Extracto
casete de unión a ATP (ABC) los transportistas están asociados con una mala respuesta a la quimioterapia, y confieren un mal pronóstico en diversos tumores malignos. Sin embargo, la asociación entre la expresión del miembro de ABC subfamilia G 4 (ABCG4) y el pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) sigue sin estar clara. muestras de tejido NSCLC (n = 140) y muestras de tejido pulmonar normal (n = 90) fueron resecados de pacientes con estadio II a IV NSCLC entre mayo de 2004 y mayo de 2009. ABCG4 ARNm y proteína expresiones fueron detectados por RT-PCR, western blot, e inmunohistoquímica. Los pacientes recibieron cuatro ciclos de quimioterapia después de la cirugía basada en cisplatino y fueron seguidos hasta el 31 de mayo
er, 2014. ABCG4 tasa de positividad fue mayor en el CPNM que en los tejidos pulmonares normales (48,6%
vs
. 0 %,
P Hotel & lt; 0,001) y la expresión ABCG4 se asoció significativamente con pobre diferenciación, etapa superior del nodo metástasis tumoral (TNM), y el adenocarcinoma tipo histológico (todo el
P Hotel & lt; 0,001). Univariable (HR = 2,284; IC del 95%: 1,570 a 3,324,
P Hotel & lt; 0,001) y multivariado (HR = 2.236 IC, 95%: 1,505 a 3,321,
P Hotel & lt; 0,001 ) Los análisis mostraron que la expresión ABCG4 fue un factor independiente asociado con un mal pronóstico en NSCLC. Los pacientes con CPNM ABCG4-positivo tuvieron supervivencia media más corta que ABCG4 negativo NSCLC (20.1
vs
43,2 meses,
P
. & Lt; 0,001). La importancia pronóstica de la expresión ABCG4 fue evidente en las etapas III y IV NSCLC. En conclusión, la expresión de alto ABCG4 se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CPNM tratados con quimioterapia basada en cisplatino
Visto:. Yang G, Wang XJ, Huang LJ, Zhou YA, Tian M, Zhao JB, et Alabama. (2015) Expresión de alta ABCG4 se asocia a peor pronóstico en células no pequeñas cáncer de pulmón los pacientes tratados con quimioterapia basada en cisplatino. PLoS ONE 10 (8): e0135576. doi: 10.1371 /journal.pone.0135576
Editor: Gergely Szakacs, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 29 de octubre de 2014; Aceptado: 23 de julio de 2015; Publicado: 13 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 81172224). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
alrededor de 1,5 millones de nuevos casos de cáncer de pulmón se diagnostican cada año en todo el mundo, y aproximadamente el 85% de ellos son los cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [1]. En 2012, alrededor del 58% de los casos de NSCLC se produjo en los países menos desarrollados [2]. La cirugía se considera que es la mejor opción de tratamiento, pero la resección potencialmente curativa es solamente el 20-25% de los tumores [1]. La mayoría de los pacientes se presentan con una enfermedad incurable y se enfrentan a una tasa de supervivencia relativa a 5 años de & lt; 17% con las terapias estándar actuales [3]. quimioterapia postoperatoria, con o sin radioterapia, mejora la supervivencia en un 4% en términos de supervivencia absoluto a 5 años, como lo demuestra un meta-análisis [4].
En la actualidad, los regímenes de quimioterapia de combinación a base de cisplatino son los más terapias de primera línea eficaces para el tratamiento del NSCLC, de acuerdo con las directrices National Comprehensive Cancer Network (NCCN) (versión 4.2014) [5]. Sin embargo, la eficacia de la quimioterapia está limitada, con tasas de respuesta (RR) de 20-35%, la supervivencia libre de progresión (SLP) de 3.1-5.5 meses, y la supervivencia global (OS) 7.4-11.3 meses [6,7]. De acuerdo con ello, mejorar los resultados después de la quimioterapia ha sido una de las cuestiones más difíciles en el tratamiento exitoso del cáncer de pulmón [8]. Esto se atribuye principalmente a la resistencia a los medicamentos, que se produce en casi todos los tipos de cáncer y es un grave impedimento para el éxito de la quimioterapia [6,7]. Cada vez se reconoce que las resistencias primarias y secundarias de medicamentos en desarrollo en las células cancerosas son el fracaso de la quimioterapia subyacente razón más fundamental [6,7].
