Extracto
VTI1A-TCF7L2
se informó como un gen de fusión recurrente en el cáncer colorrectal (CCR), encontrado que se expresa en tres de cada 97 cánceres primarios, y una línea celular, NCI-H508, donde una deleción genómica une los dos genes [1]. Para investigar esta fusión más, se analizaron ADN y la secuencia de ARN alto rendimiento de datos de siete líneas celulares de CRC, e identificaron el gen
RP11-57H14.3 gratis (ENSG00000225292) como socio de fusión novedosa para
TCF7L2
. La fusión fue descubierto a partir de datos del genoma y transcriptoma en la línea celular HCT116. Por triplicado RT-PCR anidada, hemos probado tanto la novela transcripción de fusión y
VTI1A-TCF7L2
para la expresión en una serie de 106 tejidos de CRC, 21 líneas celulares de CRC, 14 de la mucosa colónica normal, y 20 tejidos normales de diverso sitios anatómicos. En total, el 42% y el 45% de las muestras de CRC expresaron
VTI1A-TCF7L2
y
TCF7L2-RP11-57H14.3
transcripciones de fusión, respectivamente. Los transcritos de fusión se observaron tanto en el 29% de las muestras de la mucosa colónica normal, y en el 25% y el 75% de los tejidos normales ensayados de otros órganos, revelando que la
TCF7L2
transcritos de fusión no son ni específico para el cáncer ni en el colon y el recto. Se detectaron siete diferentes variantes de empalme para la
VTI1A-TCF7L2 sobre Fusion, de los cuales tres son nuevos. Se detectaron cuatro variantes de empalme diferentes para el
TCF7L2-RP11-57H14.3 sobre Fusion. En conclusión, hemos identificado nuevas variantes de
VTI1A-TCF7L2
transcripciones de fusión, incluyendo un nuevo gen asociado de fusión,
RP11-57H14. Página 3, y demostraron niveles detectables en una gran fracción de CRC muestras, así como en la mucosa colónica normal y otros tipos de tejidos. Sugerimos que las transcripciones de fusión observados en una alta frecuencia de las muestras son de transcripción inducida quimeras que se expresan en niveles bajos en la mayoría de las muestras. Las transcripciones de fusión similares inducidos por reordenamientos genómicos observados en líneas celulares de cáncer individuales aún pueden tener potencial oncogénico como se sugiere en el estudio original de Bass y col
Visto:. Nome T, Hoff AM, CA Bakken, Rognum A, Un Nesbakken, Skotheim RI (2014) de alta frecuencia de la fusión transcripciones que implican
TCF7L2
en cáncer colorrectal: Novel Fusión de socio y variantes de empalme. PLoS ONE 9 (3): e91264. doi: 10.1371 /journal.pone.0091264
Editor: Nathan A. Ellis, de la Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de octubre de 2013; Aceptado: 10 Febrero 2014; Publicado: 7 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Nome et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por becas de la Sociedad de cáncer de Noruega (TN y AMH fueron financiados como estudiantes de doctorado de la concesión PR-2.007-0166 en RIS), NorStore (para el almacenamiento de archivos informáticos; NS9013K proyecto), y en parte apoyada por el Consejo de Investigación de Noruega a través de sus Centros de Excelencia régimen de financiación, número 179571. los patrocinadores del proyecto tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el segundo más común y mortal enfermedad del cáncer en todo el mundo [2], y hay una gran demanda de buenos biomarcadores para tanto para la detección temprana y estratificar a los pacientes de acuerdo con el pronóstico y predecir la respuesta al tratamiento. Sin embargo, el CRC es una enfermedad heterogénea, y unos biomarcadores todavía no han llegado al uso clínico de rutina.
Los genes de fusión representan una clase de genes del cáncer con un potencial prometedor biomarcador, y cuando es causado por reordenamientos cromosómicos, como translocaciones, deleciones o duplicaciones, que son comúnmente altamente específico de cáncer. Hasta ahora, pocos genes de fusión altamente recurrentes se han identificado en CRC. Los ejemplos de otros tipos de cáncer incluyen el conocido
BCR-ABL1 sobre Fusion (cromosoma Filadelfia), presente en el 95% de las leucemias mieloide crónica [3], y
TMPRSS2-ERG
la que está presente en torno al 50% de los cánceres de próstata [4]. En algunos casos, el gen de fusión puede ser una diana terapéutica, se demuestra por la unión a Imatinib y bloqueando el dominio quinasa de la proteína de fusión BCR-ABL1.
