Extracto
Antecedentes
Hay buena evidencia en la literatura que el sistema cannabinoide se altera en el cáncer colorrectal. En el presente estudio, hemos investigado si CB
1 receptor de intensidad inmunorreactiva (CB
intensidad 1IR) se asocia con la gravedad de la enfermedad y el resultado.
Metodología /Principales conclusiones
CB
1IR se evaluó en muestras fijadas en formalina, incluidos en parafina recogidos con un intento consecutivo durante la resección quirúrgica del tumor primario a partir de una serie de casos diagnosticados de cáncer colorrectal. centro del tumor (n = 483) y el frente invasivo (n = 486) CB
1IR se puntuó de 0 (ausente) a 3 (tinción intensa) y los datos se analizaron como una fracción de la mediana es decir CB
1IR & lt; 2 y ≥2. En microsatélites estables, pero no de microsatélites tumores inestables (como se adjudicó sobre la base de la determinación inmunohistoquímica de cuatro proteínas de reparación de genes), hubo una asociación positiva significativa del grado del tumor con el OC
1IR intensidad. La diferencia entre los tumores estables e inestables de microsatélites para esta asociación de CB
1IR estaba relacionada con el estado de metilación de CpG isla de los casos. Los análisis de riesgos proporcionales de Cox de regresión indica una contribución significativa de CB
1IR a la supervivencia específica de la enfermedad en los tumores de microsatélites estables cuando se ajusta por el estadio del tumor. Para los casos con tumores estables etapa II de microsatélites, hubo un efecto significativo de ambos centro del tumor y CB frente
1IR en la supervivencia específica de la enfermedad. Las probabilidades de 5 años de supervivencia libre de eventos fueron: 85 ± 5 y 66 ± 8%; interior del tumor, el 86 ± 4% y 63 ± 8% para el CB
1IR. & lt; 2 y CB
1IR≥2 grupos, respectivamente
Conclusiones /Importancia
El nivel de CB
1 la expresión del receptor en el cáncer colorrectal se asocia con el grado del tumor de una manera dependiente del grado de CpG hipermetilación. Un alto CB
1IR es indicativo de un peor pronóstico en pacientes con tumores II microsatélites estables etapa
Visto:. Gustafsson SB, Palmqvist R, ML Henriksson, Dahlin AM, Edin S, Jacobsson SOP, et al. (2011) Alta tumor cannabinoide CB
1 Receptor inmunorreactividad impacta negativamente en Específico de la Enfermedad supervivencia en la fase II de microsatélites Estable del cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (8): e23003. doi: 10.1371 /journal.pone.0023003
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Diciembre, 2010; Aceptado: 11 Julio 2011; Publicado: 25 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Gustafsson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias al Consejo de Ciencias sueca (concesión no 12158, medicina, CJ Fowler.); la Sociedad Sueca del Cáncer (concesión no CAN2008 /856, R. Palmqvist;., no otorgan CAN 2010/437, C. J. Fowler.); y los Fondos de Investigación de la Facultad de Medicina, Universidad de Umeå (C. J. Fowler) para el apoyo financiero. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína G acoplada cannabinoide
1 (CB
1) receptores son más conocidos por su papel en la mediación de los efectos psicotrópicos buscados por los usuarios recreativos de cannabis. Sin embargo, CB
1 receptores y sus endógena ligandos anandamida (araquidonoiletanolamida) y 2-araquidonoilglicerol mediar una multitud de efectos en el cuerpo incluyendo la regulación del dolor, la formación de hueso, la homeostasis energética y la función gastrointestinal [1] - [4]. En el colon humano, CB
1 receptores se encuentran en el epitelio de las criptas, así como en células inflamatorias subepiteliales, en el músculo liso de los vasos sanguíneos y, en plexo submucoso [5], [6], donde modulan, entre otras funciones , la tasa de tránsito intestinal y la propulsión colónica [4].
