Extracto
BORIS /CTCFL es un miembro de la familia de antígenos del cáncer de testículo que normalmente se expresa en las células germinales. En los tumores, se expresa de forma aberrante aunque no están completamente bien definidos sus funciones. Para comprender mejor las funciones de BORIS en el cáncer, se seleccionaron las células cancerosas embrionarias como modelo. Usando una baliza molecular, que se dirige específicamente a
BORIS
ARNm, hemos demostrado que las células son positivas BORIS una pequeña subpoblación de células tumorales (3-5% del total). Las células BORIS-positivos aislados mediante baliza molecular BORIS, expresan telomerasa superior
hTERT
, celular (
NANOG, Oct4, Sox2
) y genes marcadores de células madre del cáncer (
CD44
y
ALDH1
) en comparación con las células tumorales BORIS-negativos. Con el fin de definir el papel funcional de BORIS, se generaron células cancerosas embrionarias-agotado BORIS estables.
BORIS
silenciar fuertemente reducido regulado la expresión de
hTERT
, células madre y madre del cáncer de genes marcadores de células. Por otra parte, la caída BORIS aumentó la senescencia celular en las células cancerosas embrionarias, revelando un posible papel de BORIS en el programa de senescencia biológica. Nuestros datos indican una asociación de células que expresan BORIS subpoblación con la expresión de genes de troncalidad, destacando el papel fundamental desempeñado por BORIS en la enfermedad neoplásica embrionaria
Visto:. Alberti L, Renaud S, L Losi, Leyvraz S, Benhattar J (2014) alta Expresión de
hTERT
y genes stemness en BORIS /células CTCFL positivos aislados de células de cáncer embrionario. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10.1371 /journal.pone.0109921
Editor: Gabriele Saretzki, Universidad de Newcastle, Reino Unido
Recibido: 20 Junio, 2014; Aceptado: 12 de septiembre de 2014; Publicado: 3 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Alberti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (número de concesión: 31003A-113505; www.snf.ch).; y la Fundación Emma Muschamp (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Uno de los autores (JB) es empleado de un laboratorio de patología molecular (Lab Biopath ). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El hermano del regulador de sitios de impronta (BORIS) también diseñado como CTCFL, factor de CCCTC vinculante -como, es una proteína de unión al ADN con funciones en el cáncer no está completamente entendido. CTCF es un muy conservadas de expresión ubicua, factor, la cromatina multifuncional que desempeña un papel como un gen supresor de tumor [1] - [3]. BORIS es un mamífero de la paralog CTCF, comparten el mismo dominio de dedos de zinc-11, pero difieren en N y C terminales. Dentro de este dominio dedo de zinc, BORIS y CTCF exhiben 70% de homología [4]. En los tejidos normales,
BORIS
expresión está restringida a las células germinales, en los que está implicada en la reprogramación epigenética [4], [5].
BORIS
se expresa en espermatocitos durante el desarrollo de la línea germinal masculina, al parecer en ausencia de CTCF [4]. En los tumores, BORIS se expresa de manera aberrante y se detectó su transcripción a diferentes niveles en varias líneas celulares de cáncer y en tumores primarios [6]. Debido a su expresión restringida en tejidos normales germinales y su re-expresión en una amplia variedad de tumores, BORIS pertenece a antígeno testículo de cáncer familiar (CTA). Se ha demostrado que BORIS indujo la expresión de otros genes de CTA, como MAGE-A1, NY-ESO-1 [7], [8] y SPANX [9], pero no en todos los tumores [10], [11]. Además, que anteriormente mostró que BORIS activa
hTERT
expresión mediante la unión al primer exón del
hTERT
gen de la telomerasa en las células tumorales embrionarias y de ovario [12]. Además, en estudios de expresión BORIS exógeno en las células normales BORIS-negativo, hemos demostrado que estas células transfectadas mostraron altos niveles de
hTERT
ARNm [12]. Todos estos resultados revelaron un papel importante de BORIS en el proceso de inmortalización durante la tumorigénesis. Curiosamente, los informes actuales muestran una correlación entre
hTERT