El primer gen de fusión informado de que se recurrente en CRC, las secuencias de fusión de
VTI1A
y
TCF7L2
, se informó en 2011 [1].
se detectaron VTI1A-TCF7L2
la transcripción de fusión en tres de cada 97 CRC (3%), así como la línea celular de cáncer de colon NCI-H508. En NCI-H508, la fusión es causado por una deleción ~540 kb entre los genes
VTI1A
y
TCF7L2
.
TCF7L2
codifica el factor de transcripción TCF4, que dimeriza con β-catenina. β-catenina está implicada en la regulación de la vía de señalización de WNT, que comúnmente se altera en la mayoría, si no todos, los CRC [5]. El agotamiento de la
VTI1A-TCF7L2 Versión taquigráfica de fusión dio lugar a una pérdida significativa de crecimiento independiente de anclaje en la línea celular positiva CRC fusión NCI-H508 [1].
mutaciones frecuentes en una zona dentro de la polyadenine
TCF7L2
genes han sido previamente informado de CCR, especialmente en tumores inestables microsatélites [6]. Microsatélites estables tumores han, sin embargo, recientemente también han demostrado que el puerto mutaciones frecuentes en el
TCF7L2
gen, lo que indica una posible función importante en la biología CRC [7].
En este estudio, que tuvo seguir investigando la presencia y variantes de
VTI1A CD -
TCF7L2
fusiones en el CCR. Hemos analizado los datos de todo el genoma y transcriptoma de secuenciación profunda de CRC para las fusiones relacionados que involucran una de las parejas de fusión, y de nuevos puntos de interrupción de fusión. La recurrencia de la
VTI1A-TCF7L2 sobre Fusion, y una nueva transcripción de la fusión entre el
TCF7L2
y el nuevo gen asociado
RP11-57H14.3, España fue analizado en una serie de los CCR y muestras normales.
Materiales y Métodos
Materiales
Un total de 106 muestras de tejido de CRC y 14 muestras normales apareadas de dos series de pacientes independientes, serie 1 y la serie 2, fueron seleccionados para la presencia de las transcripciones de fusión. Todos los CRC son de pacientes tratados quirúrgicamente en los hospitales de la región de Oslo, Noruega. Las dos series paciente incluye tanto microsatélites estables (n = 85) e inestable (n = 20) CRC (una muestra no anotó), según la evaluación de los estudios anteriores [8] - [10]. La serie se enriquece en fases clínicas II y III CRC (52 en estadio II, 53 en estadio III y IV etapa 1). Puesta en escena estaba de acuerdo con el Comité Conjunto Americano del Cáncer /Unión Internacional contra el Cáncer (AJCC /UICC). Las 14 muestras normales emparejados de la Serie 1 se obtuvieron de zonas libres de la enfermedad visual de la mucosa del colon. Los bancos de datos genéticos de investigación se han registrado conforme a la legislación nacional, y el estudio ha sido aprobado por el Comité Regional de Ética de Investigación Médica (números 2781 y 236-2005-16141).
Un total de 21 líneas de células colorrectales eran incluidos [11]. Las líneas celulares HCT116, HCT15, LoVo, NCI-H508, RKO, SW48, y SW620 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas de células Co115, Colo320, EB, VIE, HT29, IS1, IS2, IS3, LS1034, LS174T, SW480, TC7, TC71, y V9P fueron amablemente proporcionados por el Dr. Richard Hamelin, INSERM, Francia. Las identidades de las líneas celulares fueron verificadas por el Kit de AmpFLSTR Identifiler Amplificación por PCR (Applied Biosystems por Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.)
.
