades que promueven el cáncer ejercer una mayor influencia sobre el cáncer, si estos efectos contrastantes operan simultáneamente o son específicos para diferentes etapas de desarrollo del cáncer, y cómo estas propiedades podrían ser utilizados en la prevención y /o terapia del cáncer. Para abordar estas cuestiones, que inicialmente se examinó el papel de TR1 en una línea celular de cáncer de pulmón de ratón y un modelo animal de ratón y observamos que la reducción de los niveles de TR1 invierte numerosas propiedades malignas incluyendo tumorigenecity [16]. En este documento, hemos examinado la función TR1 y papeles en el desarrollo del cáncer en una línea celular maligno del ratón para los que se disponía de la correspondiente línea celular parental (normal) y, además, verificamos los resultados en varias líneas celulares de cáncer humano.
Resultados
Generación de las líneas de células malignas y los padres y el análisis de sus niveles TR1 junto con varias líneas de células humanas cancerosas
células DT, que codifican oncogénico
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[17] , [18], y las células parentales NIH3T3 (control) fueron marcadas con
75Se y los extractos de proteína resultantes a electroforesis para examinar los niveles de TR1 y otros selenoproteins (Fig. 1A, panel superior izquierdo). El 55 kDa TR1 es uno de los principales selenoproteins, junto con otros selenoproteins, etiquetadas en esta figura. Claramente, las células DT tienen cantidades más altas de TR1 que las células de control. TR1 niveles también fueron examinados en el control y las células DT por el Western Blot (Fig. 1A, panel inferior izquierdo), que confirmó los niveles de TR1 aumenta en las células DT. Curiosamente, la expresión elevada TR1 fue a expensas de otras selenoproteínas, que se encontraban en niveles reducidos en las células DT en comparación con las células control.
líneas celulares indicadas se marcaron metabólicamente con
75Se, los extractos de células de proteínas resultantes a electroforesis y los geles expuestos a un PhosphorImager (ver Métodos). Selenoproteínas identificados previamente en extractos de células [25], [26] se indican mediante una flecha y el nombre a la derecha de cada panel. TR1 También se identificó mediante transferencia de Western en extractos de proteínas de cada línea celular como se muestra en los paneles inferiores. (A, panel izquierdo) de control (de los padres; NIH3T3) y las células DT. (A, panel derecho) NIH3T3 (control, células parentales utilizadas en la generación de células DT), LLC1 (ratón Lewis carcinoma de células de pulmón), ACHN (riñón humano carcinoma de células renales), A549 (pulmón humano no pequeñas carcinoma de células), HCT116 ( adenocarcinoma de células de colon humano) y SNB19 (glioblastoma célula humana). NIH3T3 se utilizó como una línea celular de indicador para la comparación de los niveles de TR1 en una línea celular normal a las líneas de células malignas. (B) DT /m3 y pU6-DT /siTR1. DT (obtenido por la sobreexpresión del mutante
k-ras Hoteles en NIH3T3) las células fueron transfectadas establemente con el vector pU6-m3 (control) o siTR1 caída del vector, respectivamente (ver Métodos).
Además, el carcinoma de pulmón de ratón Lewis (LLC1) células [16] junto con cuatro líneas celulares humanas, además de, fueron etiquetados con
75Se y selenoprotein expresión analizados (Fig. 1A, panel superior derecho). A pesar de que no hay control de las células correspondientes estaban disponibles para estas líneas de células malignas, se compararon sus patrones de marcaje selenoprotein a los de las células normales NIH3T3. La única selenoproteína marcado que parecía que se sobreexpresa en cada una de las líneas de células de cáncer era TR1. Western blot también mostró altos niveles de TR1 en las líneas de células malignas humanas y de ratón (Fig. 1A, panel inferior derecho).
La transfección estable de células DT y control con un vector siRNA desmontables-TR1 y su caracterización células
DT fueron transfectadas establemente con el siRNA desmontables-TR1 (designado DT /siRNA) o vector de control (designado DT /pU6-m3) (Fig. 1B, panel superior). TR1 estaba prácticamente ausente en las células transfectadas DT /siRNA como se demuestra por metabólica
etiquetado 75Se y transferencia de western (Fig. 1B, panel inferior).
