Extracto
El chorro de plasma se ha propuesto como un método terapéutico para el cáncer. actividad contra el cáncer de plasma se ha informado que implicar disfunción mitocondrial. Sin embargo, lo que los componentes generados por el plasma está vinculado a este proceso contra el cáncer y su mecanismo de acción aún no está claro. En este caso, nos informan de que los efectos terapéuticos del resultado del plasma del aire de la generación de especies de oxígeno /nitrógeno reactivo (ROS /RNS) incluyendo H
2O
2, buey, OH
-, • O
2 , NOx, lo que conduce a la despolarización del potencial de membrana mitocondrial y la acumulación de ROS mitocondrial. Al mismo tiempo, ROS /RNS activar c-Jun NH
2-quinasa terminal (JNK) y la quinasa p38. Como consecuencia de ello, el tratamiento con chorros de plasma de aire induce la muerte apoptótica en células HeLa de cáncer cervical humano. El pretratamiento de las células con antioxidantes, JNK y los inhibidores de p38, o JNK y siRNA p38 abroga la despolarización de potencial de membrana mitocondrial y deteriora la muerte celular apoptótica inducida por plasma de aire, lo que sugiere que el ROS /RNS generado por las vías de señalización de activación de plasma que implican JNK y p38 y promover perturbación mitocondrial, lo que lleva a la apoptosis. Por lo tanto, la administración de plasma de aire puede ser una estrategia viable para eliminar las células cancerosas
Visto:. Ahn HJ, Kim Ki, Hoan NN, Kim CH, Luna E, Choi KS, et al. (2014) Orientación de las células cancerosas con reactivas de oxígeno y nitrógeno especies generados por atmosférica, presión de aire de plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10.1371 /journal.pone.0086173
Editor: Xianglin Shi, Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de septiembre de 2013; Aceptado: 6 de diciembre de 2013; Publicado: 21 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Ahn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea subvenciones financiadas por el gobierno de Corea (MSIP) (2012M3A9B2052871, 2010 a 0.018.546, 2011-0030043). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
plasma se refiere a menudo como el cuarto estado de la materia, además de sólido, líquido y gas. El plasma es bastante similar al gas en la que se ioniza y se carga una parte de las partículas, algunas partículas son eléctricamente neutros, y algunos son radicales activados químicamente. El plasma puede ser categorizado como "plasma térmico (o caliente)" o "plasma no térmico (o frío)." Se han investigado numerosas técnicas que utilizan plasma y aplicado con éxito en ciertas aplicaciones industriales. Recientemente, aplicaciones de plasma se han empleado en ciencias biológicas y médicas, incluyendo coagulación de la sangre [1], la terapia del cáncer [2], esterilización de la superficie [3], y el tratamiento de la cavidad dental [4]. En particular, el aumento de la investigación traslacional de plasma en el tratamiento del cáncer puede prometer nuevos efectos terapéuticos. Además, es interesante que el plasma frío generado a presión atmosférica aumenta la viabilidad de aplicaciones médicas.
Aunque el material biológicamente efectiva (s) generada a partir de plasma y sus dianas celulares permanecen desconocidos, varias líneas de evidencia enlace oxígeno reactivo especies /nitrógeno (ROS /RNS) a sus efectos biológicos. El tratamiento con plasma causó la despolarización del potencial de membrana mitocondrial y la generación de ROS en células humanas [2]. Además, los antioxidantes mejoran la disfunción mitocondrial inducida por plasma, apoyando la noción de que las especies oxidantes tales como ROS pueden mediar efectos de plasma inducida en células de mamíferos [2]. Una amplia gama de causas aparentemente no relacionados y complejos de la disfunción mitocondrial tiene mecanismos fisiopatológicos subyacentes comunes: producción y acumulación de daño mitocondrial ROS, lo que lleva a un mayor estrés oxidativo, pérdida de ATP, mitofagia para control de calidad y la eliminación de las mitocondrias dañadas, y, finalmente, la muerte celular [5].