La resistencia a fármacos es generalmente el resultado de la expresión excesiva de casete de unión a ATP (ABC) los transportistas [9,10]. proteínas transportadoras ABC son candidatos óptimos como biomarcadores para la predicción de la resistencia a la quimioterapia y el pronóstico después de la quimioterapia [11,12]. transportadores ABC son proteínas transmembrana que facilitan la translocación de sustancias heterogéneas través de las membranas celulares mediante la utilización de la energía de hidrólisis de ATP [13]. Hasta la fecha, al menos 48 genes transportadores ABC humanos han sido identificados, y que se han dividido en siete subfamilias (ABCA través ABCG) [14]. Entre estos, ABCA2, ABCB1 (también conocido como P-glicoproteína o a múltiples fármacos resistencia 1 (MDR1)), ABCB4, ABCB11, ABCC1-6, ABCC10, ABCC11, y ABCG2 (también conocido como BCRP o MXR) han demostrado ser asociados con el flujo de salida y el transporte de fármacos citotóxicos (estructuralmente diversos agentes quimioterapéuticos y sus metabolitos) de las células de cáncer de pulmón, reduciendo así las concentraciones de fármacos intracelulares [15]. ABCA1 también ha sido identificado como la mediación de la resistencia a fármacos en cáncer de pulmón y líneas de células de cáncer de pulmón resistentes a fármacos [16]. En la actualidad, la P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1) y ABCG2 se considera que son los principales transportadores de fármacos por su participación en la resistencia a múltiples fármacos observadas en muchos tumores y líneas celulares [17]. Aunque el descubrimiento y uso de inhibidores de los transportadores ABC se han estudiado durante los últimos años, estos inhibidores no eran completamente éxito en la superación de la resistencia a fármacos [18]. Como resultado de ello, la identificación de nuevas proteínas transportadoras de drogas ABC y la investigación de sus mecanismos y los inhibidores son muy justificada, y extremadamente importante para evaluar nuevos objetivos para superar la resistencia a los medicamentos.
Varios estudios han demostrado que los miembros de la ABCG ( o blanco) subfamilia están asociados con el transporte de lípidos celulares y resistencia a los medicamentos [19-21]. ABCG5 y ABCG8 son altamente expresado en las células epiteliales del intestino y acto que como un heterodímero; que se han asociado con el flujo de salida de los esteroles vegetales y colesterol en la bilis [22,23]. La sobreexpresión de la ABCG2 conduce a la resistencia de varias líneas celulares de cáncer a los fármacos anti-tumorales [24]. ABCG4 es el cuarto miembro de la familia "G", y se encuentra en el cromosoma 11q23.3. Este gen codifica una transcripción 3874 pb, y su expresión es predominantemente intracelular [25], pero la localización intracelular exacta aún no se ha demostrado [26]. De hecho, los diferentes transportadores ABC pueden ser localizados en la membrana celular, en la mitocondria, en el aparato de Golgi, en el retículo endoplásmico, o en la membrana nuclear, donde participan en diferentes procesos celulares [26]. Por otra parte, de acuerdo con estudios anteriores [27-30], la expresión ABCG4 en CPNM sigue sin estar clara. Estudios previos han revelado que ABCG1 y ABCG4 son responsables del transporte del colesterol en lipoproteínas de alta densidad (HDL) partículas [31,32], y la sobre-expresión de ABCG4 también confiere resistencia a alquil-fosfolípidos análogos (miltefosina, edelfosina, y perifosine ) en
Leishmania
[33]. Sin embargo, si ABCG4 juega un papel importante en el pronóstico después de la quimioterapia, y también si se tiene la función de potencial de mediar la resistencia a fármacos en cáncer de pulmón no están claros. Por lo tanto, el presente estudio se centró en la comprensión de la expresión y el valor pronóstico después de la quimioterapia de ABCG4 en el CPNM.