Se examinaron los fenotipos de las dos líneas celulares transfectadas y DT en comparación a los de las células DT y control no transfectadas (Fig. 2). Las células de control crecieron en monocapa y firmemente unidos a la placa de cultivo, que son características de las células normales, mientras que las células DT /pU6-M3 y DT crecieron en múltiples capas y débilmente unidas a la placa de cultivo, que son características de las células malignas (Fig. 2A). Sin embargo, las células DT /siRNA tenían una capacidad disminuida de manera significativa a crecer en múltiples capas y se más estrechamente unidos a la placa de cultivo de cualquiera de las células DT /pU6-M3 o DT.
(A) Control (NIH3T3, parental) , las células DT, DT /m3 y pU6-DT /siTR1. Las células se cultivaron en placas de cultivo y se fotografiaron durante el crecimiento exponencial (ver Métodos). (B) el crecimiento independiente de anclaje de control, DT, desmontables células DT /m3 y pU6-DT /siTR1. Mil células se suspendieron en agar blando y se cultivaron durante dos semanas. Las placas fueron teñidas con INT durante la noche y se fotografiaron. Los detalles se dan en los métodos. (C) Las tasas de crecimiento de control, las células DT /m3 y pU6-DT /siTR1 en condiciones normales y deficientes en suero. Control, se sembraron las células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 (2 × 10
5 células /placa de 60 mm) y se cultivaron en condiciones de crecimiento normales (panel izquierdo) y células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 eran sembrado (5 × 10
5 células /60 mm plato) y cultivadas en medio (panel derecho) de suero deficiente. Las tasas de crecimiento en medio con suero deficiente se compararon con los obtenidos en condiciones de crecimiento normales.
Dado que muchas células cancerosas pueden crecer sin anclaje en agar blando, pero la mayoría de las células normales no puede, la capacidad de control, DT, células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 para crecer en agar blando se examinó (Fig. 2B). DT y las células DT /pU6-M3 crecieron en agar blando, mientras que las células de control y DT /siTR1 crecieron mal en estas condiciones. También se examinaron las propiedades de crecimiento en agar blando de dos líneas celulares humanas, A549 y HCT116, después de la transfección con el correspondiente TR1 control de vectores y desmontables vector humano que carece siTR1 (ver Fig. S1 y leyenda de la figura). Curiosamente, ambas líneas celulares que codifican siTR1 perdieron su capacidad de crecer en agar blando.
La autosuficiencia en las señales de crecimiento
La autosuficiencia en las señales de crecimiento se ha sugerido como uno de los seis capacidades adquiridas de fenotipos de cáncer y la cascada de señalización de Ras-Raf-MAPK se sabe que están implicados en esta capacidad adquirida por que imitan las señales de crecimiento [19]. Se examinó el efecto de la reducción de TR1 en este fenotipo por el creciente control, desmontables células DT /m3 pU6-TR1 y en los medios de comunicación regular y el suero deficiente (Fig. 2C). En condiciones normales de crecimiento, las células tanto DT y DT /siTR1 crecieron más de dos veces la tasa de las células NIH3T3, mientras que las células DT /siTR1 crecieron sólo aproximadamente 10% menos eficaz que las células /pU6-m3 DT (panel izquierdo, Fig. 2C). Por lo tanto, TR1 caída no disminuyó el crecimiento de células DT, excluyendo los efectos asociados con la esencialidad TR1 para el crecimiento celular. Como muchas células malignas crecen de manera más eficiente que las células normales cuando se cultivan en un medio de suero deficiente, se examinaron las capacidades de las dos líneas celulares transfectadas para crecer en condiciones de suero deficiente (panel derecho). las células DT /siTR1 crecieron a la mitad de la tasa que las células DT /pU6-m3, lo que sugiere que las propiedades asociadas con el cáncer de células se vieron afectados específicamente por la caída TR1.