ahora está claro que las ROS tiene un papel de señalización celular en muchos sistemas biológicos de las bacterias a las células de mamíferos [6]. ROS puede activar cascadas de señalización celular, tales como las que implican muchas cascadas diferentes activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) [7], [8]. Estos incluyen las quinasas de estrés, quinasas c-Jun N-terminal (JNK) y la proteína quinasa activada por estrés (SAPK). JNKs fueron identificados como una quinasa que se une y fosforila c-Jun en Ser-63 y Ser-73 dentro de su dominio de activación transcripcional. JNK se activa por el tratamiento de células con citocinas (por ejemplo, factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina (IL) -1) y por la exposición de las células a muchas formas de estrés ambiental (por ejemplo, estrés osmótico, estrés redox, y la radiación ) [9]. Ha sido bien establecido que las ROS son potentes inductores de la JNK. La mayoría de los informes sobre el resultado de la activación de JNK inducida por ROS exógena de ROS, en su mayoría H
2O
2. Además, la acumulación de ROS inducida por estímulos apoptóticos puede activar la p38 SAPK [10]. Las JNK y p38 MAPK vías comparten varios reguladores de aguas arriba, y en consecuencia hay múltiples estímulos que activan simultáneamente ambas vías. Se proponen
Enlaces entre ROS señalización y apoptosis estar mediada por mitocondrias. Actualmente muchos estudios han sugerido que las mitocondrias son el principal sitio de acción de JNK en la apoptosis. Tanto JNK1- y fibroblastos embrionarios murinos primarios eliminado JNK han mostrado resistencia a la apoptosis inducida por UV debido a un defecto en la vía de señalización mitocondrial de muerte, incluyendo la falta de liberación del citocromo c [11]. translocación mitocondrial de JNK se produce en condiciones de estrés tales como la exposición a los rayos ultravioleta, la radiación ionizante, ROS y RNS, y por lo tanto la JNK-localizada mitocondrial ofrece proximidad a las mitocondrias generada por ROS [12], [13]. Además, los estímulos apoptóticos veces desencadenan la activación de p38 por una ruta secundaria, tales como la producción de ROS [13]
y varios otros grupos han informado de que plasma a presión atmosférica [2], [14]. - [19] y chorros de plasma de nitrógeno a partir de una matriz de micro-tobera [20] inducen apoptosis en células de cáncer. Recientemente, plasma se ha demostrado que la promoción de la apoptosis de las células cancerosas por la generación de ROS, la alteración del potencial de membrana mitocondrial, y la activación de proteínas de la familia de la caspasa [2]. Sin embargo, lo que el componente (s) generada por plasma de aire produce sus efectos contra el cáncer y el mecanismo molecular por el cual plasma induce la apoptosis siguen sin estar claros. Para este informe, se intentó encontrar el componente (s) efector generada a partir de plasma de aire y su objetivo y para dilucidar el mecanismo molecular y la ruta bioquímica por la que se induce beneficios terapéuticos contra el cáncer. Se identificaron los ROS /RNS como efectores clave de plasma de aire, que se dirigen las mitocondrias y conduce a la activación de JNK y p38 vías de señalización.
Resultados
chorro de plasma de aire micro puede generar oxígeno reactivo y especies de nitrógeno
El sistema de chorro de plasma micro que funciona a presión atmosférica pueden producir especies químicamente activas, en particular átomos de oxígeno y nitrógeno [21]. En este estudio, se emplearon primero el análisis del espectro de emisión óptica para identificar las partículas y los radicales generados por el sistema de aire de plasma (Figura 1a-b), que puede mediar los efectos de plasma de aire en las células del cáncer [2], [22]. espectroscopia de emisión óptica (OES) se llevó a cabo en un amplio intervalo de longitudes de onda de 280 nm a 920 nm con un espectroscopio de emisión óptica (SV 2100, K-MAC) (Figura 1c). Las líneas de emisión dominantes ilustran la presencia de iones de oxígeno excitados (O
2
+) a 500-600 nm y oxígeno atómico (O I) en 777 y 844 nm (Figura 1c). Además, las especies reactivas detectados asociados con el nitrógeno son moléculas de nitrógeno excitado (N
2 segundo sistema positivo y N
2 primero sistema positivo) en las gamas de 300 a 390 y 610 a 710 nm y las moléculas de nitrógeno ionizados (N
2
+ primer sistema negativo) en el intervalo de 390 a 480 nm, y el nitrógeno atómico (NI) a 747, 822, y 868 nm (Figura 1c). Estos resultados indican que la OES el chorro de plasma micro aire puede desempeñar un papel importante en la producción de diversos oxígeno y nitrógeno especies reactivas (ROS y RNS, respectivamente).