En este estudio retrospectivo, se investigó la expresión de ABCG4 en el CPNM. También se evaluó el valor de la proteína ABCG4 para predecir la supervivencia en pacientes con CPNM tratados con cisplatino basado en la quimioterapia de combinación.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Un total de 140 muestras de tejido de NSCLC (74 casos de cáncer de pulmón carcinoma de células escamosas y 66 casos de adenocarcinoma de pulmón) y 90 normales muestras de tejido pulmonar (localizado & gt; 5 cm de los tumores primarios) obtenidos mediante la resección quirúrgica en el Departamento de Cirugía Torácica, Tang Du hospital Afiliado a la Cuarta Universidad médica Militar (Xi'an, china) entre mayo de 2004 y mayo de 2009, fueron investigados en el presente estudio. Tumor y los tejidos pulmonares normales se recogieron usando instrumentos quirúrgicos estériles
Los pacientes tenían entre 45-76 años (media ± DE: 60,76 ± 6,88 años).. Todas las muestras fueron examinadas por patólogos, y la clasificación histológica de los tumores se realizó de acuerdo a los criterios de la Organización Mundial de la Salud. Los tumores fueron clasificados como etapa II (n = 42), III (n = 56), o IV (n = 42) de acuerdo con las guías de la NCCN (Versión 4.2014) [5]. Se registraron las características clinicopatológicas de todos los pacientes. Ningún paciente había recibido quimioterapia, radioterapia, terapia biológica, o cualquier otra operación antes de la cirugía del cáncer de pulmón. Todos los pacientes fueron tratados con regímenes de quimioterapia de combinación a base de cisplatino considerados como regímenes postoperatorios estándar para el NSCLC [5]. Todos los pacientes recibieron cuatro ciclos de regímenes de combinación de quimioterapia basada en cisplatino (75 mg /m
2 días y 1 + gemcitabina 1250 mg /m
2 días 1, 8, cada 21 días /pemetrexed 500 mg /m
2 días y 1 cada 21 días /docetaxel 75 mg /m
2 el día 1 cada 21 días). El seguimiento fue censurado el 31 de mayo
st, 2014, con un periodo total de seguimiento de 60 meses. El día cuando la quimioterapia comenzó se consideró como el punto de partida para la estimación de la supervivencia postoperatoria
Todas las muestras se dividieron en dos partes:. La primera parte se colocó en un 0,1% de pirocarbonato de dietilo (DEPC) tubo de congelación tratada con agua y se almacena a -80 ° C; la segunda parte se fijó en formalina al 10% tamponada neutra y luego deshidratada destinados a la inclusión en parafina.
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Regional de Ética de Investigación Clínica de la Cuarta Universidad Médica Militar. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de sus registros médicos y muestras de tejidos con fines de investigación.
Invertir reacción en cadena de la polimerasa con transcripción (RT-PCR)
muestras de tejido congelado (100 mg) se recogieron y se muelen en un polvo fino. Las células A549 se transfectaron de forma estable con el vector pcDNA3.1 que contiene ABCG4 (Takara Bio, Otsu, Japón) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, y se añadieron los plásmidos de ADN y reactivo de transfección de 24 h más tarde. A549 células transfectadas se cultivaron en presencia de G418 (400 mg /ml; Life Technologies Co., Grand Island, NY, EE.UU.). Se recogieron las células resistentes a G418 (A549-ABCG4) para el análisis RT-PCR.
extracción de ARN se llevó a cabo usando el RNA total Kit I (Omega, Norcross, GA, EE.UU.). La concentración y la pureza de las muestras de ARN se determinaron mediante la absorbancia a 260 y 280 nm (A260 /280) por espectrofotometría (Beckman DU800, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EE.UU.).
síntesis de ADNc se realizó utilizando un kit de transcripción inversa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) usando el Random Hexamer Primer, y RevertAid M-MuLV transcriptasa inversa. La amplificación por PCR se realizó con 2 × Mastermix Taq (CWBio, Pekín, China). La desnaturalización inicial se realizó a 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 35 s, hibridación a 51 ° C durante 35 s, y extensión a 72 ° C durante 35 s, con una extensión final a 72 ° C durante 5 min (Tabla 1). Los productos de PCR fueron analizados en un 2% geles de agarosa utilizando un generador de imágenes de gel (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, EE.UU.).
