Extracto
La detección y tratamiento del cáncer ha avanzado significativamente en las últimas décadas, con mejoras importantes en nuestra comprensión de la base molecular y genética fundamental de la enfermedad. A pesar de estos avances, las metodologías de detección de drogas han permanecido esencialmente sin cambios desde la introducción de la
in vitro
pantalla de línea celular humana en 1990. Aunque en los métodos existentes proporcionan información sobre los efectos generales de los compuestos sobre la viabilidad celular, que son restringido por medidas a granel, muestras de gran tamaño, y la capacidad de la falta de medir la cinética de proliferación a nivel de células individuales. Para comprender realmente la naturaleza de la proliferación de células cancerosas y para desarrollar terapias adyuvantes personalizadas, hay una necesidad de nuevas metodologías que proporcionan información cuantitativa para supervisar el efecto de los fármacos sobre el crecimiento celular así como los cambios morfológicos y fenotípicos en el nivel de células individuales. Aquí nos muestran que una técnica de imagen conocida como fase cuantitativa espacial microscopía de interferencia de la luz (SLIM) se ocupa de estas necesidades y proporciona ventajas adicionales sobre los ensayos de proliferación existentes. Demostramos estas capacidades a través de mediciones de los efectos de la hormona estradiol y el ICI182,780 antiestrógeno (Faslodex) sobre el crecimiento de las células MCF-7 de cáncer de mama. Además de proporcionar información sobre los cambios en el crecimiento global, SLIM proporciona información adicional biológicamente relevante. Por ejemplo, nos encontramos con que la exposición a los resultados de estradiol en células de crecimiento rápido con la masa seca inferior a la población control. Posteriormente el bloqueo de los receptores de estrógenos con resultados ICI en las células de crecimiento más lento, con la masa en seco más bajas que el control. Esta capacidad de medir los cambios en la cinética de crecimiento en respuesta a las condiciones ambientales proporciona nueva información sobre los mecanismos de regulación del crecimiento. Nuestros resultados establecen las capacidades de SLIM como una tecnología de detección de drogas avanzado que proporciona información sobre los cambios en la cinética de proliferación a nivel celular con una mayor sensibilidad que cualquier método existente
Visto:. Mir M, Bergamaschi A, Katzenellenbogen BS, Popescu G (2014) cuantitativos de imagen de alta sensibilidad para la Supervisión de cáncer individual cinética de crecimiento celular y la respuesta de drogas. PLoS ONE 9 (2): e89000. doi: 10.1371 /journal.pone.0089000
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Octubre, 2013; Aceptado: January 13, 2014; Publicado: 18 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Mir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la National Science Foundation (NSF) Subvenciones: Centro de Ciencia y Tecnología sobre Comportamientos emergentes de los sistemas celulares integrado EBNC 0.939.511 (GP), NSF CARRERA 08-46.660 (GP), CBET-1040461 resonancia magnética (GP), mama Fundación de Investigación del Cáncer (a BSK), Institutos nacionales de Salud (NIH) AT006268 P50 (a BSK), y una beca postdoctoral del Departamento de Defensa, W81XWH-09-1-0398 (AB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: G. Popescu tiene intereses financieros en Phi Optics, Inc., una compañía de desarrollo de microscopios fase cuantitativa, que, sin embargo, no patrocinan esta investigación. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El crecimiento celular y la homeostasis de masas se han descrito como fundamental para la biología, sin embargo, no son suficientemente entendido [1]. Esta deficiencia se remonta a la falta de métodos capaces de cuantificar la masa de células individuales con la sensibilidad necesaria. Como resultado de ello, recientemente, se ha hecho un progreso significativo hacia el desarrollo de nueva tecnología para estudiar el crecimiento celular. Estos métodos se pueden dividir en
micromecánico
[2] - [4], la traducción de los cambios de frecuencia de resonancia de microestructuras en masa flotabilidad celular, y
óptico
[5] - [8], la conversión cuantitativa imágenes de fase en mapas de densidad de masa seca. Los métodos ópticos son ideales para el estudio de crecimiento de las células individuales adherentes, así como grupos de células. Esta capacidad abre nuevas oportunidades en la biología de las células del cáncer, donde las mediciones sensibles de proliferación celular puede conducir a una mejor comprensión de la enfermedad, así como el seguimiento cuantitativo de la eficacia del fármaco. Aquí demostramos que
Fase cuantitativa de imágenes (QPI)
proporciona un método altamente sensible para el estudio de crecimiento de células cancerosas y para los medicamentos de prueba. Utilizamos líneas celulares de cáncer de mama como modelo para demostrar el principio de la aplicación de este método.