Además, hemos examinado veinte tejidos normales de los sitios de diverso del cuerpo para el
TCF7L2
que implica la transcripción de fusión (adiposo, vejiga, cerebro, cuello uterino, colon, esófago, corazón, riñón, hígado, pulmón, ovario, placenta, próstata, músculo esquelético, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides y tráquea ; FirstChoice normal Tejido humano ARN total, cada uno, un grupo de ARN a partir de al menos tres individuos, con la excepción de una muestra individual del estómago;. Ambion, Applied Biosystems por Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.)
identificación de fusiones de Whole-transcriptoma y secuenciación del genoma completo de datos
Los datos de secuenciación de ARN-end-emparejado de siete líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT15, HCT116, HT29, LS1034, RKO, SW48, y SW480) y de 16 tejidos normales de origen diverso se incluyeron en el estudio. Estos fueron secuenciados utilizando el Illumina GAIIx (líneas celulares) o 2000 (HiSeq tejidos normales; ambos secuenciadores de Illumina Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Los datos sobre el cáncer de colon RNA-seq incluyen 220 millones secuencia de 76 pb lee (Europea Archivo de nucleótidos estudio adhesión ID ERP002049) [12] y las muestras normales comprendido entre 73 y 80 millones 50 secuencia de pares de bases lecturas por muestra (ArrayExpress adhesión Identificación del [E-MTAB -513] y estudio europeo Archivo de nucleótidos [EMBL: ERP000546]). Además, se obtuvieron secuencias de todo el genoma de gama sincronizado de las líneas celulares HCT15, HCT116, HT29 y SW480 a una cobertura media de aproximadamente 30 × [12] (datos pueden estar disponibles a petición de los investigadores).
Una lista de posibles transcripciones de fusión fue producida por la versión 0.6.0 a desactivar [13] en las siete líneas celulares de ARN-secuenciado anteriormente mencionados, además de la línea celular NCI-H508 CRC (análisis de id 0c7a79cc-bbaf-4c6d-93e1-866f5f5f3d0d ) descargados de la Genómica del cáncer Hub (organizadas por la Universidad de California en Santa Cruz, CA, EE.UU.), los datos proporcionados por la línea celular de cáncer Enciclopedia [14] y 16 tejidos desde el plano del cuerpo humano Illumina v2. Para las líneas celulares con la secuencia de pares de todo el genoma (HCT116, HCT15, HT29 y SW480), ARN transcritos de fusión y puntos de ruptura de ADN fueron identificados por nfuse versión 0.2.0 [15]. Una nominación de fusión requiere que abarcan tres pares de lectura y dos medio lee partir de los datos de RNA-seq.
Detección de Fusión Las transcripciones por PCR-transcriptasa inversa
En el
VTI1A-TCF7L2
fusión, los mismos cebadores de RT-PCR y cebadores anidados se utilizaron como en la publicación original [1]. Para el
TCF7L2-RP11-57H14.3 sobre Fusion, cebadores y cebadores anidados fueron diseñados para la secuencia de punto de interrupción transcripción de fusión, como se identifica por distender, mediante la utilización de la web de software Primer3 [16]. El primer secuencias óptimas (Tabla S1) se ordenó más lejos de BioNordika Norway AS (Oslo, Noruega) y sintetizados por Eurogentec (Lieja, Bélgica). Se realizó sensible anidada RT-PCR con 20 + 30 ciclos para ambos ensayos utilizando 50 ng de ADNc de cada muestra como entrada en primera ronda de PCR. Los productos de la primera PCR se diluyeron a una concentración final de 1/200 en la PCR anidada. El siguiente protocolo de ciclos se utilizó para todas las reacciones de PCR: 15 minutos de activación de la polimerasa de ADN HotStarTaq a 95 ° C, un ciclo de tres pasos de desnaturalización durante 30 segundos a 95 ° C, la hibridación del cebador durante un minuto y 15 segundos en fusión cebador óptima temperaturas (Tabla S1), y la extensión durante un minuto a 72 ° C. Después del último ciclo, una etapa de extensión final se realizó a 72 ° C durante 6 minutos. Los productos de PCR anidada se separaron por electroforesis a 200 V durante 30 minutos en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron utilizando bromuro de etidio y luz UV. carreras triplicado RT-PCR se realizaron para ambos ensayos, el uso de parámetros idénticos, para todas las muestras. No hay controles negativos fueron incluidos plantilla de cada una síntesis de ADNc, las reacciones de la primera ronda de PCR y PCR anidada.