Western blot
muestras de tejido congelado (100 mg) se cortaron en trozos pequeños y homogeneizado en un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) buffer [1 × PBS, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 10 mg /ml de leupeptina, 100 g /ml de fluoruro de p-aminophenylmethylsulfonyl (p-APMSF) y 10 mg /ml de aprotinina] en hielo durante 1 h, y se centrifugaron a 14.000 ×
g
para 30 min. células A549-ABCG4 se lisaron con el tampón RIPA en hielo durante 1 h y se centrifugaron a 14.000 xg durante 30 min. El sobrenadante se recogió y se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA). lisados de proteínas (50 mg) se separaron por electroforesis en gel de 12% SDS-poliacrilamida (PAGE) y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas a 2,5 mA /cm
3 por 30 min. Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en polvo durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con los anticuerpos primarios (anti-ABCG4 anticuerpo policlonal de conejo, 1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.; anticuerpo monoclonal de conejo y anti-β-actina , 1: 1000, CW Bio, Pekín, china) a 4 ° C, durante la noche. a continuación, las membranas se lavaron con tampón de TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM y 0,1% de Tween-20), y posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario (anticuerpos de cabra anti-conejo, 1: 5000, CW Bio, Beijing , china) a 37 ° C durante 1 h, seguido por el desarrollo de color utilizando el kit cromogénico Millipore para transferencias Western (Billerica, MA, EE.UU.) y observación bajo un analizador de quimioluminiscencia (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
La inmunohistoquímica
tejidos embebidos en parafina se cortaron en secciones de 3-5 micras de desparafinado y rehidratación. La inmunohistoquímica se realizó después de la recuperación de antígeno basado en el calentamiento por microondas en tampón de citrato 0,1 M (pH = 6,0) seguido de incubación con 3% de H
2O
2 a temperatura ambiente durante 30 min, suero de cabra al 10% a temperatura ambiente durante 30 min, anticuerpo primario (anti-ABCG4 anticuerpo policlonal de conejo, 1:40, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C, anticuerpo secundario marcado con biotina (Bio CW, Pekín, china) a temperatura ambiente durante 30 min , y recién preparado 3,3'-diaminobencidina (DAB) para el desarrollo del color durante 5 min. Las secciones se aclararon a fondo con agua, re-teñidas con hematoxilina, deshidratados, despejado en xileno y se montaron con un cubreobjetos. La especificidad del anticuerpo anti-ABCG4 fue probada usando péptidos ABCG4 de bloqueo (1: 200; sc-34874; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los péptidos de bloqueo se añadieron a las diapositivas y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Después, se añadió el anticuerpo primario y reveló como se describe anteriormente.
Las muestras se clasificaron como "positiva" cuando la membrana celular y /o citoplasma se tiñeron de color marrón. Se seleccionaron cinco campos de alta potencia (400 ×) al azar, y cada diapositiva se evaluó de forma independiente por dos patólogos experimentados cegados a los datos clínicos. Fosfato-solución salina tamponada (PBS), en lugar del anticuerpo primario, se utilizó como un control en blanco.
Las muestras se puntuaron de acuerdo con la intensidad de la tinción y el porcentaje de células positivas. Los resultados se puntuaron sobre la base de los siguientes criterios: a) el porcentaje de células positivas (≤5%: 0; 6-25%: 1; 26 a 50%: 2; 51 a 75%: 3; y & gt; 75% : 4); b) la intensidad de la tinción (no hay color: 0; amarillo: 1; marrón: 2; y fuego: 3); y c) los dos grados se multiplican entre sí y las muestras fueron asignados a uno de los 4 niveles: 0: negativo (-); 1-4: débilmente positivo (+); 5-8: moderadamente positivo (++); 9-12: fuertemente positiva (+++) [34]. Para el análisis multivariado y la comparación con las curvas de supervivencia, -era define como negativo, y +, ++ y +++ se define como todo positivo.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS 18.0 (IBM, Armonk, Nueva York, EE.UU.). Las asociaciones entre la expresión inmunohistoquímica y las variables clínicas fueron evaluadas por Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis H, según el caso. La supervivencia global se mide desde el inicio de la quimioterapia a la fecha de la muerte por cualquier causa o la fecha en que el paciente se encontraba última considerarse que está vivo. Las curvas de supervivencia se estimaron mediante el método de Kaplan-Meier, y se compararon mediante la prueba de log-rank. El modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para los análisis univariados y multivariados. Las correlaciones se evaluaron mediante el análisis de correlación de Spearman. Los coeficientes de correlación de rangos se expresaron como
r
s. 0.0≤
r
s Hotel & lt; 0,1 se consideró como no correlacionados; 0.1≤
r
s Hotel & lt; 0,3 se consideró como débilmente correlacionado; 0.3≤
r
s
≤0.5 fue considerado como moderadamente correlacionados;
r
s Hotel & gt; 0,5 se consideró como una fuerte correlación. Dos caras
P-valores
. & Lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Resultados
ARNm y proteínas ABCG4 expresiones en NSCLC y los tejidos pulmonares normales
Para investigar la expresión de ARNm ABCG4 en NSCLC y muestras de tejido pulmonar normal, RT-PCR se realizó en ARNm aislado de los tejidos de NSCLC (n = 14) y los tejidos pulmonares normales (n = 2). Se observó la detección de un producto de PCR de 383 pb correspondiente a ABCG4 mRNA en tejidos de NSCLC (Fig 1B), mientras que no se observó ninguna banda de este tipo en los tejidos pulmonares normales (Fig 1A). La amplificación de β-actina (416 pb) se observó claramente en los dos tipos de tejidos (Fig 1).