Ciclo celular Análsis
análisis del ciclo celular de control, DT /siTR1 y las células DT /pU6-m3, cuando se cultiva en un medio de suero deficiente, se llevó a cabo para elucidar la fase afectada por la reducción en la expresión TR1 resultante en retraso del crecimiento (Fig. 3). Las tres líneas celulares se cultivaron durante la noche en medio completo y luego se colocan en un medio de suero con deficiencia de 0, 24 y 48 hrs. Las células se incubaron con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) y se tiñeron con anticuerpos BrdU para evaluar la replicación del ADN y se incubaron con 7-amino-actinomicina (7-AAD) para evaluar el ADN genómico. Estas células se analizaron luego por FACS (Fig. 3A) y las áreas apropiadas cuantificaron (Fig. 3B). Las tres líneas celulares tenían un gran número de células en las fases S G0-G1 y cuando se analizan inmediatamente después de crecimiento activo en medio completo, a pesar de DT /siTR1 tenía más células en la fase S, mientras que las otras dos líneas celulares tenían más celdas de la fase G0-G1 (ver Tiempo 0 en las Figs. 3A y B). La línea celular de control tenía aproximadamente 90% de sus células retenidas en la fase G0-G1 largo de crecimiento en medio con suero deficiente. Esta observación ciertamente indica que la mayoría de las células de control se mantienen en el estado quiescente (G0), que es consistente con su incapacidad para crecer en estas condiciones de crecimiento. Una diferencia importante se produjo en las cantidades de células en líneas celulares DT /pU6-m3 y DT /siTR1 a las 24 horas de crecimiento en el G0-G1 y S fases en que las células DT /PU6-m3 tenía un porcentaje mucho mayor de sus células en la fase S y menor porcentaje en la fase G0-G1 que hizo DT /siTR1. Dentro de la fase S, DT /pU6-m3 tenía alrededor de 1,5 veces más células en temprano que tarde S, mientras que DT /siTR1 tenía alrededor de 3 veces más células en temprano que tarde S. Aunque las cantidades de células en las dos líneas celulares transfectadas en el S fases G0-G1 y más de cerca aproximan entre sí a las 48 horas de crecimiento, la gran divergencia todavía estaba presente entre los principios y finales de las fases S en estas dos líneas celulares. Estos hallazgos sugieren que la replicación del ADN fue detenido en la fase S temprana en las células DT /siTR1. También debe tenerse en cuenta que las células DT /siTR1 tienen cantidades más altas de su población de células retenidas en la fase G2-M que cualquiera de las células DT /pU6-M3 durante el análisis de crecimiento sugieren que más células dentro de la población DT /siTR1 tienen problemas para la transición de control o en mitosis. La posible defecto que causa mayor retraso de las células DTsiTR1 en el G2-M fase de nuevas investigaciones pero no se siguió en este estudio, ya que no parece afectar a la reducción general de la tasa de crecimiento DT /siTR1 comparación con la de DT /pU6-m3 en un medio de suero deficiente (ver Fig. 2C).
control, se cultivaron células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 en medio con suero deficiente durante 0, 24 y 48 horas y se incubaron con BrdU durante 6 horas. Las células recogidas se tiñeron con anticuerpo anti-BrdU para supervisar ADN genómico recién replicado y 7-AAD para controlar todo el ADN genómico. Las células teñidas (A) se analizaron mediante citometría de flujo y (B) se cuantificó en cada fase del ciclo de crecimiento por FlowJo. Fases del ciclo de crecimiento, G0-G1, la fase S (S Temprano y Tardío S) y G2-M se muestran y los valores dados representan el porcentaje de la población total de células. Los detalles de los experimentos se muestra en la figura se dan en Métodos.
Análisis de los factores de la polimerasa de ADN
Para dilucidar qué componente (s) podrían estar involucrados en la replicación del ADN causando una reducción en tasa de crecimiento global en medio con suero deficiente en las células DT /siTR1 comparación con las células /pU6-m3 DT, se examinaron los niveles de α ADN Pol, β, γ y ε, Cdc45 y PCNA, que juegan un papel en este proceso [20 ]. Occidental análisis de estos componentes se llevaron a cabo con las tres líneas de células en cada momento (Fig. 4). ADN α Pol y Cdc45 se altamente enriquecido en ambas líneas celulares transfectadas en comparación con células de control en cada uno de los puntos de tiempo. Curiosamente, el ADN Pol α parecían estar reducida en las células DT /siTR1 comparación con las células DT /PU6-m3 a las 24 horas y más significativamente a las 48 hrs. Además, los niveles de ADN Pol ε parecían estar reducida en el control y las células DT /siTR1 en comparación con células DT /pU6-m3 a 48 horas, mientras que β ADN Pol parecían estar reducido en los tres puntos de tiempo en DT /siTR1 comparación ya sea células /pU6-m3 DT control o. Parecería que el efecto más pronunciado de la reducción de TR1 en las células DT /siTR1 está en α ADN Pol lo que resulta en una reducción del crecimiento de estas células en medio con suero deficiente. Sin embargo, la reducción de TR1 también puede resultar en la reducción de los niveles de ADN Pol β, mientras que los niveles reducidos de ADN Pol ε a las 48 horas en el control y las células DT /siTR1 puede resultar del medio de crecimiento con suero deficiente.