Además de las funciones descritas anteriormente, el sistema endocannabinoide actúa como un sistema de "daños limitante" para mitigar los efectos de situaciones patológicas. Esto parece ser particularmente cierto para el sistema endocannabinoide gastrointestinal. Por lo tanto, la inflamación inducida por agentes tales como ácido 2,4-dinitrobenceno sulfónico, ácido sulfónico trinitrobenceno, aceite de mostaza o de sodio de sulfato de dextrano es más pronunciada en CB
1
- /- ratones que en sus compañeros de camada de tipo salvaje, mientras el tratamiento con un agonista del receptor de CB, o con compuestos de bloqueo de la eliminación celular y el metabolismo de los endocannabinoides, alivia la inflamación [7] - [11]. A CB polimorfismo del receptor
1 (1359 G /A) está asociado con una susceptibilidad reducida a la colitis ulcerosa en el hombre [12], aunque a nuestro conocimiento todavía no se sabe cómo este polimorfismo de un solo nucleótido afecta a la señalización de los cannabinoides. focos de criptas aberrantes en el colon, un cambio patológico temprano en la secuencia adenoma-carcinoma en el desarrollo del cáncer colorrectal, se forman como resultado del tratamiento azoximetano en ratones, y el tratamiento se asocia con un aumento en los niveles de 2-araquidonoilglicerol. El bloqueo del metabolismo de este endocannabinoide redujo la incidencia de focos de criptas aberrantes, al igual que el tratamiento con un agonista de los receptores CB [13] y, tal vez sorprendentemente, mediante tratamiento con un CB
1 receptor agonista inverso [14].
Los cannabinoides y los endocannabinoides producen efectos potencialmente útiles sobre la proliferación de células de cáncer, la motilidad y el comportamiento invasivo (revisión, ver [15], [16]). En líneas celulares de cáncer colorrectal, se han reportado efectos tanto
1-dependientes e independientes del de cannabinoides endógenos y /o sintéticos sobre la viabilidad celular CB [17] - [20]. En un modelo genético de la progresión del cáncer colorrectal (Apc
Min /+ ratones), los animales que carecen de la CB
1 receptor mostró un mayor número de pequeños pólipos intestinales y de colon que los correspondientes CB
1
+ /+ ratones [21]. Pacientes con cáncer colorrectal que son ya sea homo o heterocigotos para el 1359 G /A CB
1 polimorfismo del receptor muestran un tiempo de supervivencia más corta que los pacientes de tipo salvaje G /G [22]. Por último, la reducción de expresión de CB
1 mRNA receptor y la proteína se ha informado en el cáncer colorrectal [17], [21], debido al menos en parte a un aumento de la frecuencia de metilación de la región promotora del receptor [21].
los datos anteriores son consistentes con la sugerencia de que el sistema cannabinoide endógeno puede ser disfuncional en el cáncer colorrectal, y que dicha disfunción pueden afectar a la gravedad y /o pronóstico de la enfermedad. Una forma de investigar esta posibilidad es determinar el nivel de expresión de CB
1 receptor en una gran cohorte de casos bien caracterizados de cáncer colorrectal con tiempos largos de seguimiento. Esto ha llevado a cabo en el presente estudio. Dado que el cáncer colorrectal es muy heterogéneo, un enfoque particular se ha hecho sobre la relación del CB
1 inmunorreactivas intensidades con componentes clave patológicos /moleculares de la enfermedad [23]: el escenario, la categoría de grado del tumor, la detección de inestabilidad de microsatélites, la incidencia de brotes en la parte delantera del tumor y el fenotipo CpG isla methylator (CIMP).
Métodos
Declaración de Ética
el comité de ética de investigación en Umeå hospital universitario (Consejo regional de Revisión Ética en Umeå, Suecia) aprobó el manejo de las muestras de tejido y datos de los pacientes en el presente estudio, incluyendo el procedimiento mediante el cual los pacientes verbalmente dieron su consentimiento informado. Este consentimiento se documentó en cada historia clínica del paciente, y esto fue considerado por el comité de ética a ser suficiente. En la base de datos utilizada para los análisis aquí, las muestras de tejido se les dio un número de caso y el año, y los nombres de los pacientes no se indican en la base de datos.