(a) Fotografía del sistema de chorro de microplasma fabricado. El recuadro es una presentación esquemática de la boquilla de micro chorro de plasma. (B) Fotografía del chorro de plasma micro aire generado a presión atmosférica. (C) espectro de emisión óptica de chorro de aire micro plasma durante la descarga.
extracelulares e intracelulares de ROS y RNS fueron generados por la exposición al plasma de aire
Un indicio de que ROS y RNS puede mediar la efectos anticancerígenos de plasma de aire fue sugerido por nuestro anterior estudio se informa de que el plasma de aire inducida por la apoptosis, acompañado por la generación de ROS y RNS y la disminución de potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células de cáncer de cuello uterino [2]. Por otra parte, la producción de ROS y RNS por chorro de plasma se ha estudiado recientemente [23], y es coherente con los espectros de emisión inducida por plasma de aire (Figura 1c). Por lo tanto, se analizaron bioquímicamente la producción de ROS y RNS, de su entrega en la fase líquida del medio de cultivo celular y la migración secuencial de ROS y RNS en las células (Figura 2).
(a) Niveles de extracelular H
2O
2 se determinaron en la cultura o no la cultura (medio solamente) sobrenadantes, con (AP) o sin tratamiento con plasma de aire (no tratada). El sobrenadante del cultivo se cosechó en los tiempos indicados después del tratamiento con plasma de aire (AP). AP 0 (min) indica sobrenadante recogido inmediatamente después de tratamiento con plasma. La concentración de H
2O
2 en el sobrenadante del cultivo se determinó por comparación con una H
2O curva de calibración estándar
2, después de la incubación con el reactivo Amplex UltraRed (
n =
5). (B) Generación y /o penetración a través de la membrana plasmática de oxígeno, como los H
2O
2, OH
-, y • O
2 en la matriz intracelular tras chorro de plasma de aire (AP) eran se determina usando la sonda ROS sensible a H
2DCFDA (
n
= 5). La fluorescencia de las células no tratadas (no tratado) se estableció arbitrariamente a 1. (c) Los niveles de NO extracelular se determinaron en no de cultivo (en ausencia de células HeLa, superior) y la cultura (en presencia de las células HeLa, la parte inferior ) sobrenadantes en los tiempos indicados después de la exposición chorro de plasma de aire mediante el ensayo de Griess (
n
= 10). (d) Los niveles de NO intracelular fueron evaluados utilizando DAF-FM. Los datos se muestran como la media ± S.E.M. (
n
= 10).
Primero examinamos si el tratamiento con plasma de aire podría inducir la generación de H
2O
2 en el sobrenadante del cultivo (Figura 2a ). El sobrenadante del cultivo fue cosechado a los tiempos indicados después del tratamiento de plasma de aire y la concentración de H
2O
2 en el sobrenadante del cultivo se analizó mediante comparación con H
2O curva de calibración estándar
2. H
2O
2 se generó a aproximadamente 26,93 M inmediatamente después del tratamiento con chorros de plasma de aire y la concentración en el sobrenadante del cultivo se redujo rápidamente dentro de 1 h. Sin embargo, H
2O
2 en un medio no de cultivo solo disminuyó más lentamente hasta 1h después del tratamiento de plasma, en comparación con el nivel en sobrenadante de cultivo. En 3 h, los niveles de H
2O
2 fueron similares en los sobrenadantes de cultivo de células HeLa, y en medio solamente. H
2O
2 apenas se detectó en el sobrenadante del cultivo, en 3 h después del tratamiento de plasma (Figura 2a). Estos resultados sugieren que el plasma de aire puede generar y entregar de forma secuencial H
2O
2 en el medio. Además, la razón de la rápida disminución inicial de H
2O
2 generado por plasma de aire en el sobrenadante del cultivo en comparación con el que en un medio no cultura podría ser que las células promueven la compactación de H
2O
2. Para probar esta posibilidad, que supervisó los niveles de H
2O
2 en el sobrenadante del cultivo y el medio no sólo la cultura siguiendo H
2O
2 de tratamiento (Figura S1a). Cuando las células HeLa fueron tratadas con 2 mM H
2O
2, H
2O
2 se detectó de manera similar tanto en el sobrenadante de cultivo y medio no de cultivo inmediatamente después del tratamiento. Sin embargo, en 3 h después de la H
2O
2 tratamiento, H
2O
2 fue apenas detectada (aproximadamente 100 M) en el sobrenadante del cultivo, pero el nivel se mantuvo en aproximadamente 670 micras de no medio de cultivo (Figura S1a). Sobre la base de este resultado, se especula que las células pueden compactar H
2O
2 generado por plasma de aire, dando lugar a un descenso acelerado en H
2O
2 en el sobrenadante del cultivo.