Los niveles de expresión de los componentes de la ADN polimerasa, DNA Pol α, β, δ y ε, Cdc45 y PCNA, en el control, las células DT /pU6-M3 y DT /siTR1 se analizaron por Western Blot. Las células se cultivaron en medio con suero deficiente para 0, 24 y 48 horas, se recogieron los extractos de células de proteínas preparado y electroforesis como se describe en Métodos.
Discusión
TR1 tiene muchas funciones celulares y está implicado ampliamente en procesos celulares que son regulados por redox [9] - [12]. Por ejemplo, TR1 tiene un papel en la proliferación celular, la angiogénesis, la transcripción, la reparación del ADN y sirve en la regulación y defensa antioxidante redox de señalización celular (ver comentarios [9] - [12]). Su principal función se cree que mantener tiorredoxina citosólica (TRX1) en el estado reducido usando NADPH como donante de electrones [21]. A su vez, TRX1 dona equivalentes de reducción de disulfuros en proteínas nucleares y citosólicas que mantienen reducidos los residuos de cisteína en estas proteínas. Aquí, dilucidado el papel de TR1 en la autosuficiencia de crecimiento, mostrando que la inhibición de la replicación del ADN en una línea celular maligna knockdown TR1 está asociada con una reducción en la expresión de α ADN Pol. Además, otros estudios han sugerido que la replicación del ADN puede ser retardado mediante la limitación de la síntesis de ADN desde la tiorredoxina tiene un papel en el mantenimiento de la piscina desoxinucleótido intracelular [11], [22], [23]. Sin embargo, se descartó esta posibilidad mediante el examen de las piscinas desoxinucleótidos en control, DT, células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 y mostrando que no varían durante el crecimiento en medio con suero deficiente (ver Fig. S2).
Numerosas funciones y propiedades TR1 sugerir que este selenoproteína tiene funciones anti-cáncer: 1) el estrés oxidativo es una de las principales características de las células cancerosas y TR1 es un jugador clave en la defensa antioxidante reduciendo TRX1 y otros reguladores redox en las células [ ,,,0],9] - [12]; 2) TR1 es esencial para la función apropiada de p53 supresor de tumores [13]; 3) la inhibición por los compuestos TR1 carcinogenéticas, electrófilos implicado en la prevención del cáncer [1]; y 4) el aminoácido que contiene selenio, Sec, ocupa el sitio catalítico activo de [4] TR1 y el selenio es conocido por tener potentes propiedades de prevención del cáncer [1]. Sin embargo, TR1 también se ha implicado en el desarrollo de tumores y mantenimiento: 1), se sobreexpresa en muchos tumores y líneas celulares [9] - [12]; 2) varios fármacos antitumorales son potentes inhibidores de TR1 lo que sugiere que esta enzima es un objetivo para la terapia del cáncer [9] - [14]; 3) la eliminación selectiva de TR1 invierte morfología y otras características del cáncer de las células malignas [16] (véase también las figuras 2 y 3 y texto S1).; y 4) la deficiencia de selenio se ha informado a disminuir la formación de tumores se algunos modelos de cáncer en los animales [24]
.