Los pacientes
La fijado en formol e parafina -embedded muestras utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de tejido recogido durante la resección quirúrgica del tumor primario de cáncer colorrectal (Crums (cáncer colorrectal en el estudio de Umeå)). Las muestras se recogieron con un intento consecutivo en el Departamento de Cirugía, Hospital de la Universidad de Umea, Suecia, durante el período 1995-2003 y en lo posible los pacientes fueron seguidos durante un máximo de 113 meses [24]. Además de los datos clínico-patológicos reportados en [24], los datos sobre la estabilidad de microsatélites /inestabilidad de estado (determinación inmunoquímica de la expresión de cuatro proteínas de reparación de genes) y CIMP cribado se han recogido y se informó anteriormente [25]. La incidencia de los brotes en la parte delantera del tumor se evaluaron como en [26]. Los criterios de exclusión fueron muestra de tejido tumoral insuficiente o no está disponible y la información clínica insuficiente. Con todo, 487 casos fueron anotados por tanto del centro del tumor o tumores frente CB
1 inmunorreactividad del receptor (véase más adelante). La información clínica en la base de datos para estos pacientes fue el siguiente: la edad mediana de 71 años (rango 26-96, n = 487, de los cuales 269 eran varones y 218 mujeres); ubicación cáncer en colon derecho 31,1%, a la izquierda de colon 31,1%, el recto 37,8% (n = 482); estadio de la enfermedad que 15,5%, 39,3% II, III 21,0%, IV 24,2% (n = 476); el grado del tumor y /bien moderadamente diferenciado 48.75%, moderada pobres /pobremente diferenciado 51,25% (n = 480); microsatélite estable 85,0%, de microsatélites inestable 15,0%; (N = 473); CIMP estado negativo del 50,4%, 37,2% de baja, alta 12,4% (n = 484). Además, el 82,4% (de 483 casos) no recibió radioterapia preoperatoria (ya sea de 5 x 5 Gy o 25 Gy × 2); 75,0% (de 476 casos) se sometieron a cirugía radical; y el 13,7% (de 475 casos) recibieron quimioterapia adyuvante.
Medición de CB
1 receptor de inmunorreactividad (CB
1IR) en el tejido tumoral
Las secciones de tejido incluidas en parafina se deparaffinized y rehidratada antes de la recuperación de antígenos en una olla a presión (2100 retriever, Biocare médica) en la diva Decloaker (Biocare médica). Las muestras se colocaron a continuación en una máquina de inmunotinción semiautomatizado Ventana (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ). El anticuerpo del receptor CB
1 (AbCam cat. No. 23703, AbCam plc, Cambridge, Reino Unido, diluido 1:50) y los componentes secundarios (kit de detección DAB iVIEW, Ventana Medical Systems Inc.) se añadieron a continuación. El anticuerpo, un anticuerpo policlonal de conejo a un péptido que corresponde a los ácidos C terminal de aminoácidos 461-472 de la CB humana
1 del receptor, y que reacciona de forma cruzada con el ser humano, ratón y rata CB
1 receptor de acuerdo con datos de los fabricantes, se ha demostrado previamente por los investigadores en Umeå (incluyendo el autor correspondiente) para producir el modelo apropiado de tinción en el cerebelo humano, pero no para producir inmunoreactividad en prosencéfalos de CB
1
- /- ratones [27 ]. Un ExPasy BLAST (http://expasy.org/tools/blast/) de la secuencia del péptido dio CB
1 y sus dos variantes de empalme como los únicos éxitos en el hombre. En varias otras especies, se identificaron de nuevo CB
1 receptores, el único no-CB
1 resultados Siendo de proteínas llamadas "proteínas no caracterizado [Gen: CNR1]" (de cerdo, perro y pollo), así como " proteína no caracterizada putativo [Gen: PANDA_015085] -.
Ailuropoda melanoleuca gratis (panda gigante) "y" cromosoma 14 SCAF15003, todo el genoma escopeta fragmento de secuencia "en
Tetraodon nigroviridis gratis (pez globo verde)
CB
1IR fue evaluada por un investigador (SBG) que desconocía el estado clínico de los pacientes. Las muestras fueron clasificadas sobre la base de la CB dominante
1 receptor intensidad inmunorreactiva (CB
1IR) en el interior del tumor y en los frentes invasivas de tumores y se puntuaron de 0 (ausente) a 3 (intensa) para las células . Cuando todas las muestras habían sido anotado, el investigador repitió el procedimiento (que no tienen acceso a las puntuaciones anteriores) y luego comparó las puntuaciones en las dos carreras. Los casos en que las puntuaciones fueron divergentes se evaluaron luego una tercera vez, de nuevo sin acceso a las puntuaciones anteriores. Para las muestras de tumor delanteros marcados, por ejemplo, hubo 53 ocasiones en las puntuaciones primera y segunda no estaban de acuerdo, debido principalmente a las puntuaciones erróneas desde la etapa inicial de la primera carrera. Los resultados finales se introdujeron luego por otro investigador (CJF) en la base de datos para el análisis.