Sanger de secuenciación de Fusión Transcripción Breakpoints
Las muestras que fueron positivas para la segunda réplica de RT-PCR ensayos, y mostraron una única banda de nucleótidos en el gel de agarosa, se secuenciaron directamente desde ambos lados utilizando tanto cebadores directo e inverso anidados. Antes de la secuenciación, los productos de la PCR anidados se purificaron usando Illustra Exostar 1-paso de limpieza (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Las reacciones de secuenciación de ciclo se realizaron utilizando el kit BigDye Terminator ciclo de secuenciación v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) siguiendo las recomendaciones del proveedor. Además, los productos de secuenciación se limpian y se purificaron utilizando BigDye Xterminator (Applied Biosystems), antes de que se analizaron por electroforesis capilar usando el ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Las secuencias se analizaron usando el software de análisis de secuenciación v.5.3.1.
Evaluación de la Genómica Identificado punto de interrupción
TCF7L2-RP11-57H14.3 fotos: por PCR
La genómica punto de interrupción identificados a partir de los datos de secuenciación de todo el genoma, la conexión de
TCF7L2
a
RP11-57H14.3 Hoteles en la línea celular de cáncer de colon HCT116, se validó mediante PCR.
los cebadores para genómica PCR (Tabla S1) fueron diseñados para la secuencia de punto de interrupción genómico, como se identifica por nfuse, usando el mismo enfoque que se ha descrito anteriormente para los ensayos de RT-PCR. Veintiún CRC líneas celulares, incluyendo HCT116, se ensayaron para determinar el punto de interrupción genómica identificados utilizando 100 ng de ADN como entrada para cada reacción. El siguiente protocolo de ciclos se utilizó para la PCR genómica: 15 minutos de activación de la polimerasa de ADN HotStarTaq a 95 ° C, un ciclo de tres pasos (repetido 35 veces) de desnaturalización durante 30 segundos a 95 ° C, la hibridación del cebador durante un minuto y 15 segundos a 60 ° C y la extensión durante un minuto a 72 ° C. Después del último ciclo, una etapa de extensión final se realizó a 72 ° C durante 6 minutos. Los productos de PCR se separaron por electroforesis a 200 V durante 30 minutos en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron utilizando bromuro de etidio y la luz UV.
Resultados
RP11-57H14.3
es un socio de fusión Novel en
TCF7L2
contiene transcripciones de fusión de ARN-
final emparejado
para buscar la
VTI1A-TCF7L2
parejas de fusión y nueva fusión, se analizaron -sequencing datos de ocho líneas celulares de cáncer de colon y dieciséis muestras de tejido normal de sitios anatómicos diversos. Mediante la aplicación de la distender el software, se identificaron entre 16 y 1050 transcripciones de fusión potenciales por muestra. A partir de los datos de secuenciación de genomas enteros de líneas celulares de cáncer de colon de cuatro, el software identifica nfuse entre 70 y 126 posibles puntos de corte genómicos. De todas las fusiones identificados, solamente NCI-H508 albergaba el
VTI1A-TCF7L2
transcripción de la fusión, con un único punto de interrupción que abarca desde el exón dos en
VTI1A
al exón seis en
TCF7L2
, como ya se ha informado de esta línea celular por Bass et al. [1]. Sin embargo, hemos identificado un punto de interrupción genómico (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) en la línea celular HCT116 CRC que se extendió desde la región intrónica de
TCF7L2
de aguas arriba de
RP11-57H14.3
(ENSG00000225292) con una fusión de ARN correspondiente (Tabla 1).
RP11-57H14.3
está situado en la región intergénica entre los
VTI1A
y
TCF7L2
aproximadamente 44 kb aguas arriba de
TCF7L2
. Los puntos de corte genómicos predichos se correlacionan con una mayor cobertura genómico en la región entre ellos, lo que sugiere una duplicación genómica causando la fusión (Figura 1). Tanto el punto de interrupción y la fusión de transcripción entre genómico
TCF7L2
y
RP11-57H14.3
fueron verificados por PCR y RT-PCR. El punto de interrupción genómica identificada se verificó en la línea celular HCT116, pero no se detectó en ninguna de las otras 20 líneas celulares ensayadas, lo que reduce la probabilidad de que el punto de interrupción genómica refleja un número de copias de ADN polimorfismo común
.