se utilizó β-actina como referencia interna. M: marcador. (A) Carril 1: control positivo (A549-ABCG4). Los carriles 2-3: tejidos pulmonares normales (NORM) (n = 2); tejidos (B) NSCLC (NSCLC) (n = 14, carriles 1-14).
Para investigar la expresión de la proteína en el CPNM ABCG4 y los tejidos pulmonares normales, Western blot se llevó a cabo en el conjunto de muestras utilizados para la RT-PCR. se observó expresión de la proteína ABCG4 (60 kDa) en los tejidos de NSCLC (Fig 2B y S1 FIG), pero no en tejidos de pulmón normales (Fig 2A). β-actina (43 kDa) se utilizó como un control de normalización y se observó en ambos tipos de tejido (Fig 2 y Fig S1).
transferencias completas se muestran en la Fig S1 β-actina (43 kDa) fue utilizado como referencia interna. (A) Carril 1: control positivo (A549-ABCG4). Los carriles 2-3: tejidos pulmonares normales (NORM) (n = 2); (b) Los tejidos de NSCLC (NSCLC) (n = 14, carriles 1-14).
Estos resultados indicaron que ABCG4 ARNm y proteína expresiones eran obviamente diferentes entre NSCLC y los tejidos pulmonares normales.
expresión de la proteína ABCG4 en CPNM y los tejidos pulmonares normales por inmunohistoquímica
Para investigar más a fondo la expresión de la proteína ABCG4 en el CPNM, inmunohistoquímica se realizó en NSCLC (n = 140) y los tejidos pulmonares normales muestras (n = 90) (Fig 3). No expresión ABCG4 se observó en las muestras de tejido normal (Fig 3A). Algunas de las muestras de NSCLC también mostraron ninguna expresión (-) (Fig 3B), mientras que otras muestras fueron débilmente positivo (+) (figura 3C), moderadamente positivo (++) (Fig 3D), o fuertemente positiva para ABCG4 (++ +) (Fig 3E). tinción ABCG4-negativas se mostró en las muestras de tejido NSCLC (++) utilizando el bloqueo de ABCG4 péptido (Figura 3F). Sobre la base de inmunohistoquímica, se detectó expresión ABCG4 en 48.6% de los casos de NSCLC (68/140, 40 +, 23 ++, y 5 +++), y no se detectó en ninguna de las 90 muestras normales de tejido de pulmón (
P
. & lt; 0,001) (Tabla 2)
(A) tejido pulmonar normal; (B) Negativo (-) tinción de ABCG4 en el tejido CPNM; tinción débilmente positivo (+) de ABCG4 en el tejido NSCLC (C); (D) moderadamente positivo (++) tinción de ABCG4 en el tejido CPNM; (E) fuertemente positiva (+++) tinción de ABCG4 en el tejido CPNM; (F) La inmunohistoquímica que muestra tinción ABCG4-negativos en los tejidos de NSCLC (++) usando ABCG4 bloqueo péptido. Ampliación:.. 200 ×
Estos resultados sugieren que ABCG4 se expresa en los tejidos de NSCLC, y que no se expresa en los tejidos pulmonares normales
Asociación entre la expresión y ABCG4 características clínico-patológicas en pacientes con CPNM
Tras concluir que la ABCG4 se sobreexpresa en casi la mitad de las muestras de tejido de NSCLC, se investigaron la asociación entre la expresión ABCG4 y las características de los pacientes. No hubo correlación significativa con los hábitos de género, edad, o fumadores (todo el
P Hotel & gt; 0,05). Sin embargo, la expresión de alto ABCG4 se correlacionó significativamente con adenocarcinoma de pulmón (53,0%) más que el carcinoma de pulmón de células escamosas (44,6%) (
P Hotel & lt; 0,001), en poco (55,2%) más que bien /moderadamente ( 42,5%) diferenciado NSCLC (
P
= 0,008), y con el aumento de metástasis en los ganglios tumoral (TNM) en estadio II, III y IV (31,0%
vs
. 53,6%
vs
59,5%, respectivamente) (
P
& lt; 0,001) (Tabla 3). Por otra parte, los niveles de expresión ABCG4 fueron débilmente correlacionado positivamente con el aumento de la etapa TNM (
r
s
= 0,210,
P
= 0,013) (datos no mostrados) .