Las evaluaciones estadísticas
análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, la prueba exacta de Fisher y la χ
Se realizaron 2 pruebas utilizando el paquete estadístico integrado en el programa GraphPad Prism 5 equipo para Macintosh (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Cox de riesgos proporcionales y análisis de regresión logística binaria se realizaron utilizando el software de IBM SPSS Statistics 19 para Macintosh (IBM Inc., Somers, NY, EE.UU.). Para los análisis de supervivencia, eventos específicos de la enfermedad se define como la muerte cuando se conoce la enfermedad diseminada o recurrente ( "†
ca"). La muerte por otras causas fue censurado, al igual que los casos en que el paciente estaba todavía vivo en la fecha de la última de seguimiento. La duración de la supervivencia libre de eventos se define como el tiempo desde el diagnóstico hasta que o bien la fecha de muerte por cáncer colorrectal, la muerte por otras causas, o si se ha producido ninguna muerte, hasta la fecha del último seguimiento.
Resultados
CB
1IR inmunohistoquímica
se realizaron estudios iniciales utilizando el mismo lote de anticuerpo como en un estudio previo realizado por los investigadores en Umeå utilizando microarrays de tejidos a partir de muestras de cáncer de próstata [27]. Se encontró que a una dilución de 1:300, CB
1IR se encuentra en las células epiteliales de las criptas, con positividad dispersa en las células inflamatorias subepiteliales (Fig. S1 A), un resultado que concuerda con estudios de CB
1IR en el colon normal [5], [6]. Un ejemplo de tejido de tumor teñidas con este lote se muestra en la Fig. 1B. Debido a la cantidad limitada de anticuerpo restante, se utilizó un lote posterior del anticuerpo AbCam (lote 761993) para el estudio principal, y nos pareció que era necesaria una menor dilución (1:50) para una buena inmunotinción. Un ejemplo de la tinción se ve en la Fig. 1A, con una sección serial correspondiente sin anticuerpo primario se muestra en la Fig. 1B.
Secciones de la misma caso se utilizaron en presencia (Panel A) y ausencia (Panel B) del anticuerpo primario. Aumento del objetivo es de 10 ×.
La mejor prueba de la especificidad de la inmunoquímica se considera que el uso de controles knockout [28]. Se encontró que la tinción inmunoquímica adecuado se observó en los cerebros de los ratones de tipo silvestre, mientras este estaba ausente de cerebros de CB
1
- /- ratones (Fig. S2). Ashton [29] ha argumentado recientemente que los histogramas de densidad óptica son útiles para distinguir entre un cambio en el patrón de immunolabelling (que habían de ser visto por una verdadera pérdida de señalización en un nocaut) en comparación con una reducción de la intensidad de marcado (lo que elevaría una cuestión de la validez del anticuerpo). histogramas de densidad óptica de nuestra naturaleza y tipo CB
1
- /-. tejidos son claramente diferentes (. ven mejor de los toboganes más altos de aumento, la figura S2), en consonancia con una buena especificidad de anticuerpos [29]
Una forma común de las pruebas de la especificidad del anticuerpo es investigar preadsorbtion del anticuerpo con el péptido inmunizante, aunque la utilidad de esta medida ha sido cuestionado [30]. Sin embargo, también se llevaron a cabo una serie de experimentos utilizando la preincubación del anticuerpo con el péptido inmunizante (AbCam, Cat. Nº 50542). Sin embargo, la preincubación con el péptido inmunizante aumentó en gran medida la inmunorreactividad observada en lugar de bloqueado, y dio un patrón más bien aleatoria de tinción inmunorreactivo (datos no mostrados). El péptido (secuencia de aminoácidos MSVSTDTSAEAL) inmunizar tiene dos ácidos cargados negativamente aminoácidos (aspartato y glutamato), cinco aminoácidos polares (tres serina, treonina dos) y aminoácidos no cargados positivamente. Es bien sabido que los péptidos cargados negativamente se unen al vidrio, y se concluye que el procedimiento de lavado en la técnica de Ventana, mientras que ser suficiente para proporcionar una buena especificidad
per se
(como se ve en los ratones knock-out), no es suficiente para eliminar el péptido control positivo ligado al anticuerpo se adhiere de forma no específica al vidrio y /o de ion híbrido lípidos.