Tres ARN quimérico -secuencia de lecturas atravesado el punto de interrupción transcripción de la fusión, pasando desde el exón 4 de
TCF7L2 gratis (ENST00000369395) para el exón 3 de
RP11-57H14.3 gratis (ENST00000428766), en el cromosoma 10. los colores oscuros indican exones que no forman parte de la transcripción de la fusión. RNA-seq expresión y los niveles de cobertura de ADN-ss se basan en los datos de secuenciación de la línea celular HCT116. Los dos loci de genes están marcados en cajas azules y rojas. La secuencia genómica punto de interrupción como se identifica por nfuse en la línea celular HCT116 CRC se da; que abarca desde la región intrónica de
TCF7L2
de aguas arriba de
RP11-57H14.3
. Las coordenadas del punto de ruptura (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) están marcados en el eje cromosoma posición. La ubicación del punto de interrupción se correlaciona bien con el aumento de la cobertura genómica verse por los datos de secuenciación del genoma.
alta prevalencia de
TCF7L2
-que involucran fusión transcripciones, ambos relativos a
VTI1A
y los
RP11-57H14.3
genes
el uso de los mismos cebadores como se describe por Bass et al. [1] (Figura 2), que detecta
VTI1A-TCF7L2
transcripciones de fusión con diferentes combinaciones exón-exón en 45 de 106 muestras de CRC (42%) (tabla 2). transcripciones de fusión fueron también detectados a partir del 4 de 14 muestras de mucosa normal del colon. Fuera de las 14 muestras de tumores normales emparejados, ocho pares fueron positivos exclusivamente en el tumor, tres pares fueron positivos tanto en tumor y normal, y un par positivo exclusivamente en normal (Tabla 3). La prevalencia de la transcripción de fusión fue similar en los tumores estables e inestables de microsatélites. Diez de las 21 líneas celulares, incluyendo el NCI-H508, albergaba la transcripción de fusión de diferentes tamaños. Finalmente, cinco muestras de tejido normal de los diferentes sitios anatómicos del cuerpo expresan los transcritos de fusión (Tabla S2). Debido a que los resultados de RT-PCR revelaron resultados inconsistentes (Figura S1 y S2 figura), se realizó toda la RT-PCR por triplicado, con parámetros idénticos, para investigar la recurrencia de la transcripción de fusión (Tabla S3). transcripciones de fusión sólo se han detectado consistentemente en las tres carreras en cuatro muestras; tres muestras de tumor y la línea celular NCI-H508 (3,1% de todas las muestras y líneas celulares de CRC). Esta frecuencia es similar a la frecuencia identificada originalmente de
VTI1A-TCF7L2
transcripciones (3%) por Bass et al. [1].
Los tres genes se encuentran dentro de 720
VTI1A, España ENST00000428766 en
RP11-57H14.3 Opiniones y ENST00000369395 en
TCF7L2
. También, se muestran los ensayos de PCR anidados utilizados para la detección de los dos transcritos de fusión. Las flechas rojas y negras representan los primeros cebadores redondas y segunda ronda utilizados, respectivamente.
Hemos detectado
TCF7L2-RP11-57H14.3
transcripciones de fusión con diferentes combinaciones exón-exón en 48 de 106 muestras de CRC (45%; tabla 2). Fuera de las 14 muestras de tumores normales emparejados, cinco pares fueron positivos exclusivamente en el tumor, y cuatro pares fueron positivos tanto en tumor y normal (Tabla 3). 19 de las 21 líneas celulares, albergaba la transcripción de fusión de diferentes tamaños. Además, 15 de las 20 muestras de tejido normal fueron positivos para la transcripción de fusión (Tabla S2). Al igual que con el
VTI1A-TCF7L2 sobre Fusion, hemos realizado todo RT-PCR por triplicado para investigar la recurrencia de la transcripción de fusión (Tabla S3). En total hubo 20 muestras que dieron positivo en repetidas ocasiones para la transcripción de fusión; seis muestras de tumores, cinco muestras de tejidos normales y nueve líneas celulares (incluyendo la línea celular HCT116). Curiosamente, la línea celular NCI-H508 fue negativo para
TCF7L2-RP11-57H14.3
la transcripción de fusión en las tres repeticiones.
No se encontró correlación entre el CRC positivos para
TCF7L2
que contiene la transcripción de fusión que implican
VTI1A
y
RP11-57H14.3 gratis (p = 0,33; prueba exacta de Fisher). Además, las frecuencias de transcritos de fusión no fueron significativamente diferentes entre los microsatélites inestable
vs. Tumores
estables, ni entre los estadios clínicos (datos no mostrados).