a continuación supervisó la generación de ROS intracelulares incluyendo H
2O
2, radicales hidroxilo (OH
-), y el oxígeno singlete (• O
2), después de un tratamiento de plasma, utilizando H
2DCFDA (Figura 2b). Después del tratamiento con plasma de aire, los niveles de ROS intracelulares incrementaron aproximadamente 2,7 veces (2,73 ± 0,13). Este nivel elevado disminuyó hasta 3 h después de tratamiento con plasma y se recuperó casi al nivel basal no tratado en 24 h (Figura 2b). Estos datos sugieren que el tratamiento con plasma induce la generación de ROS intracelular.
A continuación, se evaluó si plasma de aire puede resultar en la generación de RNS extracelulares e intracelulares (Figura 2C y D, respectivamente). Inmediatamente después del tratamiento con plasma, los niveles extracelulares de NO fueron elevadas a aproximadamente 13,28 mM en tanto no la cultura y los medios de cultivo (Figura 2c). Por 3 h después del tratamiento de plasma, los niveles extracelulares de NO en la no-cultura y de los medios de cultivo se redujo rápidamente a aproximadamente 8,26 o 5,8 mM, respectivamente (Figura 2c). En los puntos de tiempo más tarde de 3 h, la extracelular nivel de NO en medio no cultivo se mantuvo, mientras que el extracelular nivel de NO en medio de cultivo se redujo de forma continua a aproximadamente 1,28 mM en 24 h después del tratamiento de plasma (Figura 2c), lo que indica que las células pueden absorción o eliminar NO extracelular generada por el plasma.
Del mismo modo, los niveles de NO intracelulares en las células tratadas con plasma se incrementaron en aproximadamente 1,8 veces (1,75 ± 0,20) o 2,3 veces (2,28 ± 0,07) en 1 hy en 18 h después del tratamiento de plasma de aire, respectivamente, en comparación con los de las células no tratadas. La elevada intracelular nivel de NO se mantuvo hasta 24 h (datos no mostrados) después de un tratamiento de plasma y se recuperó casi al nivel basal no tratado en 48 h (Figura 2D y la Figura S1b), similar a los niveles de ROS después de tratamiento de plasma (Figura 2b). plasma de aire inducido un aumento mayor y más durable en NO que la inducida por H
2O
2 (Figura 2d y la Figura S1b-c). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el tratamiento con plasma induce la generación de NO extracelulares e intracelulares.
Para apoyar que el plasma de aire generado niveles de ROS y RNS en células de mamífero, se examinó si los antioxidantes atenúan la ROS /RNS inducida por plasma generación mediante la medición de los niveles de ROS y RNS en células HeLa tras el tratamiento con plasma en presencia de antioxidantes. En primer lugar, hemos probado si la conocida tiol antioxidante NAC [24] puede afectar a la concentración de H
2O
2 en los sobrenadantes de cultivo después del tratamiento con plasma de aire (Figura 3a). En combinación con el chorro de plasma, de cultivo de células HeLa o sólo medio se trató previamente con NAC. NAC induce la rápida disminución de H
2O
2 a aproximadamente menos de 4,13 ± 1,67 M en 15 min después del tratamiento de plasma, similar a los niveles observados en 2 horas después de tratamiento con plasma sin NAC (Figura 3a), lo que sugiere que NAC puede aliviar la inducida por plasma de aire H
2O
2 generación. A continuación examinó si los antioxidantes pueden reducir la generación inducida por plasma de aire de ROS intracelular (Figura 3b). Para ello, se evaluaron los niveles de ROS tras el pretratamiento con NAC antioxidante o cPTIO y la exposición al plasma de aire. Tanto NAC y cPTIO podrían atenuar la generación de ROS intracelulares inducido por plasma de aire (Figura 3b). Curiosamente, la clara de atenuación de la generación de ROS intracelular por cPTIO, un antioxidante eficaz de RNS como el óxido nítrico (NO
•), condujo a la especulación de que el plasma de aire puede generar RNS así como ROS y la generación intracelular de ROS puede ser vinculada a la generación de RNS.