Distribución de CB
puntajes 1IR en el centro del tumor y los frentes
Un total de 483 (tumor de interiores) y 486 (delante del tumor) se calificaron los casos de CB
1IR intensidad y se introdujeron en la base de datos. Tanto en la membrana plasmática y citoplasmática CB
1IR se anotó, por lo que los valores representan el conjunto total de CB
1 receptores. tinción nuclear de CB
1IR (que se encuentra en 42 casos) no se obtuvo. La distribución de frecuencias de la CB
1IR para el centro del tumor y frentes fueron similares, con una puntuación de 0 se devuelve para 77 y 60 casos; una puntuación de 1 en 196 y 185 casos; una puntuación de 2 para 140 y 156 casos; y una puntuación de 3 para 70 y 85 casos (números son el centro del tumor y frentes, respectivamente). No hubo diferencia significativa en el patrón de distribución de los dos conjuntos de puntuaciones de (p & gt; 0,1, χ
2 test). Se observó que las calificaciones de las dos regiones no siempre fueron los mismos para un caso dado. De hecho, para los 482 casos marcados tanto para centro del tumor y la frente, los resultados fueron los mismos en solamente 319 (66%) de los casos, siendo mayor en el frente del tumor en 110 (23%) casos y más alto en el centro del tumor en 53 (11%) de los casos. En consecuencia, a lo largo de este estudio, ambas puntuaciones centro del tumor y delanteros del tumor se analizaron por separado. tejido no maligno no se anotó, pero en general su nivel de inmunoreactividad parecía ser baja en lugar de más alto que visto en el tejido tumoral.
Asociación de CB
1IR con las características del paciente en cirugía
a la vista de la distribución de frecuencias de la CB
1IR, los análisis se realizaron utilizando una fracción de la mediana simple, es decir CB
1IR & lt; 2 y ≥2. Utilizando los datos de todo el conjunto para buscar las variables, una regresión logística binaria con los parámetros de género, sitio (es decir, de colon derecho, izquierdo colon, recto), radioterapia (antes de la cirugía), estadio de la enfermedad, el grado histológico del tumor (es decir, la diferenciación), el tipo de tumor (es decir, mucinoso o no mucinoso), el estado de inestabilidad de microsatélites cribado [estable (MSS) o inestable (MSI)], la cantidad de linfocitos en la parte delantera del tumor y la frecuencia de brotes tumorales (pequeños agregados de células tumorales en la parte delantera invasión tumoral, [31]) se llevó a cabo. De estas variables, sólo el grado histológico del tumor (p & lt; 0,005) y la inestabilidad de microsatélites estado de cribado (p & lt; 0,05) se asociaron significativamente con el OC
1IR (datos no mostrados). Estos efectos pueden simplemente ser visualizados mediante la división del conjunto de datos en cuatro grupos sobre la base de los dos parámetros importantes (Fig. 2). La mayoría de los casos fueron clasificados como SMS, y el CB detallada
distribuciones 1IR para los casos del SMS que no recibieron radioterapia antes de la cirugía se resumen en la Tabla 1. Tanto en el centro del tumor y el tumor frentes, hay más casos con un CB
1IR≥2 para los casos del SMS con moderada mala mala diferenciación /tumor que con los tumores bien /bien moderadamente diferenciados. En los casos de MSI, este efecto del grado histológico del tumor no se ve, y los casos tienen un CB similares