Todo nested-PCR repeticiones para ambos ensayos contenidas negativas no hay controles de plantilla. Estas reacciones de control negativo no producen productos de PCR detectables (Figura S1 y S2).
quiméricos secuencias generalmente cubiertos intactos Exonic sitios de empalme de los genes asociados
A partir de uno de los RT-PCR se ejecuta, se seleccionaron todas las muestras que resultaron positivas para las fusiones y tenía un solo producto de PCR de Sanger de secuenciación de ARN quiméricos de las secuencias para identificar los puntos de corte exactas. Para
VTI1A-TCF7L2 gratis (n = 25), se obtuvieron secuencias de todos los 25 de dicha transcripción de fusión aislada productos de RT-PCR, donde 24 de los 25 tenían secuencias de conexión secuencias aguas arriba de los exones 1, 2, 3, 5 ó 7 del
VTI1A
a abajo secuencias de los exones 4 y 6 del
TCF7L2
, con la preservación de los mismos límites exón-exón como en las estructuras de genes ya comentadas (ENST00000393077 en
VTI1A Opiniones y ENST00000369395 en
TCF7L2
). Uno de los productos secuenciado no contiene límites exón-exón claras, pero conecta las dos transcripciones en medio del exón 7 en
VTI1A
y 6 en
TCF7L2
. En total, siete puntos de interrupción de fusión diferentes fueron identificados (Tabla S3) que incluye el punto de interrupción original entre el exón 2 de
VTI1A
y el exón 6 de
TCF7L2 Hoteles en NCI-H508 (Figura 3) [1] . Este punto de interrupción exacta no se encontró en ninguna de las otras muestras, pero la mayoría de los transcritos de fusión intactas consistía en la misma parte de
TCF7L2
(n = 17) con un poco de que tiene el exón 4 de
TCF7L2
empalmado al exón 6 (n = 7). El
VTI1A
contribución varió más aguas arriba, que tiene cinco combinaciones diferentes de conexión a aguas abajo
TCF7L2
partes.
Secuenciación
Sanger confirmó la transcripción de fusión original, descubierto en NCI-H508, que muestra el secuencia de punto de interrupción que abarca exón-exón cruces entre el exón 2 en
VTI1A
y el exón 6 en
TCF7L2
. Bass et al. También descubrieron otros tres transcritos de fusión por PCR anidada. Sin embargo, como la anotación de transcripción no fue suficientemente descrito, no somos capaces de decir si estas fusiones son idénticas a algunas de las transcripciones que hemos identificado.
En
TCF7L2-RP11-57H14.3 gratis (n = 27), se obtuvieron secuencias de los 27 aislados de fusión de transcripción productos de RT-PCR, donde 26 de los 27 tenían secuencias que conectan las secuencias del exón 4 de
TCF7L2
a las secuencias de los exones 1, 2 , o 3 de
RP11-57H14.3
, también con la preservación de los mismos límites exón-exón como en las estructuras de genes ya anotado (numeración exón es el mismo que el anterior para
TCF7L2
y de acuerdo con ENST00000428766 para
RP11-57H14.3
). Un caso curioso de la secuencia quimérica, identificado en la línea celular CRC FRI, era una transcripción de fusión que abarca tres genes en un orden genómico no canónica, uniéndose a
TCF7L2
exón 4 con
VTI1A
exones 5 , 6, y 7, y que se extiende más lejos en
RP11-57H14.3
los exones 1, 2 y 3. también en este caso único se utilizaron los mismos límites exón-exón como en las estructuras de genes ya anotadas descritos encima. En total, se identificaron cuatro diferentes transcripciones de fusión que involucra
TCF7L2-RP11-57H14.3, España todos los que ocurren en varias muestras de cada uno.