de expresión y el tallo propiedades de células [13] - [17]. Otras investigaciones con respecto a la correlación entre las funciones de Boris y las principales funciones de hTERT en la inmortalización y propiedades stemness tienen que ser realizadas. Otra cuestión aún no está claramente contestada es el número de células, dentro de una línea de células tumorales, expresan
BORIS
. En este trabajo se aborda estas cuestiones. Para este fin, se seleccionaron para utilizar la tecnología de imagen baliza molecular (MB), ya que es un método aprobado para detectar y también para visualizar la expresión de ARNm [18]. MBs son oligonucleótidos estructurados como horquilla tallo-bucle con un bloqueador de la fluorescencia en un extremo y, en el extremo opuesto, un colorante fluorescente también llamado fluoróforo. Debido a su estructura específica, MBs emiten señales de fluorescencia sólo cuando la unión a sus objetivos. Para explorar la frecuencia de las células BORIS-positivos dentro de las líneas de células tumorales, primero se ha diseñado un MB
BORIS
ARNm diana, y luego se analizaron
BORIS
expresión en líneas celulares de tumores embrionarios y de ovario humano, respectivamente NCCIT y OVCAR3. Después de verificar que BORIS-MB permite la separación FACS de las células BORIS-positivos, se demostró que las células BORIS-positivos aislados expresan un mayor nivel de ARNm de
hTERT
y los genes stemness comparación con las células NCCIT los no ordenados BORIS-negativo y . Además, confirmó este resultado por
BORIS
silenciar estudios. Por otra parte, hemos demostrado que protege de BORIS proceso de senescencia. En conjunto, nuestros datos confirman un papel directo de BORIS en la enfermedad neoplásica embrionaria
Materiales y Métodos
Las células
Las líneas celulares humanas (BJ, fibroblastos de prepucio;. HeLa, de cuello de útero adenocarcinoma; NCCIT, carcinoma embrionario; OVCAR3, carcinoma de ovario) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2, ya sea en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco, Invitrogen) para las células HeLa y BJ, o en medio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) para NCCIT y OVCAR3 , suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Invitrogen) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen).
baliza molecular (MB) de diseño
secuencias de BORIS-MB1 y Boris-MB2 fueron diseñados utilizando Beacon Designer (Premier Biosoft).
BORIS
mRNA estructuras secundarias se prevé la utilización de software mFold (mFold, http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) y la especificidad se determinó mediante la búsqueda BLAST (NCBI). La secuencia diana de BORIS-MB1 se encuentra en el exón 2 y el de BORIS-MB 2 se encuentra en el exón 11 del
BORIS
ARNm. Estos lugares fueron escogidos ya que están fuera del dominio de dedos de zinc y no una hibridación cruzada con las regiones de homología CTCF. Además, el estudio previo ha demostrado que el inicio y las regiones que terminan de mRNA son los más accesibles para los MBs de hibridación [19]. El AZAR-MB que se utilizó como control negativo no coincide con ninguna de las secuencias de mamíferos [19]. Las secuencias fueron los siguientes: BORIS-5'-MB1 CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 '; BORIS-5'-MB2 CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 'y 5' AZAR-MB-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3 '(bases subrayadas indican las complementarias a las secuencias diana). Un fluoróforo (Cy3 o ATTO647) fue 5'-conjugado y un Agujero Negro Refrescante (BHQ-2) se relacionó con el extremo 3 '. El MBS se adquirieron de Sigma y se purificaron por cromatografía líquida de alta presión.
in vitro
determinación de MB En especificidad
Los oligos fueron diseñados para ser específicos de los MBs objetivos (BORIS-MB1 objetivo específico: 5'-AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 '; objetivo específico BORIS-MB2: 5'-CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3' y objetivo específico AZAR-MB: 5'-TATCGGTGCGCTTGTCG-3 '). Un oligo no específica se utilizó para la
in vitro
prueba de los diferentes MBs. Este oligo no específico, 5'-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 ', corresponde a una variante de transcripción de CTCF. Para probar la especificidad en solución, 200 nM de MB se mezcló o no con 1 M de oligo en 10 l de medio Opti-MEM (Invitrogen).