¿Cómo puede el papel de TR1 en el desarrollo del cáncer de reconciliarse con su papel en la supresión de tumores, así como la conocida propiedades de selenio anti-cáncer, que es un componente catalítico de TR1? Es tentador especular que cantidades adecuadas de selenio en la dieta en general, y un nivel de expresión suficiente de TR1, en particular, mantener la homeostasis redox celular en las células normales, la protección contra el estrés oxidativo, las mutaciones en el ADN y daño a otros componentes celulares. Por lo tanto, TR1, junto con otros selenoproteins, puede funcionar en la prevención del cáncer mediante la inhibición de la transformación maligna. Sin embargo, en los tumores de reciente aparición, las demandas de TR1 aumentan en gran medida como parecería ser necesario para sostener el crecimiento tumoral esta proteína, probablemente debido a la mayor demanda de sus equivalentes reductores través de la vía TRX1 y, como se muestra en este trabajo, la replicación del ADN. Esta propuesta explica tanto la actividad de la prevención del cáncer potente de selenio en la dieta y los roles contrastantes de TR1, tanto en la prevención y la promoción de cáncer. Por otra parte, este estudio proporciona la base para explicar datos de la literatura dispares sobre el papel de esta proteína enigmática en el cáncer y eleva TR1 aún más como [8] - [12], [14] - [16] sin duda tendrá un impacto importante en la forma en que la visión de la ingesta de selenio en la dieta de los seres humanos y otros mamíferos. Se ha sabido por algún tiempo que las dietas que contienen suficientes o suplementarios cantidades de selenio tienen efectos beneficiosos en la prevención de ciertas formas de cáncer, posiblemente, a través de la acción de enriquecer la población selenoprotein [1]. Sin embargo, se debe tener precaución expresado en que una vez que se inicia un proceso maligno, entonces las cantidades adecuadas o enriquecida de selenio en la dieta pueden servir para conducir la tumorigénesis. Nuestro estudio añade una capa importante hacia la comprensión de las funciones de los procesos redox en la evolución del cáncer y el uso de la dieta en la prevención y tratamiento del cáncer.
Materiales y Métodos
Materiales
75Se (actividad específica 1000 Ci /mmol) se obtuvo del Fondo para el reactor de investigación de la Universidad de Missouri, Columbia, MO. membrana de PVDF, NuPAGE 4-12% geles de Bis-Tris, higromicina B, lipofectamina 2000, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), solución de antibiótico-antimicótico y suero bovino fetal eran de Invitrogen Life Technologies. siRNA vector pSilencer 2,1-U6 Hygro fue adquirido de Ambion, Inc. y ρ-yodonitrotetrazolio violeta (INT) de Sigma. Los anticuerpos contra la ADN polimerasa α, β, δ y ε se adquirieron de Abcam, Inc. y los anticuerpos contra PCNA y Cdc45 eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc .. reactivo de ensayo de proteína BCA, SuperSignal West Dura Extended Substrato Duración y anticuerpo secundario conjugado con HRP eran de kit flujo de Thermo Fisher Scientific Inc. FITC BrdU se adquirió de BD Pharmingen ™. línea celular de cáncer de DT que codifica oncogénicos
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y se originó en las células NIH3T3 (de los padres) fue proporcionado generosamente por el Dr. Yoon Sang Cho-Chung y se obtuvieron células NIH3T3 de la American Type Culture Collection. Se obtuvieron células LLC1 (carcinoma de pulmón de Lewis de ratón) como se da [16] y las líneas celulares de humano ACHN (riñón humano carcinoma de células renales), A549 (pulmón humano no pequeñas carcinoma de células), HCT116 (adenocarcinoma de células de colon humano) y SNB19 (humana glioblastoma de células) se obtuvieron del Instituto Nacional del Cáncer, DTP, DCTD Repositorio tumor en el NIH, Bethesda, MD.
Cultivo de células de mamíferos y ensayos de crecimiento celular
células NIH3T3 y DT se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y solución de antibiótico-antimicótico a 37 ° C, 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Transfectadas de forma estable (knockdown TR1) siTR1 células DT y células DT de control pU6-m3 transfectadas de forma estable se prepararon mediante la transfección con los constructos correspondientes con lipofectamina 2000 y luego seleccionando células en presencia de 500 mg /ml de higromicina B exactamente como se describe [16] .
Morfología de NIH3T3, DT, se evaluaron las células DT /m3 y pU6-DT /siTR1 durante el crecimiento exponencial de la siembra de células en placas de cultivo de 60 mm, las células de crecimiento exponencial y se fotografiaron con un microscopio de contraste de fase invertida . Las tasas de crecimiento de NIH3T3, las células DT /pU6-m3 y DT /siTR1 se evaluaron mediante la siembra de 2 × 10
5 células /60 plato mm cultura y después de 48 crecimiento hrs, se recogieron las células con tripsina-EDTA, y se contaron las células por el método de extrusión de azul de tripano [16]. Para la evaluación de la tasa de crecimiento de las células en condiciones de suero deficiente, las células (5 × 10
5 células /60 mm placa de cultivo) se sembraron y cosechadas después de 24 y 48 horas de incubación en medio que contiene todos los componentes como medio completo, excepto 0,5% SFB en lugar de FBS al 10%, y las células contadas como anteriormente.