Discusión
Tenemos en el presente informe identificado el gen
RP11-57H14. página 3 como socio de fusión novedosa para
TCF7L2
en el CCR. Por sensibles RT-PCR anidada, hemos puesto de manifiesto que tanto los previamente reportados
VTI1A-TCF7L2
transcripciones de fusión, y en el presente documento identificado
TCF7L2-RP11-57H14.3
, son muy frecuentes entre los CRC , aunque expresado a niveles bajos. También se detectó la expresión de los transcritos de fusión en mucosa colónica normal, así como en tejidos normales de otros sitios anatómicos. Triplicados anidada-PCR para investigar la presencia de
TCF7L2
transcripciones de fusión que implican mostraron resultados variables, con algunas muestras inicialmente dar positivo por una transcripción de fusión, pero negativos al realizar una carrera consecutiva, o
viceversa
. Sin embargo, la secuenciación de Sanger dio lugar a la confirmación del exón limpia al exón cruces de punto de interrupción, lo que reduce la probabilidad de que los artefactos de PCR, como la plantilla de la polimerasa de conmutación [17], como una causa de la incompatibilidad. Los controles negativos también se llevaron a cabo en todos los pasos de RT-PCR, incluyendo la síntesis de cDNA, primera ronda de PCR y PCR anidada. Ninguno de los controles negativos resultó en productos detectables, apoyando que la alta frecuencia de transcritos de fusión observada no es un resultado de la contaminación PCR (Figura S1 y Figura S2). Aunque las transcripciones de fusión se encontraron en alta frecuencia dentro de los materiales ensayados biobancos, la identificación de los
TCF7L2
fusiones -Con un contenido de datos de la secuenciación del transcriptoma sólo tuvo éxito de las dos líneas celulares a juego con los puntos de corte genómicos. Estas dos líneas celulares tenían además tienen consistentemente fuerte expresión de los transcritos de fusión, ya que producen resultados consistentes y claras de RT-PCR en todas las repeticiones. Sobre la base de estos resultados, se sugiere que las transcripciones de fusión producidos entre el
TCF7L2
y, o bien
VTI1A
o
RP11-57H14.3
se expresan en niveles bajos en las muestras tumorales, y algunas muestras normales. La presencia de transcritos de fusión expresadas en niveles bajos son consistentes con tres transcripciones de fusión que recientemente identificado en el CCR, donde
AKAP13-PDE8A, COMMD10-AP3S1, España y
CTB-35F21.1-PSD2
fueron identificados en 17 a 58% de 106 tejidos de cáncer primarios [12].
Todos los tres genes asociados se encuentran en el brazo largo del cromosoma 10, dentro de 721 kpb, y son todos leen de la misma cadena en el para
VTI1A, RP11-57H14.3, TCF7L2 gratis (Figura 2). Esto sugiere la ARN polimerasa de lectura a través como un mecanismo potencial para la generación de la
VTI1A-TCF7L2
transcripciones en ausencia de un punto de interrupción genómico correspondiente. Varios informes han demostrado que los genes en estrecha proximidad en el genoma humano se expresan como genes unidos, también llamados quimeras en tándem, las transcripciones que se combinan de al menos parte de un exón a partir de dos o más genes distintos que se encuentran en el mismo cromosoma [18] - [20]. Se ha sugerido que la expresión de genes unidos a aumentar la complejidad del genoma humano mediante la traducción en proteínas distintas, o que estas transcripciones jugar un papel en la regulación de los niveles de transcripción canónicas. Un mecanismo propuesto para su generación es que la maquinaria de transcripción evita la señal de terminación del gen aguas arriba y sigue la transcripción del gen aguas abajo antes de terminar en la señal de terminación de aguas abajo [19], [21]. La mayoría de los genes unidos se cree que se expresa en niveles bajos, ya que a menudo se apoyan en un solo tag expresada secuencia o la secuencia de ARNm en las bases de datos del genoma, lo cual está en línea con nuestras observaciones del expresado débilmente
TCF7L2
-Con la transcripción de fusión en el CCR
.