La emisión se obtuvieron perfiles de fluorescencia después de calentar el MB-objetivo mezcla oligo a una elevación de temperatura progresiva que van de 15 a 80 ° C usando de 1 ° C. La señal de fluorescencia fue adquirido al final de cada grado cada vez mayor y se detecta en el canal Cy3 usando un 6000 Real-Time PCR sistema Rotor Gene (Corbett Life Science).
MB de entrega y la fluorescencia de células de imágenes
las células fueron separadas utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) y se resuspendieron en medio DMEM libre de suero a una concentración de 10
6 células /ml. En primer lugar, Cy3-BORIS-MB o Cy3-RANDOM-MB (200 nM) se incubó a temperatura ambiente en presencia de 1 l /ml de reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX siRNA (Invitrogen) utilizando medio Opti-MEM. El reactivo Lipofectamine RNAiMAX fue utilizado como vehículo de suministro ya que en nuestras condiciones dio menos fondo en comparación con otros reactivos tales como estreptolisina (datos no mostrados). Después de 10 min, se añadió la mezcla de transfección a las células en suspensión y en conjunto se incubó durante 1 hora a 37 ° C. Hoechst 33342 (Invitrogen) se añadió a una concentración de 5 mg /ml durante los últimos 10 minutos de incubación. Luego, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen) y se resuspendieron en PBS con EDTA 5 mM. Las células transfectadas se cytocentrifugated en portaobjetos de vidrio utilizando una centrífuga cytospin y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia (Axioplan2 Imaging, Zeiss). La señal de fluorescencia de Cy3-MB coniugated se analizó utilizando el canal rojo y Hoechst 33342 emisión de fluorescencia se observó bajo del canal azul.
FACS análisis y clasificación utilizando MB
Para el análisis FACS y clasificación de células, utilizamos MBs conjugados con ATTO 647, un colorante que se caracteriza por su alta fotoestabilidad [20]. Las células se prepararon y se incubaron con MBs como se describe anteriormente (a excepción de que Hoechst 33342 no se añadió) y se analizaron directamente usando Gallios citómetro de flujo (Beckman Coulter). Al menos 10.000 acontecimientos se recogieron y se analizaron por Kaluza Software. Las poblaciones BORIS-positivas y negativas-BORIS fueron ordenados después de la exclusión de las células muertas de yoduro de propidio (PI) tinción utilizando FACSAria I (Becton Dickinson) instrumento en el Centro de Citometría de Flujo de UNIL (Universidad de Lausana, Suiza). Los rangos de 2 × 10
4-9 × 10
4 células BORIS-positivas y 2 × 10
5-9 × 10
5 se clasificaron las células BORIS-negativos.
BORIS caída por el sistema inducible lentiviral shRNA
las líneas celulares estables que expresan shRNAs con inducibles de orientación humana
BORIS
ARNm se generaron usando el sistema inducible por doxiciclina ARNhc lentiviral, pINDUCER [21]. Los pINDUCER11 lentiviral vector expresa constitutivamente la proteína fluorescente reportero eGFP, que permite realizar un seguimiento de las células transducidas por el virus. Este vector también contiene un casete con un promotor inducible por doxiciclina que controla la transcripción de un gen indicador tRFP junto con el shRNA, que permite la detección de las células con doxiciclina activa la transcripción shRNA [21]. Cuatro shRNAmiR diferente (shRNA) dirigido específicamente a
BORIS
, y no su parolog
CTCF gratis (BORIS-SH1: 5'-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 ', BORIS-SH2: 5'-3-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA ', BORIS-SH3: 5'-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3', BORIS-sh4: 5'TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 ') y un control shRNA con la secuencia codificada (CTR sh: 5'CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3') se sintetizaron (Sigma). Ellos se amplificaron por PCR y clonados en la cadena principal pINDUCER11 utilizando
EcoRI
y
XhoI
enzimas de restricción. Las secuencias de todos los constructos se verificaron mediante secuenciación. Lentivirus fueron generados por co-transfección del shRNA apropiado construye junto con los vectores de empaquetamiento (pMD2G-VSVG, pCMV-dR8.74) en células HEK-293T utilizando Fugene 6 reactivo (Roche Diagnostics) de acuerdo con el protocolo del fabricante. sobrenadantes virales se recogieron 48 horas después de la transfección, se filtró a través de un filtro de 0,45 micras de poro, ultracentrifugated durante 1,5 horas a 19.500 rpm en un rotor Beckman SW28 y se resuspendieron en medio RPMI. La suspensión viral combinada con polibreno 8 mg /ml (Sigma) se utilizó para infectar células diana (NCCIT). Veinticuatro horas después de la infección se sustituyó el medio y las células infectadas de forma estable se eGFP-clasificar por medio de FACSAria me instrumento (Becton Dickinson) en el Centro de Citometría de Flujo de UNIL. La inducción de la expresión de shRNA se obtuvo mediante la adición al medio de 2 g /ml de doxiciclina (Sigma). Para mantener la caída, medio que contiene doxiciclina se actualiza cada 3 días.