Estos datos sugieren que la expresión ABCG4 se asoció con la diferenciación del tumor, el estadio TNM y el tipo histológico, y que los niveles de expresión ABCG4 se asociaron positivamente con el estadio TNM.
Asociación entre la expresión ABCG4 y la supervivencia de los pacientes con CPNM tratados con quimioterapia basada en cisplatino
Para investigar la relación entre la expresión ABCG4 y el resultado clínico de los pacientes con CPNM tratados con quimioterapia de combinación basada en cisplatino, univariante y multivariante se realizaron con los riesgos proporcionales de Cox modelo para determinar si el valor pronóstico de ABCG4 era independiente de otros factores. En el análisis univariante, el sexo, el tabaquismo, la edad y la histología no influyó en el pronóstico (todos los
P Hotel & gt; 0,05). expresión ABCG4 (hazard ratio [HR]: 2.284), el estadio TNM alta (HR: 3.124), y la mala diferenciación (HR: 1,869) se asociaron significativamente con un mal pronóstico (Tabla 4). Por otra parte, los factores que se asociaron con un
P-valor
& lt; 0,05 en el análisis univariado se incluyeron en un análisis multivariado. Los resultados mostraron que, además del estadio TNM (HR: 3.098) y diferenciación (HR: 1.811), la expresión ABCG4 fue un factor pronóstico independiente de supervivencia de los pacientes con NSCLC. El valor ABCG4 positivo para el sistema operativo arrojó un CR de 2.236 (Tabla 4). Estos resultados indican que la expresión ABCG4 era un factor pronóstico adverso en pacientes con CPNM tratados con quimioterapia basada en cisplatino.
OS curvas se muestran en la figura 4, de acuerdo con el estado de la expresión ABCG4. La mediana de supervivencia fue de 43,2 y 20,1 meses en los pacientes con ABCG4-negativos y positivos ABCG4 NSCLC, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,0001, Figura 4A). La mediana de supervivencia fue de 54, 32 y 14.15 meses en pacientes con estadios II, III, y IV NSCLC, respectivamente (
P Hotel & lt; 0,0001, Figura 4B). La mediana de supervivencia fue de 39,5 y 25,2 meses en los pacientes con bien diferenciado /moderadamente y mal NSCLC, respectivamente (
P = 0,0008
, la figura 4C). La mediana de supervivencia en el grupo ABCG4-negativo fue de 39,5 meses, en comparación con 21,05 meses en el grupo ABCG4-positivo en estadio III (
P = 0,0002
, figura 4E). Por otra parte, la mediana de supervivencia en el grupo ABCG4-negativo fue de 31,9 meses, en comparación con 13,8 meses en el grupo ABCG4-positivo en estadio IV (
P = 0,0226
, la figura 4F). Sin embargo, la supervivencia media en el grupo ABCG4-negativo fue de 54,2 meses, en comparación con 50,1 meses en el grupo ABCG4-positivo en estadio II, y no hubo una diferencia significativa en la SG con respecto a la expresión ABCG4 (
P =
0,8127, figura 4D).