Western blot y
75Se etiquetado de las células
las técnicas para el análisis de transferencia Western y etiquetado de las células con
75Se se han detallado en otra parte [16]. En resumen, para el análisis de transferencia Western, las células se lavaron con PBS y enteras lisados de células frías preparadas usando tampón de lisis (20 mM Tris-Cl, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, mM NaF 10, 5 mM EDTA, y proteinasa cóctel inhibidor). Las cantidades de proteínas en los extractos de células se midieron usando el reactivo de ensayo de proteína BCA, 30 g de muestras de proteína a electroforesis en NuPAGE 4-12% geles de Bis-Tris, las proteínas separadas transferidos a una membrana de PVDF, y después se incubaron inicialmente con anticuerpo primario ( policlonal anti-TR1, anti-DNA Pol α, β, δ, ε, anti-PCNA y anti-Cdc45) y finalmente con anticuerpo secundario conjugado con HRP. Las membranas se hicieron reaccionar con SuperSignal West Dura ampliada Duración Substrato y se expusieron a película de rayos X.
En
75Se-etiquetado, las células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos (3 × 10
5 células /también), se incubaron 24 horas, a continuación, con la etiqueta 40 Ci de
75Se durante 24 horas, cosechadas y lisadas como se describió anteriormente. 40 g de cada muestra se aplicaron a NuPAGE 4-12% de gel de Bis-Tris, electroforesis, las proteínas se tiñeron con solución de tinción con azul de Coomassie, el gel se seca y se expone a un PhosphorImager (Molecular Dynamics).
selenoproteínas 75Se-Etiquetada en geles expuestos se identificaron por autorradiografía [16].
ensayo de agar blando
El crecimiento de las células en agar blando para evaluar su capacidad para sostener el crecimiento de anclaje independiente ha sido se detalla en otras partes [16]. Brevemente, un total de 1.000 control, DT, se suspendieron las células DT /pU6-m3 o DT /siTR1 en 3 ml de agar noble 0,35% en medio de crecimiento con 10% de FBS, y se extendió uniformemente sobre placas de 60 mm recubiertas con una basal 4 ml capa de agar noble 0,7% en DMEM. Las placas se incubaron en un CO humidificado
2 incubadora durante 14 días, 0.5 ml de medio de crecimiento fresco añadido sobre la placa de agar cada 5 días. Las colonias que se desarrollaron se visualizaron por tinción con violeta de ρ-yodonitrotetrazolio (INT) durante la noche y las placas se fotografiaron.
ciclo celular análisis
Las células se sembraron en placa de cultivo de células (5 × 10
5 células /60 mm placa) y se incubaron durante la noche antes de ser transferido al medio de suero deficiente (0,5% de FBS en DMEM). Las células se incubaron con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) 6 horas antes de la cosecha, las células marcadas con BrdU cosechadas en puntos de tiempo determinados (0 h, 24 horas y 48 horas) y se tiñeron con anticuerpos para monitorear ADN replicado. Las células recogidas se fijaron y permeabilizaron con una solución de BD Cytofix /CytopermTM fijación /permeabilización para la tinción intracelular. Para la tinción de ADN replicada, BrdU incorporado se sondeó con ADN genómico anti-BrdU anticuerpo y todo se tiñó con 7-amino-actinomicina D (7-AAD) siguiendo los procedimientos del fabricante. Las células que contienen los respectivos estados de ADN fueron analizadas por citometría de flujo utilizando un FACS Calibur 2 Sorter (Beckton Dickinson) y el número de células en cada fase del ciclo celular se cuantificó mediante FlowJo (Árbol Star, Inc.).
Apoyo a la Información
Texto S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s001 gratis (DOC 0,03 MB)
Figura S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s002 gratis (3.54 MB TIF)
figura S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0001112.s003 gratis (0.82 MB TIF)