La expresión ectópica BORIS en células HeLa
La transfección antes de los días, las células HeLa fueron sembradas a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo en 12 pocillos /placas. Las células se transfectaron con 3 g del vector pCMV-BORIS descrito previamente [12] utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron 2 días después de la transfección para obtener imágenes de fluorescencia de células.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total se aisló usando el kit RNeasy mini (Qiagen), incluyendo el tratamiento de ADNasa en columna de acuerdo con el Instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se determinó utilizando Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) y Qubit fluorescente Tecnología (Invitrogen).
Un paso limitante importante fue la baja cantidad de ARN total aislado de células de clasificación. Para solucionar esta limitación técnica, se aplicó un método ya descrito y validado [22], [23]. En primer lugar, 200 ng de ARN total se retrotranscribió usando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) en un volumen final de 20 l. A continuación, se utilizaron 2 l de cDNA para una reacción de preamplificación que consiste en un multiplex PCR hizo con una mezcla de cebadores (Tabla S1) a 0,1 M de concentración final, 0,5 unidades de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen), tampón de PCR 1X, y 2 mM MgCl
2 en un volumen total de 25 l
para preamplificación, las condiciones del ciclo de PCR fueron:. un paso de desnaturalización a 95 ° C durante 5 min seguido de 15 ciclos de amplificación (45 segundos a 95 ° C , 30 seg a 60 ° C, 1 min a 72 ° C). Por último, para la PCR cuantitativa, la reacción de preamplificación era 20 veces se diluyeron y se usaron 2 l de esta dilución como plantilla. La reacción se complementa con 0,5 unidades de Platinum Taq ADN polimerasa (Invitrogen), tampón de PCR 1X, MgCl 2,5 mM
2, 2,5 M SYTO9 verde (Invitrogen) y 0,1 M de cada gen cebador específico (Sigma) en un volumen final de 20 l. Las condiciones de PCR fueron: 95 ° C durante 5 min seguido de ciclos (5 segundos a 95 ° C, 30 seg a 60 ° C, 45 seg a 72 ° C). Melting análisis de la curva se realizaron al final de la amplificación para comprobar la pureza de los amplicones. Los productos de PCR también se cargaron en gel de agarosa para confirmar el tamaño correcto de los productos amplificados. Ciclismo y la fluorescencia de adquisición se realiza en Rotor-Gene 6000 sistema de PCR en tiempo real (Corbett Life Science). El análisis de datos se realizó utilizando el software Rotor-Gene 6000. los niveles relativos de expresión se determinaron por el método ΔΔCt con los niveles de expresión normalizada de
GAPDH
nivel. La eficiencia de la PCR varió de 94 al 101%, con un coeficiente de correlación (r
2) entre el 0,96 a 1,0, para todos los genes diana amplificadas. Los valores de Ct de
GAPDH
eran más o menos la misma (Ct = 10,07 ± 0,25) para todas las células utilizadas en los experimentos cuantitativos de RT-PCR.