distribución 1IR a las /los casos moderados de los pobres del SMS pobremente diferenciado (Fig. 2). Un análisis más detallado de los 62 casos con MSI anotó para CB
1IR que no recibieron radioterapia antes de la biopsia reveló una asociación significativa del centro de tumores o CB frontal
1IR con cualquiera de las etapas de la enfermedad (en este caso las etapas I y II se combinaron ya que sólo 4 casos con estadio I se anotó para centro de tumores CB
1IR), el grado del tumor, si los tumores eran mucinoso o no mucinoso, la incidencia de los linfocitos en la parte delantera del tumor o el estado CIMP (p & gt; 0,1, prueba exacta de Fisher o χ
2 de prueba, en su caso, los datos no presentados). Por género, los valores de p para los CB
1IR distribuciones eran 0,069 y 0,18 para el centro del tumor y frontal, respectivamente (prueba exacta de Fisher), y por la incidencia de brotes en la parte delantera del tumor, los valores de p (χ
2 de prueba) fueron 0,086 y 0,073, respectivamente (datos no mostrados)
Panel A, el centro de tumor.; El panel B, delante del tumor. Los datos se agrupan de acuerdo con el grado histológico del tumor (w-m, bueno /bien moderadamente diferenciado; m-p, moderada pobres /pobremente diferenciado) y la estabilidad de microsatélites (MSS, estable, MSI, inestable). La χ
2 y por lo tanto los valores de p son para los datos agrupados como una matriz de 4 × 2 (donde el 2 es el CB
1IR). N se refiere al número total de casos para cada barra.
Una diferencia importante entre el SMS y MSI es la mayor incidencia de un alto grado de la isla CpG metilación en este último [32]. En nuestro conjunto de datos, de los 467 casos anotaron para el estado de detección de inestabilidad de microsatélites, CIMP estado y el tumor central CB
1IR, las distribuciones CIMP fueron: MSS (n = 396), negativo 225 (57%), bajo 153 (39 %) y alta 18 (4,5%); MSI (n = 71), negativo 15 (21%), bajo 17 (24%) y alta 39 (55%) (p & lt; 0,0001, χ
2 test). Cuando se añadió el estado CIMP de las muestras en la regresión logística binaria de todo el conjunto de datos con los parámetros descritos anteriormente, se mantuvo el efecto significativo de la grado histológico del tumor (p & lt; 0,005), tanto para el centro del tumor y CB frente
1IR , pero el efecto de la condición de detección de inestabilidad de microsatélites se perdió a los centros del tumor (p & gt; 0,1), pero no para los frentes de tumores (P & lt; 0,05) (datos no mostrados). Con el fin de investigar más a fondo, los datos de las muestras se dividieron en los tres grupos CIMP: negativo, de baja y alta independientemente del estado de inestabilidad de microsatélites de detección o si los pacientes habían recibido radioterapia antes de la cirugía. Hubo una clara influencia de la situación CIMP en los resultados, donde se observó el efecto del grado histológico del tumor en los casos con una puntuación CIMP-negativo, pero no en los casos con una puntuación CIMP-alta, los casos CIMP-bajos estar en un sitio en el medio (Fig. 3). Este análisis no tiene en cuenta el estado de detección de inestabilidad de microsatélites de los casos con el fin de lograr suficientes tamaños de los grupos. Sin embargo, un patrón similar se observa cuando el MSI casos del SMS y se analizan por separado, aunque como una advertencia cabe señalar que algunos de los tamaños de los grupos son muy pequeños (Fig. S3).