(a) Niveles de extracelular H
2O
2 se determinaron en la cultura o no la cultura (medio solamente) sobrenadantes con el tratamiento con plasma de aire en presencia (AP + NAC) o ausencia (AP) del antioxidante NAC (
n
= 5). NAC se añadió 1 h antes del tratamiento de plasma. El sobrenadante del cultivo se cosechó en los tiempos indicados después del tratamiento con plasma de aire. AP 0 (min) indica sobrenadante recogido inmediatamente después de tratamiento con plasma. (B) la generación de ROS incluyendo H
2O
2, OH
-, y • O
2 en la matriz intracelular tras chorro de plasma de aire (AP) se determinaron utilizando la sonda ROS sensible a H
2DCFDA (
n
= 5). Las células fueron pretratadas con los antioxidantes NAC o cPTIO durante 1 hora y después se expusieron al plasma de aire (AP + NAC o AP + cPTIO) o H
2O
2 (H
2O
2 + NAC o H
2O
2 + cPTIO). En tiempos indicados después del tratamiento con plasma de aire, se recogieron las células. La fluorescencia de las células no tratadas (no tratado) se estableció arbitrariamente a 1. (c) Los niveles de NO extracelular se determinaron en no de cultivo (en ausencia de células HeLa, superior) y la cultura (en presencia de las células HeLa, la parte inferior ) sobrenadantes en los tiempos indicados después de la exposición chorro de plasma de aire mediante el ensayo de Griess (
n
= 10). Medio en presencia o ausencia de células HeLa se trató previamente con NAC o cPTIO durante 1 h antes de la exposición a plasma o H
2O
2. (d) Los niveles de NO intracelular fueron evaluados utilizando DAF-FM. Los datos se muestran como la media ± S.E.M. (
n
= 10).
Además, examinó si los antioxidantes pueden reducir la generación inducida por plasma de aire del RNS. Se encontró que el NO antioxidante cPTIO promovido disminuciones en el nivel de NO extracelular inducida por plasma tanto en el sobrenadante de cultivo y medio no de cultivo (Figura 3c). Por el contrario, la NAC tuvo poco efecto sobre los niveles extracelulares de NO inducida por plasma tanto en la cultura y el medio no cultivo (Figura 3c). En consonancia con los resultados NO extracelulares, c-OITP pero no NAC podría disminuir significativamente la generación de RNS intracelulares por plasma de aire (Figura 3D y Figura S1b). La atenuación específica de los RNS plasma inducido por aire por cPTIO (la eficacia antioxidante RNS) y la atenuación de los RNS
2O
2 inducida por H por tanto NAC (la eficacia antioxidante ROS) y cPTIO (Figura 3d) sugieren que el plasma de aire puede generar directamente RNS pero el H
2O
2 inducida por la generación de RNS puede ser mediada a través de la vía (s) que implican intermedios ROS. Tomados en conjunto con los datos de la generación de ROS y RNS (Figuras 2-3), nuestros resultados indican que el plasma de aire puede generar sobrenadantes de cultivo extracelulares e intracelulares de ROS y RNS en y el medio ambiente celular.
plasma de aire activa JNK y p38 mediada por la vía de señalización MAPK
para determinar si ROS y RNS generada por plasma de aire pueden actuar como moléculas de señalización y qué señal de las vías están involucrados en este transducción, se realizaron búsquedas de MAPK cascadas que se sabe que están implicados en las vías de señalización en respuesta a estrés oxidativo tales como ROS, RNS, UV, y la irradiación ionizante. Para ello, hemos probado si el ROS /RNS generada por plasma de aire induce JNK, p38 y la activación /o ERK. Inmunofluorescencia y análisis inmunotransferencia se realizaron para evaluar la fosforilación de estas quinasas inducidas por H
2O
2 y su activación en respuesta a tratamiento con plasma de aire (Figura 4 y la Figura S2). La exposición a plasma de aire activación de JNK altamente inducida, en comparación con su modesta activación por H
2O
2 (Figura 4a y la Figura S2a), lo que sugiere que la señalización puede ser evocado por plasma de aire y por lo tanto puede activar una mediada JNK- vía de transducción de señal. Cuando las células se trataron con plasma o H
2O
2 en presencia de un inhibidor de JNK (SP600125), la activación de JNK fue abrogada como se esperaba, en 1 h después del tratamiento con plasma o H
2O
2 (Figura 4a y la Figura S2a). Además, el NAC fue capaz de atenuar la activación de JNK por el plasma o H
2O
2 (Figura 4a, bajo el panel), lo que indica que algún tipo de señal de estrés oxidativo puede ser evocada por el plasma.