Los cebadores específicos humanos (Tabla S1) se diseñados utilizando Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) y el software OLIGO Primer Analysis. La especificidad fue verificada mediante la búsqueda BLAST (NCBI). Los pares de cebadores diseñados cruzan los límites intrón-exón para evitar la contaminación de ADN genómico. Se eligieron cebadores BORIS (entre el exón 8 y 9) en base a los resultados obtenidos anteriormente [24] con el fin de amplificar el más abundante
BORIS
isoformas.
metilación del ADN análisis
se extrajo el ADN utilizando el kit DNeasy (Qiagen). Se utilizó una gama de 200 ng (de células clasificadas) y 500 ng de DNA a bisulfito de reacción utilizando el kit de EpiTect bisulfito (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN modificado se utilizó para amplificar un fragmento de 123 pb del promotor de BORIS.
El ensayo de metilación fue diseñado utilizando el PyroMark Ensayo de Diseño de Software 1.0 (Qiagen). Este ensayo permite la secuenciación de 50 pb (desde la posición -968 a -918) en el promotor B de
BORIS
[25] e incluyó 10 CpG. Para llevar a cabo la secuenciación, DNA 3 l de bisulfito tratados se amplificó primero por la PCR. Las secuencias de los cebadores de PCR fueron: BORIS-piro Delantero 5 'TGGTTTGTGGGTTTTGT 3' y BORIS-piro 'CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3' BIO inversa 5. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 min; 45 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 15 s y 72 ° C durante 1 min; y una etapa de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Entonces, la purificación y el tratamiento posterior del fragmento biotinilado de cadena simple de PCR se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Pirosecuenciación de este fragmento de PCR se realizó en un instrumento PyroMark Q24 usando Pyro Reactivos Q24 oro (Qiagen). El cebador pirosecuenciación (5 'GTGTTGTAGTTTATAGT 3') se utilizó a una concentración final de 0,3 mM. Se analizaron los datos resultantes y se cuantificaron con el software PyroMark Q24 (Qiagen), que calcula el porcentaje de metilación para cada sitio CpG, lo que permite comparaciones cuantitativas.
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTT . MTT () -2,5-difeniltetrazolio, Sigma 3- (4,5-dimetil-2-tiazol) reactivo se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células establemente infectadas se sembraron a una densidad de 25 × 10
3 células /pocillo en 24 pocillos /placas con medio que contiene doxiciclina. Después de 3 días, las células se incubaron con el reactivo MTT (200 mg /ml de concentración final) durante 3 horas a 37 ° C. A continuación, las células se lisaron añadiendo isopropanol /HCl durante 10 min y las placas se agitaron suavemente durante 5 min. Los valores de absorbancia se determinaron usando un lector de microplacas (sinergia Mx, BioTek) a 570 nm. Cada experimento se realizó por triplicado y se realizaron 3 experimentos independientes.
análisis Apoptosis
La apoptosis se midió por triplicado utilizando el kit de detección de Anexina V Apoptosis (BD Bioscience) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Brevemente, 5 × 10
4 células /pocillo fueron sembradas en 12 pocillos /placas y se cultivaron en presencia de doxiciclina hasta confluencia (5-7 días). Se recogieron las células flotantes así como las células tratadas con tripsina, se lavaron con PBS y se resuspendieron en 100 l de tampón de unión. Después, se añadieron 5 l de anexina V-V500 y 5 l de 7AAD y se incubaron con las células durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la adición de 400 l de tampón de unión se analizaron las muestras inmediatamente por Gallios citómetro de flujo (Beckman Coulter). Al menos 5 × 10
4 eventos fueron contados para todas las muestras. El porcentaje de células apoptóticas se estimó después de gating en eGFP y tRFP (transducidas e inducida por doxiciclina, respectivamente) las células positivas.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se obtuvieron utilizando tampón RIPA (Sigma ) en presencia de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) y se cuantificó usando el ensayo de BCA (Thermo Scientific). Treinta microgramos de proteína se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%, seguido de transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa utilizando un aparato de transferencia semiseco (BIO RAD). La unión no específica fue bloqueada por incubación durante la noche en la leche en polvo al 5% sin grasa en tampón TBS-T (0,1% de Tween 20 en solución salina tamponada con Tris, TBS) a 4 ° C. Las membranas fueron sondadas con anticuerpo anti-humano BORIS /CTCFL ratón monoclonal (producidos y amablemente proporcionados por el Dr. Dmitri Loukinov, NIH /NIAD) utilizado en 1: 1.000 tampón de bloqueo dilución en 1% (1% baja en grasa secaron leche en TBS -T tampón) y se incubó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Como control de carga, anticuerpo de ratón anti-humano β-actina (Sigma) en dilución 1: 5000 en tampón de bloqueo 1% se utilizó y se incubó a temperatura ambiente durante 45 min. Las membranas se lavaron 3 veces con TBS-T y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con peroxidasa de rábano (HRP) de conejo marcado con anti-IgG de ratón (Sigma) diluido a 1: 5000 en tampón de bloqueo 5%. Después de 3 × lavado con TBS-T, las membranas fueron desarrolladas utilizando WesternBright Quantum (Advansta) y se visualizaron con el sistema de quimioluminiscencia FX Fusión (Vilber Lourmat).