la generación de
VTI1A-TCF7L2
transcripciones así puede explicarse como producto de la lectura a través de la polimerasa, pero esto no puede ser el mecanismo de funcionamiento del
TCF7L2-RP11-57H14.3
transcripciones de fusión. En este caso, los exones de
TCF7L2
y
RP11-57H14.3
son empalmados juntos en un orden genómico no canónica utilizando consenso sitios de ayuste. Este mecanismo transcripcional ha sido previamente descrito por Nigro et al. como el exón de codificación; un proceso en el que los exones se unen con precisión a los sitios de empalme de consenso, pero en un orden diferente de la presente en el transcrito primario [22]. Ellos descubrieron este fenómeno cuando se investiga un candidato gen supresor tumoral (
DCC
), e identificaron que las transcripciones resultantes revueltos se expresan y se encuentran en niveles relativamente bajos tanto en células normales y neoplásicas. Recientemente, basado en secuenciación profunda de ARN, se han identificado tales transcripciones revueltos de cientos de genes [23]. Este grupo también sugirió que una fracción sustancial de las transcripciones revueltos son ARNs circulares, que explican la unión de los exones en un orden lineal no canónica. También encontraron que muchas de las isoformas circulares estaban presentes en niveles comparables a sus homólogos lineales canónicas.
En conjunto, estos niveles adicionales de complejidad genómica transcripcional y está en línea con el reciente informe del proyecto ENCODE, reportando sustancial reducción de las longitudes de las regiones intergénicas, y cada vez que se solapan de genes asumido previamente que los loci genéticos distintos, por completo lo que provocó una redefinición del concepto de un gen [24].
la identificación de los puntos de corte genómicos en líneas de células individuales
TCF7L2
ambas fusiones que implica
VTI1A
y
RP11-57H14.3
, es intrigante. Los puntos de corte genómicos identificados coinciden bien con los transcritos de fusión observados frecuentemente descubiertos en otras muestras que no tienen tales reordenamientos genómicos. Para las líneas celulares con los puntos de corte genómicos identificados, se detectaron los transcritos de fusión en niveles altos en toda la RT-PCR se replica, lo que sugiere que estas células expresan los transcritos de fusión en los niveles superiores. Por otra parte, la línea celular con
VTI1A-TCF7L2 sobre Fusion genómico (NCI-H508) fue negativo para el
TCF7L2-RP11-57H14.3
la transcripción de fusión en todas las repeticiones, el apoyo a la ~540 kb genómica supresión de la región intergénica entre los
VTI1A
y
TCF7L2
originalmente identificado por Bass et al.
la presencia de las transcripciones de fusión en células normales y muestras de CRC, junto con la identificación de los puntos de interrupción genómico de líneas celulares de cáncer individuales, que unen los dos mismos genes en el genoma nivel, están en línea con el informe de la transcripción de fusión
JAZF1-JJAZ1
ha identificado tanto en las células estromales endometriales normales y tumores del estroma endometrial [25].
JAZF1-JJAZ1
es detectable en el nivel de transcripción en las células del estroma endometrial normal, pero reordenamientos genómicos sólo se encuentran en las células neoplásicas. Li et al. la hipótesis de que trans-splicing la generación de estos transcritos de fusión, así como otros transcritos de fusión, pueden producirse regularmente en células y tejidos normales. Además, sugieren que puede haber un vínculo entre la trans-empalme generación de estas transcripciones de fusión y la generación de los reordenamientos genómicos [26]. Los reordenamientos genómicos u otros mecanismos pueden dar lugar a la sobreexpresión de estos transcritos de fusión, que pueden tener potencial oncogénico.
La importancia del gen
TCF7L2
en el desarrollo de CRC se ve favorecida por su función.
TCF7L2
codifica el factor de transcripción TCF4, que es un factor de transcripción clave aguas abajo en la vía /β-catenina de señalización WNT, alterado en la mayoría de los CCR [5]. El informe original de
VTI1A-TCF7L2 Hola, ha encontrado que el agotamiento de la transcripción de la fusión dio lugar a una pérdida significativa de crecimiento independiente de anclaje en la línea celular positiva CRC fusión NCI-H508 [1]. mutaciones frecuentes en una zona polyadenine dentro del
TCF7L2
gen han sido reportados previamente para CRC, especialmente en los tumores inestables microsatélites [6]. Además, los tumores estables microsatélites recientemente se ha demostrado que albergan mutaciones frecuentes en
TCF7L2
[7]. La observación de que
TCF7L2
transcritos de fusión que implican son detectables en una gran fracción de las muestras de CRC tal, sino también la mucosa del colon y otros tipos de tejidos normales normales, revela que el
TCF7L2
transcritos de fusión no son ni específica al cáncer ni en el colon y el recto. Por lo tanto, no tienen el potencial como biomarcadores de detección de cáncer esperado originalmente.