(a) la fosforilación de JNK después del tratamiento con chorro de plasma de aire o H
2O
2 se analizó mediante tinción de inmunofluorescencia e inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-fosfo-JNK. La cantidad equivalente de proteínas totales de JNK se muestra como control de carga cuantitativa de la fosforilación de JNK. (B) La fosforilación de p38 inducida por plasma de aire se visualizó mediante inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-fosfo-p38. Las proteínas p38 totales comparables se muestran como control de carga para la fosforilación de p38. (C) Variación del estado de fosforilación de ERK no se detectó después del tratamiento con plasma de aire o H
2O
2.
A continuación, se analizó la activación de p38 por el plasma y si NAC podría afectar a la activación de p38 inducida por plasma. De una manera análoga a la JNK, plasma aire evocó la fosforilación de p38 y esta fosforilación inducida por plasma se ha mejorado parcialmente por NAC, lo que indica que la señal inducida por plasma de aire puede activar la vía de señalización de p38 mediada y puede ser un tipo de señal de oxidante (Figura 4b y la Figura S2b). En contraste, plasma tuvo poco efecto sobre la fosforilación de ERK1 /2 (Figura 4C). Estos datos, en conjunto, sugieren que el plasma de aire puede evocar señales intracelulares y activar secuencialmente las vías de transducción de señales intracelulares mediadas a través de JNK o p38.
Aire plasma induce la acumulación de ROS mitocondrial y la disfunción mitocondrial
Las mitocondrias son una principal fuente de generación de ROS celular [25] y el estrés oxidativo incluyendo H
2O
2 puede iniciar el colapso del potencial transmembrana mitocondrial (Δψm) [26]. En un informe anterior, se encontró que el colapso del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) es inducido por N
2 o plasma de aire [2]. Para ver si plasma puede inducir la acumulación de ROS mitocondrial, que mide superóxido mitocondrial tras el tratamiento con plasma MitoSOX, un colorante fluorogénico para la detección selectiva de superóxido en la mitocondria de las células vivas (Figura 5A). dismutasa mitocondrial en las células aumentó tras el tratamiento con plasma de aire o H
2O
2. Además, el nivel de superóxido mitocondrial en las células tratadas con plasma de aire (4,32 ± 0,05) fue aproximadamente 2 veces mayor que en H
2O
2-células tratadas (2,36 ± 0,23) a las 6 h después del tratamiento con plasma (Figura 5a). Después de este tiempo (es decir, 6 h después del tratamiento), la superóxido mitocondrial acumulado en las células tratadas con plasma disminuyó, mientras que la superóxido acumulada en las mitocondrias de H
2O
2 tratados con células persistió hasta las 24 h (2,45 ± 0,39) (Figura 5a). Estos resultados sugieren que el plasma de aire puede inducir la acumulación de ROS incluyendo superóxido en la mitocondria.
(a) se evaluó la producción de ROS mitocondrial utilizando la sonda-mitocondria específico MitoSOX siguiente H
2O
2 o aire tratamiento con plasma. El ROS mitocondrial en las células no tratadas (no tratado) se fijó arbitrariamente a 1. Las células se recogió a los tiempos indicados después del tratamiento con plasma de aire y se analizó mediante citometría de flujo. (B) Las células se trataron previamente con los antioxidantes (NAC o cPTIO) o inhibidores de la quinasa (SP600125 o SB203580) para 1 h y luego se expusieron al plasma de aire (AP + NAC, AP + cPTIO, AP + SP o AP + SB) o H
2O
2 (H
2O
2 + NAC, H
2O
2 + cPTIO, H
2O
2 + SP o H
2O
2 + SB). Las células se recogieron en los tiempos indicados después del tratamiento de plasma, y se midieron los niveles de ROS mitocondrial (
n
= 5). La fluorescencia de las células no tratadas (no tratado) se estableció arbitrariamente a 1. (c) El potencial de membrana mitocondrial se evaluó usando la sonda-mitocondria específico JC-1, con o sin plasma de aire o H
2O
2, (
n
= 5). La fluorescencia en células HeLa no tratadas se fijó arbitrariamente a 1.