asociada a la senescencia β-galactosidasa tinción
asociada a la senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal) tinción se realizó utilizando el kit de tinción de β-galactosidasa (BioVision), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 5 × 10
4 células /pocillo fueron sembradas en 12 pocillos /placas en presencia de doxiciclina y se cultivaron hasta confluencia (5-7 días). Luego, las células se enjuagaron con PBS, se fijaron durante 15 min y se incubaron con solución de tinción SA-β-Gal recién preparada a 37 ° C durante 24 horas. Después de lavar con PBS, se observó actividad SA-β-gal utilizando microscopio invertido (Nikon) mediante la detección de células teñidas de azul. Se seleccionaron al menos 10 campos separados. Para cada campo se contaron el número de células teñidas de azul y el número de células totales. Los resultados se expresan como porcentaje de células SA-β-gal-positivo calculado como: (número de células azules /número de células totales) x 100.
se midió la actividad de la telomerasa
Actividad de la telomerasa usando TRAPEZE RT kit de detección de telomerasa (Millipore). Este ensayo cuantifica la actividad telomerasa por SYBR en tiempo real Green PCR cuantitativa [26]. Brevemente, las células se lisaron en 200 l de CHAPS tampón y las concentraciones de proteína se determinaron con Nanodrop 2000. Las alícuotas de lisado de células (1,5 g de proteína /muestra) fueron utilizados. Las muestras inactivadas, no hay reacciones en plantillas, y el control positivo también se analizaron para el control de calidad. Una curva estándar se preparó por dilución en serie de plantilla de control TSR8 siguiendo las instrucciones del fabricante. amplificaciones en tiempo real se realizaron con Platinum Taq ADN polimerasa (2 unidades /muestra, Invitrogen). Ciclismo y la fluorescencia de adquisición se realiza en Rotor Gene 6000 en tiempo real sistema de PCR (Corbett Life Science). Actividad de la telomerasa se calculó mediante la comparación de los valores medios de Ct de cada muestra en contra de la curva estándar generada por la plantilla de control TSR8.
El análisis estadístico
La significación estadística se evaluó utilizando Student de dos colas t-test análisis. Valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
in vitro
de validación de las balizas moleculares (MBs)
Dos MBs diferentes específico. a
BORIS
ARNm (BORIS-MB1 y MB2-BORIS) y un AZAR-MB se utilizaron en este experimento. Las temperaturas de hibridación y la especificidad de los MBs se probaron en solución. La emisión de fluorescencia de estos MBs se controló a temperaturas que van desde 25 hasta 80 ° C, bajo diferentes condiciones: MB solo, MB en presencia de la diana específica, en presencia de una diana no específica o en presencia de un plásmido que contiene BORIS cDNA (pCMV-BORIS). Como se muestra en la Figura S1, se detectó señal de fluorescencia perceptible sólo cuando los MBs se mezclaron con sus objetivos específicos. la emisión de fluorescencia óptima con relación aceptable de señal a fondo (& gt; 4) se observó por debajo de 40 ° C. El ensayo también mostró que BORIS-MBS discriminan estructuras individuales y de doble cadena, ya que no emiten fluorescencia cuando se incuba con el plásmido pCMV-BORIS. Estos resultados demostraron que MBs hibridan específicamente a sus secuencias diana y sugiere fuertemente que estos MBs serían capaces de unirse específicamente ADN genómico mRNA y no.