(a) curvas de Kaplan-Meier se representaron para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM en base a la expresión ABCG4 (negativo
vs
. positivo). Se representaron (B) Las curvas de Kaplan-Meier para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM basados en la etapa nodo metástasis tumoral (TNM) (II
vs
. III
vs
. IV). Se representaron las curvas (C) de Kaplan-Meier para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM basada en la diferenciación (mal
vs
. moderadamente /pocillo). Se representaron las curvas (D) de Kaplan-Meier para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM estadio TNM II basado en la expresión ABCG4 (negativo
vs
. positivo). Se representaron las curvas (E) de Kaplan-Meier para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM estadio TNM III basado en la expresión ABCG4 (negativo
vs
. positivo). Se representaron las curvas (F) de Kaplan-Meier para determinar la tasa de supervivencia acumulada de los pacientes con CPNM estadio TNM IV sobre la base de la expresión ABCG4 (negativo
vs
. positivo). Negativo:-; Positivo: +, ++ y +++
Discusión
Ya se ha establecido que los transportadores ABC están involucrados en la MDR y tienen un efecto sobre la eficacia de los regímenes de quimioterapia [. ,,,0],11,12]. El propósito de este estudio fue investigar ABCG4 y su expresión en el CPNM con el fin de evaluar si existe una asociación entre la expresión ABCG4 y el resultado de los pacientes después de la quimioterapia. En este estudio, hemos proporcionado evidencia sólida para ABCG4 ARNm y la expresión de proteínas en algunas muestras de tejido NSCLC, pero no en ninguno de los tejidos pulmonares normales. Por otra parte, la expresión ABCG4 se asoció con diferentes grados de diferenciación, estadio TNM, y el tipo histológico. Análisis univariado y multivariado sugirió que el estadio TNM, la diferenciación y la expresión ABCG4 eran factores independientes que participan en el pronóstico en esta población de pacientes con CPNM tratados con quimioterapia basada en cisplatino. Estos resultados sugieren una peor supervivencia en pacientes con CPNM ABCG4-positivos tratados con quimioterapia basada en cisplatino.
ABCG4 expresión fue significativamente mayor en muestras de tejido de NSCLC en comparación con las muestras normales de tejido pulmonar. Por otra parte, la expresión ABCG4 se asoció con diferentes grados de diferenciación, estadio TNM, y el tipo histológico. Estudios anteriores han demostrado que a pesar de las similitudes en la secuencia, estructura y función de la MDR entre ABCG2 (BCRP) y ABCG4, ABCG2 no está asociado con el género, historia de tabaquismo, el estado funcional (PS), el tipo histológico y el estadio TNM en NSCLC [35 , 36], mientras que observamos asociaciones entre ABCG4 y el tipo histológico, grado de diferenciación, y el estadio TNM. Una explicación puede ser que la especificidad y la diversidad de secuencia y estructura entre ABCG genes subfamilia transportadoras contribuyen a esta discrepancia. Además, la expresión de las proteínas de la subfamilia ABC transportador varían con variables clínicas; por ejemplo, la expresión de ABCB1 es significativamente mayor en las mujeres que en los hombres, y más alta en el carcinoma de células no escamosas que en el carcinoma de células escamosas en el CPNM. Sin embargo, la expresión ABCC2 es significativamente mayor en CPCNP en estadio IV en comparación con el estadio IIIB, mientras que no existe una correlación significativa entre la expresión ABCC1 /ABCC3 y variables clínicas en NSCLC [35]. Esta discrepancia se debe investigarse más a fondo. ABCG4 también comparte algunas similitudes con ABCG1. Sin embargo, la actividad ATPasa basal de ABCG4 es menor que la de ABCG1, y ABCG4 no es inhibida por los mismos medicamentos como ABCG1 [37]. Sin embargo, la interacción exacta y el papel de esta interacción entre ABCG1 y ABCG4 todavía tienen que ser dilucidado [38].