Además, se examinó si los antioxidantes pueden atenuar la acumulación dismutasa mitocondrial inducida por plasma de aire. NAC o cPTIO fue capaz de disminuir la producción de superóxido mitocondrial (Figura 5b). Como plasma de aire activa JNK y vías de señalización de p38 mediada (Figura 4A-B y la figura S2), se investigó la posibilidad de que los procesos de transducción de señales activadas por plasma están involucrados en la acumulación de ROS mitocondrial. Se encontró que la inhibidores de quinasa SB203580 y SP600125 fueron capaces de socavar la generación de superóxido mitocondrial inducida por plasma (Figura 5b), lo que implica que el plasma puede inducir la producción de ROS en las mitocondrias en una JNK- y de manera dependiente de p38.
Debido plasma de aire inducida por la generación de ROS celular /RNS (Figura 2) y mitocondrial de ROS (Figura 5a) y el colapso del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) [2], se examinó si ROS /RNS podrían estar relacionados con el plasma de aire inducida por disfunción mitocondrial mediante el tratamiento de células HeLa con plasma de aire en presencia de la NAC antioxidantes o cPTIO. Monitorizamos el potencial transmembrana mitocondrial (Δψm) después del tratamiento de plasma en la ausencia o presencia de NAC o cPTIO, utilizando la sonda-mitocondria específico JC-1. plasma de aire o H
2O
2 inducida por el tratamiento aumento de la intensidad de la fluorescencia verde /rojo (aproximadamente 3,3 veces o 2,1 veces a las 12 h y 2,9 veces o 3,6 veces a las 24 h, respectivamente), lo que confirma que tanto en plasma y H
2O
2 pueden inducir una disminución en Δψm (Figura 5c). NAC o cPTIO mostraron efectos parcialmente mejorar en la disminución de la Δψm inducida por plasma o H
2O
2 de tratamiento (Figura 5c), lo que sugiere que la inducida por plasma de aire ROS /RNS puede jugar un papel en la disfunción mitocondrial. Debido a que los procesos de transducción de señales subyacentes de la disminución inducida por plasma en Δψm son desconocidos, se determinó si los inhibidores de JNK y p38 podrían mitigar el daño mitocondrial inducida por plasma. De una manera similar, los inhibidores de JNK y p38 (SP600125 o SB203580) fueron capaces de atenuar los efectos de plasma y H
2O
2 en la disminución Δψm, aunque no resulta en la normalidad Δψm (Figura 5c). Estos resultados sugieren que el plasma de aire produce ROS /RNS, conduce a la activación de la transducción de señal a través de JNK o p38. Al mismo tiempo, ROS /RNS parece inducir el colapso de la Δψm, que está mediada parcialmente a través de JNK y p38 señal de transducción
ROS generación /RNS induce la muerte celular apoptótica inducida por plasma a través de la activación de JNK y p38 celular mediada transducción de señales y la disfunción mitocondrial
para determinar la muerte celular inducida por plasma de aire, que probó por primera vez la posibilidad de que las ROS /RNS fueron responsables de la muerte de las células cancerosas inducida por plasma de aire mediante el tratamiento de células HeLa con plasma de aire en presencia de los antioxidantes NAC o cPTIO. El pretratamiento con NAC y cPTIO atenuó la muerte celular inducida por plasma (49,5% ± 2,2% y 38,86% ± 4,2%, respectivamente, la figura 6a y la figura S3), lo que corrobora que ROS /RNS está implicada en la muerte celular inducida por plasma. Debido a que no hay un buen control de RNS similar a la utilización de H
2O
2 como control canónica para ROS, también, si la prueba de NaNO
3 podría inducir la apoptosis, plausiblemente que implica el NO y el RNS generada a partir de NaNO
3. De NaNO
3 promueve la muerte celular a concentraciones más altas que hizo H
2O
2 (Figura S3-S4). De acuerdo con este resultado, la razón de NaNO
3 no induce la muerte celular efectiva es que no genera efectivos RNS /ROS a diferencia de plasma de aire o H
2O
2 (figura S4).