Detección de
BORIS
mRNA usando BORIS-MB
en primer lugar, verificamos si BORIS-MBS podrían ser capaces de distinguir las células positivas y negativas BORIS expresa en las células vivas. RT-PCR cuantitativa detecta fuertes niveles de
BORIS
ARNm en las líneas celulares NCCIT y OVCAR3, mientras que este nivel era muy bajo en las células HeLa y no detectable en células BJ (Figura 1A), de acuerdo con estudios anteriores [12 ]. Por lo tanto, para estudiar la especificidad de MBs, NCCIT se utilizó como células de control positivo y BJ como un control negativo. células NCCIT fueron transfectadas con BORIS-MB1 o BORIS-MB2 y emisiones de fluorescencia se midieron mediante citometría de flujo. Las señales fluorescentes medios de las células transfectadas con BORIS-MBS fueron más altos en comparación con la señal fluorescente media de las células transfectadas con RANDOM-MB. Se observó un incremento del 23,2 y el 4,7 por BORIS-MB1 y MB2-BORIS, respectivamente (Figura 1B-C). Sin embargo, dado BORIS-MB1 proporciona mayor (5 veces) significa señal de fluorescencia en comparación con BORIS-MB2, BORIS-MB1 fue seleccionado para el análisis posterior. De aquí en adelante BORIS-MB1 se conoce como BORIS-MB. Como era de esperar, cuando las células BJ BORIS negativos fueron transfectadas con BORIS-MB, que no muestran ninguna señal de fluorescencia (Figura 1D).
(A)
BORIS
expresión en líneas celulares humanas. El ARN total se aisló a partir de líneas celulares tumorales humanas: NCCIT (embrionario), OVCAR3 (ovario), HeLa (cervical) y las células normales (fibroblastos BJ). los niveles de mRNA de
BORIS
fueron analizados por QRT-PCR. Los resultados se normalizaron a
GAPDH
y en relación con las células NCCIT. BJ y NCCIT se consideraron como controles negativo y positivo, respectivamente. Las barras de error representan la media ± DE de 3 experimentos independientes. (B) las señales fluorescentes medidas por citometría de flujo de células transfectadas con NCCIT ATTO647-BORIS-MB1 (pico gris oscuro) y con (pico blanco) ATTO647-AL AZAR-MB. (C) Las señales fluorescentes medidas por citometría de flujo de células transfectadas con NCCIT ATTO647-BORIS-MB2 (pico gris débil) y con (pico blanco) ATTO647-AL AZAR-MB. (D) las señales fluorescentes medidas por citometría de flujo de células BJ tratados con ATTO647-BORIS-MB1 (de aquí en adelante se hace referencia a BORIS-MB, pico gris) y con ATTO647-AL AZAR-MB (pico blanco). (E)
BORIS
expresión en células HeLa utilizando BORIS-MB. Imágenes representativas de células HeLa transfectadas transitoriamente con el vector de expresión de BORIS, pCMV-BORIS (parte inferior) y el control de las células no transfectadas (parte superior), 20 × magnificación. (F)
BORIS
expresión en líneas celulares humanas tal como se detectó usando BORIS-MB. Imágenes representativas de BJ, NCCIT y células OVCAR3, 20 × magnificación. Para imágenes de fluorescencia, 1 × 10
6 células fueron incubadas a 37 ° C durante 1 hora en medio DMEM sin suero con Cy3-BORIS-MB (200 nM). Se añadió Hoechst 33342 5 mg /ml durante los últimos 10 minutos de incubación. Las láminas fueron analizados por microscopía de fluorescencia.
Para desafiar aún más la especificidad de la BORIS-MB, células HeLa que expresaban
BORIS
mRNA en el nivel bajo, se transfectaron transitoriamente con el pCMV BORIS plásmido de expresión, que contiene el cDNA humano BORIS gen fusionado a la proteína fluorescente verde (GFP). Como se esperaba, las células transfectadas presentan señales de alta fluorescencia de GFP tanto y BORIS (Figura 1E). En conjunto, estos resultados confirman la capacidad de la BORIS-MB para detectar de forma fiable y, específicamente,
BORIS
ARNm en las células vivas.