Los estudios anteriores han demostrado que media la ABCG4 flujo de salida de los esteroides endógenos en las células y los transfiere a los de alto lipoproteínas de densidad (HDL), contribuyendo así a mantener la homeostasis del colesterol [30,39]. Sin embargo, Castanys-Muñoz et al. han descubierto que la sobre-expresión de ABCG4 también participa en los análogos de alquilo-fosfolípido (miltefosina, edelfosina, y perifosine) resistencia en
Leishmania
[33]. Los resultados del presente estudio sugieren una menor supervivencia en pacientes con CPNM ABCG4-positivos tratados con quimioterapia basada en cisplatino. Especulamos que los pacientes con CPNM ABCG4-positivas pueden mostrar resistencia a la quimioterapia basada en cisplatino. Sugerimos que ABCG4 puede servir como una diana molecular para reducir la resistencia a los medicamentos en el CPNM. La relación entre ABCG4 y resistencia a los medicamentos, y en especial la resistencia a múltiples fármacos, se abordará más específicamente en estudios futuros.
Por otro lado, este fue el primer estudio para investigar la relación entre la expresión y el pronóstico en ABCG4 pacientes con NSCLC. Sobre la base de las curvas del sistema operativo, los pacientes ABCG4-positivos tenían una mediana de supervivencia más corta que los pacientes ABCG4-negativos a excepción de CPCNP en estadio II (
P = 0.8127)
. La mediana de supervivencia no fue significativamente diferente en NSCLC en estadio II, lo que puede deberse a que los niveles de expresión ABCG4 fueron relativamente bajos en NSCLC en etapa II, y que el número de pacientes ABCG4-positiva con CPCNP en estadio II fue relativamente pequeño (n = 13). Por lo tanto, este resultado debe interpretarse con precaución. El análisis multivariado y univariado mostró que, además estadio TNM y la diferenciación, ABCG4 se asoció independientemente con la SG en NSCLC tratados con cisplatino basado en la quimioterapia de combinación. Estos resultados sugieren que la expresión ABCG4 puede ser factor de riesgo independiente de pronóstico y predictivo de biomarcadores en pacientes con NSCLC tratados con base de cisplatino quimioterapia de combinación. Nuestros resultados son consistentes con los de Yoh et al. Ota y col., que apoyan un papel predictivo para ABCG2 en el pronóstico de los pacientes con CPNM tratados con cisplatino basado en la combinación de quimioterapia [35,36]. Además, se especula que la expresión ABCG4 ARNm puede ser utilizado para diseñar la quimioterapia individualizada para pacientes con CPNM.
Este estudio tiene algunas limitaciones. De hecho, el tamaño de la muestra era pequeña, y un tamaño de muestra más grande sería preferible. También tuvimos no hay sujetos de control sanos debido a la resección pulmonar en individuos sanos es muy invasiva y poco ético. Sin embargo, los tejidos de control de los pacientes con CPNM fueron histológicamente diferentes de los tejidos y tumores & gt; 5 cm de distancia de los tumores, por lo que presume que se trataba de un control efectivo en las circunstancias. Por último, la localización intracelular de ABCG4 se evaluará en un trabajo futuro. Más estudios serán realizar en diferentes líneas celulares de cáncer que sobreexpresan ABCG4 solo o en combinación con otros transportadores ABC, que debe ayudar a dilucidar el papel exacto y la función de ABCG4 en el CPNM.
Conclusiones
este estudio sugiere que la expresión de alto ABCG4 se asocia con un mal pronóstico en pacientes con CPNM tratados con quimioterapia basada en cisplatino, y pacientes con CPNM ABCG4-positivas pueden mostrar resistencia a la quimioterapia basada en cisplatino. Por otra parte, el presente estudio es el primero en indicar un posible papel de la expresión ABCG4 como un factor predictivo independiente de mal pronóstico en pacientes con CPNM tratados con cisplatino basado en la quimioterapia de combinación. Sin embargo, se necesitan más estudios con mayor tamaño de la muestra y las células para confirmar estos resultados, y la vía específica y el mecanismo de la conducción de este efecto es necesario un mayor estudio. Estos pueden conducir a un enfoque novedoso para la inversión de la resistencia a los fármacos de quimioterapia mediante la comprensión de ABCG4 y su mecanismo en el CPNM.
Apoyo a la Información
S1 Fig. . Western blot lleno de proteínas ABCG4 (60 kDa)
expresión β-actina (43 kDa) se utilizó como referencia interna
doi:. 10.1371 /journal.pone.0135576.s001 gratis (PDF)
S1 archivo. . Los datos en bruto para el análisis de riesgos proporcionales de Cox modelo y las curvas de Kaplan-Meier
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