agentes (a) Antioxdizing (NAC y cPTIO) o inhibidores de la quinasa (SP600125 y SB203580) rescataron parcialmente la muerte celular inducida por plasma. Los datos se muestran como la media ± S.E.M. (
n
= 10). (B) la muerte celular inducida por plasma se derogó parcialmente en JNK1 /2 (siJNK1 /2) o p38 (sip38) desmontables células. Para controlar la muerte celular inducida por plasma, ensayo de viabilidad celular basado en ATP se llevó a cabo en presencia de control, JNK1 /2, o p38 siRNA. Los datos se muestran como la media ± S.E.M. por triplicado a partir de tres experimentos independientes (
n
= 3). La viabilidad celular de la población sin tratar de células HeLa se estableció arbitrariamente a 100%. Inmunotransferencia con anti-JNK y p38 anticuerpos se realiza para confirmar caída. * P & lt; 0,01, ** p & lt; 0,05. (C) - (d) Aire plasma inducida Bax translocación a la mitocondria. El plasma o células
2 tratados con H 2O se incubaron adicionalmente durante 6-24 h. Después de 6-24 h de incubación, las células fueron fijadas en un 3,7% de formaldehído. Bax (verde) se tiñó anticuerpo anti-Bax y MitoTracker se utilizó para la tinción de las mitocondrias (rojo). se evaluaron Bax (verde) y la fluorescencia mitocondrial (rojo, MitoTracker), 6 h (d) y 24 h ((c) y (d)) después de la exposición a plasma de aire durante 5 minutos por microscopía de fluorescencia confocal. Bax se distribuyó de manera difusa en las células no tratadas (no tratado). Sin embargo, después del tratamiento con plasma, Bax se localizó en las mitocondrias, a partir de la superposición de las imágenes de fluorescencia Bax y Mitotracker (Merge, amarillo). DAPI se utilizó para la tinción nuclear (azul). barra blanca era magnificación media de la imagen (10 mM). (E) de la subasta formó un complejo proapoptótico con el tratamiento de plasma siguiente Bcl-XL. (F) la muerte inducida por el diferencial de células de plasma de aire en el A549 de adenocarcinoma de pulmón humano y líneas celulares de fibroblastos de pulmón MRC5 normales. células A549 y MRC5 fueron tratados con chorros de plasma de aire y después se incubaron adicionalmente durante 24 h. Después de la cosecha y las células de la tinción con anti-anexina V-FITC y PI, la muerte celular se evaluó mediante citometría de flujo. Los valores representan la media (S.E.M.) de tres experimentos independientes. (G) Un modelo propuesto para la apoptosis inducida por chorro de plasma de aire en las células HeLa a través de la producción de ROS /RNS, invadir las células, la activación de las vías de transducción de señales, y el daño mitocondrial.
Para investigar el papel de la JNK y p38 MAPK en las vías de la muerte celular por apoptosis inducida por plasma de aire, que emplean sus inhibidores específicos, SP600125 (inhibidor de JNK) y SB203580 (inhibidor de p38 MAPK). Cuando las células fueron pretratadas con SP600125 o SB203580 antes de la exposición de chorro de plasma de aire, la población de la muerte celular apoptótica se redujo a 59,3% ± 2,3% y 52,0% ± 9,7%, respectivamente, en comparación con la muerte celular inducida por el chorro de plasma solo (85,4 ± 3,4%) (figura 6a y la figura S3), sugiriendo que la transducción de señales a través de JNK y p38 está parcialmente implicado en la muerte celular inducida por plasma. Para obtener más información sobre los roles de JNK y p38 durante la muerte celular inducida por plasma, la viabilidad celular de JNK- o células p38-agotado se analizó después de un tratamiento de plasma mediante la medición de ATP a partir de células viables. Se encontró que la disminución inducida por plasma en la viabilidad celular fue atenuada por JNK1 /2 siRNA o p38 siRNA (Figura 6b).