Por lo tanto, las líneas celulares fueron transfectadas con el BORIS-MB para visualizar
BORIS
la expresión del ARNm de imágenes de fluorescencia. Como se puede ver en la figura 1F, la señal de fluorescencia de BORIS-MB era claramente visible en las células NCCIT y OVCAR3, en los que sólo un subconjunto de células se fluorescente. Se encontró que el porcentaje de células positivas BORIS en estas líneas celulares para estar entre 3 y 5%. Como era de esperar, en BJ línea celular normal no se observaron células fluorescentes. En las células HeLa, el número de células positivas BORIS era extremadamente baja, de menos de 0,1% (Figura 1E). En general estos experimentos demostraron que, dentro de las líneas de células tumorales,
BORIS
mRNA no está presente en todas las células, sino más bien se produce sólo en un subconjunto de células.
aislamiento de la población celular que expresa
BORIS
mRNA usando BORIS-MB
NCCIT se utilizó para el aislamiento de células BORIS-positivos. Clasificación FACS se realizó después de la transfección de células con BORIS-MB. Las células BORIS-positivas y negativas-BORIS (8,4 ± 1,5 y 41,5 ± 7,2% del total, respectivamente, con una media ± DE) fueron ordenados (Figura 2A)
células (A) NCCIT fueron transfectadas con ATTO647-. AZAR-MB (pico blanco) y ATTO647-BORIS-MB (pico gris). Las células dos subpoblaciones, BORIS-negativos y BORIS-positivos se seleccionaron mediante la comparación de la señal fluorescente de RANDOM-MB a la de BORIS-MB. Después de la exclusión de las células muertas de la tinción PI, se clasificaron las dos fracciones. (B)
BORIS
expresión de las fracciones aisladas de BORIS-negativos y positivos BORIS se analizó mediante qRT-PCR. Los resultados se normalizaron a
GAPDH Opiniones y relacionadas con las células no ordenados NCCIT. Las barras de error representan la media ± DE de 3 experimentos independientes. El asterisco indica diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,05). Entre BORIS-positivas y las células no ordenados
BORIS
análisis de la expresión mostró que el nivel de
BORIS
ARNm de ordenados células BORIS-positivos fue 20 veces mayor en comparación con las células no ordenados (Figura 2B). Este resultado demuestra la eficacia del método de clasificación y el enriquecimiento con éxito de una población de células que expresa
BORIS
mRNA.
Las células BORIS-positivos y negativos BORIS-aislados tienen patrón de metilación similar de BORIS B Opiniones promotor
en un estudio anterior, hemos demostrado que
BORIS
expresión está controlada por tres promotores alternativos, que corresponden a los sitios de inicio de transcripción en -1447, -899 y -658 pb aguas arriba de la primeros ATG y promotores designados como A, B y C, respectivamente [25]. Curiosamente, se ha observado que en los tumores, la desmetilación de BORIS promotor B, generalmente se correlaciona con la expresión de
BORIS
, que no es el caso para los promotores de C y A [25]. En consecuencia, se interrogaba la posible correlación entre la metilación del promotor B y
BORIS
expresión en las células clasificadas. BORIS nivel de metilación de este promotor se midió mediante pirosecuenciación, tras la modificación con bisulfito del ADN extraído de células BORIS-positivos y BORIS-negativos. resultados Pyrosequencing indicaron que en ambas fracciones, las GPC fueron fuertemente metiladas (85-100% de metilación) y no se detectaron diferencias (Figura 3A). Esto confirmó que en las células NCCIT,
BORIS
expresión no fue regulada por el promotor B y sugirió que la diferente expresión de
BORIS Estar entre las fracciones clasificadas no fue guiado por el estado de metilación del ADN del promotor B, pero en lugar implicados otros niveles de control. el análisis
(A) la metilación de las islas CpG 10 dentro de la
BORIS
región promotora (promotor B). El gráfico muestra el porcentaje representativo de la metilación de cada isla CpG de los aislados (blanco) BORIS-positivo, -negativo (gris) y las células no ordenados (negro) NCCIT. análisis (B) Expresión de los aislados (blanco) BORIS-positivos y fracciones BORIS-negativos (gris). Los genes indicados se analizaron mediante qRT-PCR.