Panel A, centro de tumor; El panel B, delante del tumor. Los datos se agrupan de acuerdo con el grado histológico del tumor (w-m, bueno /bien moderadamente diferenciado; m-p, moderada pobres /pobremente diferenciado) y el estado CIMP. De los 473 casos anotó para el centro del tumor CB
1IR, 389 fueron clasificados como MSS, 71 y 13 como MSI no clasificados en la base de datos. Las cifras correspondientes para el CB delante del tumor
1IR fueron 392, 71 y 13, respectivamente. Los valores de p son de la prueba exacta de Fisher. El total (es decir, CB
1IR & lt; 2 y ≥2). Número de casos se presentan entre comillas dentro de cada barra de
Asociación de CB
1IR con enfermedad resultados
los casos en la base de datos habían sido seguidos durante un máximo de 113 meses [24] que permiten la influencia del CB
puntuación 1IR el momento del diagnóstico sobre la evolución de la enfermedad que se determine. El uso de todo el conjunto de datos (es decir, incluso aquellos casos en los CB
1IR no se anotó, una de riesgos proporcionales de análisis de regresión univariante de Cox en el conjunto de datos indica que la administración de la radioterapia antes de la cirugía fue, como era de esperar, relacionado con el desenlace de la enfermedad (Exp ( B) 0,60 [IC del 95%: 0,40-0,91] p. & lt; 0,05) en el número de casos que no recibieron /recibieron radioterapia fue 441/102 el análisis de regresión de Cox de riesgos proporcionales es una prueba utilizada para determinar la contribución del parámetro (s) bajo investigación en la supervivencia específica de la enfermedad sin hacer suposiciones sobre la naturaleza de la curva de supervivencia. la medida Exp (B), a veces llamada la relación de riesgos, indica el cambio en el riesgo de que el parámetro objeto de investigación se cambió a partir del parámetro por defecto (en este caso no radioterapia) para el parámetro de prueba (aquí radioterapia). En este caso, la radioterapia redujo el riesgo de muerte debido a la enfermedad desde el) valor Exp (B fue significativamente menor que la unidad. con el fin de eliminar la influencia de este parámetro, el CB
1IR datos se analizó sólo para los casos que no recibieron radioterapia. Además, se analizaron por separado los casos del SMS y MSI.
En los casos del SMS, un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante no mostró un efecto significativo de cualquiera interior del tumor o frontal CB
1IR sobre disease- supervivencia específica. Sin embargo, cuando un análisis bivariante se llevó a cabo con estadio de la enfermedad como el segundo parámetro, una contribución muy importante de CB
1IR se observó (Tabla 2). Esto fue confirmado en gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier: para todo el conjunto de datos, no había ninguna contribución significativa del tumor interior CB
1IR (Fig. 4A), mientras que en el estadio tumoral II (donde los tumores se han infiltrado en la capa muscular propia del colon o del recto, pero no han dado lugar a metástasis en los ganglios linfáticos), y en el tumor en estadio IV (donde los tumores se han extendido a otros órganos), con un CB casos
1IR≥2 tienen una supervivencia específica de la enfermedad más pobre de los que tienen un CB
1IR & lt; 2 (. Las figuras 4B y D; definiciones de estadificación de la enfermedad dadas en [33]). No se observaron diferencias para el estadio tumoral III, aunque hay que tener en cuenta que este es un grupo muy heterogéneo, que el número de casos fue menor que para los estadios de la enfermedad II y IV y que los análisis de subgrupos sufren de baja potencia. Sólo había tres pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en estadio I (donde el tumor sólo se ha infiltrado en la capa submucosa del colon o del recto y no se ha diseminado a los ganglios linfáticos u otros órganos) que murieron como resultado de su cáncer durante el seguimiento período de seguimiento, el análisis se opone a la influencia de CB
1IR al resultado específico de la enfermedad en este grupo de pacientes. En el caso de la parte delantera tumor CB
1IR, el efecto significativo sobre el resultado del tumor en los pacientes en estadio II fue también visto, pero no en los pacientes en estadio IV (Fig. 4 y datos no mostrados, respectivamente). En los casos en estadio II, las probabilidades de 5 años de supervivencia libre de eventos fueron: 85 ± 5 y 66 ± 8%; interior del tumor, el 86 ± 4% y 63 ± 8% para el CB
1IR & lt; 2 y CB
1IR≥2 grupos, respectivamente. Se puede notar que algunos de los casos en estadio II murió un mes después de la cirugía. Sin embargo, cuando se excluyeron estos casos, se retuvo la contribución significativa de CB
1IR al resultado específico de la enfermedad (datos no mostrados). Tras una posterior subdivisión de los casos en estadio II de acuerdo con la localización del cáncer, una contribución significativa tanto de centro de tumores y CB frontal
1IR en la supervivencia específica de la enfermedad se observó para los cánceres de recto, pero no para los cánceres de colon, aunque la dirección ( es decir, la supervivencia más pobre para un alto CB
1IR) era el mismo. Es importante señalar, sin embargo, que la interpretación de los resultados con estos subgrupos están limitados por una potencia baja y no son compatibles con el análisis de Cox (véase más adelante). Parcelas
Kaplan-Meier de la supervivencia específica de la enfermedad para las regiones del tumor y estadios de la enfermedad que se muestran. Se muestra en las figuras son el número de casos (n), seguido por el número que murió como resultado del cáncer colorrectal (†
ca). El valor de χ 2
dada en las figuras es desde el log-rank test (Mantel-Cox) la comparación de las dos curvas; ** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05,
† 0,05 & lt; p & lt; 0,1;
NSP & gt; 0,1. El correspondiente χ
2 valores para el frente de tumores en estadios III y IV fueron 0,24
NS y 1,44
NS, respectivamente.
El hecho de que en los pacientes del SMS del CB
1IR está asociado con el grado histológico del tumor en la cirugía puede, por supuesto, significa que la asociación se ha descrito anteriormente es simplemente un reflejo de la influencia del grado histológico del tumor al resultado de la enfermedad. Esta posibilidad se investigó usando análisis de riesgos proporcionales de regresión multivariante de Cox (tabla 2), donde se encontró que el grado histológico del tumor proporciona información pronóstica aditivo a la observada con el centro tumor CB
1IR cuando se incluyó también la etapa de la enfermedad como una parámetro. Por el contrario, el CB delante del tumor
1IR parámetro perdió importancia. Sin embargo, cuando se incluyó también la incidencia de los brotes en la parte delantera del tumor (en sí mismo un factor de pronóstico), la influencia del grado histológico del tumor al resultado de la enfermedad se redujo, mientras que la influencia tanto de centro de tumor y CB frente
1IR era significativa (Tabla 2). Estos datos sugieren que la importancia pronóstica del centro del tumor y posiblemente también delante del tumor CB
1IR no es secundaria a su asociación con el grado histológico del tumor. Un análisis más detallado indica que la importancia pronóstica de CB
1IR se mantuvo cuando el área de estado, el sexo y el tumor CIMP se incluyeron en el análisis multivariante (centro del tumor, Exp (B) 1,77 [IC del 95% 1,16 a 2,72, p & lt; 0,01; delante del tumor Exp (B) 1,67 [IC del 95% 1,11-2,50] p. & lt; 0,05)
En los casos de MSI, no se pudieron sacar conclusiones en cuanto a si CB
1IR impactó en la supervivencia específica de la enfermedad en los asuntos de fase II, simplemente porque de los 32 casos que caen dentro de esta categoría (después de la exclusión de los casos que reciben radioterapia antes de la cirugía), sólo uno murió de cáncer durante el período de seguimiento.
Discusión
el presente estudio fue motivado por los datos de ambos cultivos celulares y muestras de pacientes lo que sugiere que un sistema de señalización endocannabinoide disfuncional está involucrado, ya sea en la patogénesis y /o como consecuencia de cáncer colorrectal [13] [14], [17, ], [21], [22]. Al principio vale la pena comentar el hecho de que tanto la superficie celular y citoplasmática CB
1 receptores se anotó. CB
1 receptores son a menudo considerados como receptores de la superficie celular, pero está bien establecida en muchas células y tejidos que se han encontrado de forma intracelular [34] - [37], como era de esperar por los receptores que internalizan tras la estimulación agonista sostenida [38], [39]. Se ha sugerido que estos receptores intracelulares son activos y pareja para quinasa extracelular regulada por señal [35], aunque otros autores no han visto intracelular co-localización de CB
1 receptores con subunidades Gα [39]. ligandos de origen natural para CB
1 receptores son altamente lipofílica, y por lo tanto la membrana plasmática no es un obstáculo para su penetración celular. Extracelular quinasa regulada por señal es una importante molécula de señalización, y se ha implicado en los efectos antiproliferativos de los cannabinoides en un número de diferentes líneas celulares de cáncer [40], por lo que no es razonable (y técnicamente mucho menos difícil) para anotar la intensidad combinada de membrana plasmática y CB intracelular
1 receptores. Hay tres principales resultados en el estudio, y éstos se discuten en turno.
1.