El cáncer de mama para el 30% de todos los casos de cáncer diagnosticados y el 14% de todas las muertes relacionadas con el cáncer en las mujeres [9]. Una disminución significativa (7%) en la incidencia se ha observado desde el año 2002 que se puede atribuir directamente a una mejor comprensión de la relación entre el estrógeno y el crecimiento del cáncer de mama [10] - [16]. Este conocimiento ha dado lugar al desarrollo de una clase de agentes que modulan directamente el receptor de estrógeno (ER) y ahora son la piedra angular del tratamiento y la prevención en pacientes ER positivos (70% de todos los casos) [17]. Con la comprensión de que es posible ejercer el control sobre el crecimiento del cáncer a través de anti-hormonas y agentes quimioterapéuticos vino la necesidad de pruebas a gran escala de compuestos posiblemente útiles. En 1974, más de 40.000 compuestos se están probando anualmente usando modelos murinos [18], [19]. En 1990, el NCI estableció la pantalla principal de 59 líneas celulares humanas, que sigue en uso hoy en día [20], [21]. Esta nueva pantalla primaria requiere métodos para evaluar el crecimiento
in vitro
. Varios ensayos metabólicos fueron desarrolladas para medir el crecimiento celular y la viabilidad -que, hasta la fecha, se han mantenido prácticamente sin cambios [20], [22] - [26].
Un método ampliamente utilizado se basa en la reducción de un sal de tetrazolio incolora, para dar un proporcional formozan de color con el número de células viables. Aunque estos ensayos son útiles para la medición de la eficacia citotóxica en general de un compuesto, gran número de células (10
3-10
5) [27] tienen que ser utilizados para evitar conclusiones incorrectas de efectos tales como tiempos de duplicación variables [20]. Además, puesto que muchos medicamentos tienen efectos sobre la detención del ciclo celular que no resultan en cambios metabólicos, en algunos casos un falso lectura puede ser hecho [28]. ensayos no basados en tetrazolio también se han desarrollado. Estos ensayos utilizan colorantes que se unen electrostáticamente a aminoácidos básicos [25] y la señal medida es por lo tanto lineal con el recuento de células. A pesar de las dificultades prácticas, un tal reactivo conocido como sulfordamina B (SRB) fue finalmente aprobado por exámenes de rutina. Ambos tipos de ensayo proporcionan mediciones indirectas de crecimiento: los ensayos a base de tetrazolio medir la actividad metabólica mientras que el ensayo SRB esencialmente mide la concentración de proteína total. Ambos métodos se basan en el uso de un gran número de células, sólo proporcionan mediciones a granel en toda la colección de células, y son incapaces de medir las respuestas dependientes del tiempo a los medicamentos en el nivel celular. Normalmente, los datos del ensayo de crecimiento se complementan con los experimentos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para proporcionar información de tipo estadístico, y estudiar la expresión génica y la progresión del ciclo celular. Aunque muy informativo, FACS análisis de las células requieren ser removidos de sus condiciones de cultivo normales, grupos de células a separar, provocando alteraciones en el fenotipo y morfología.
Por lo tanto, cada vez es más evidente que para comprender verdaderamente la naturaleza de proliferación de células cancerosas y para desarrollar terapias adyuvantes personalizadas, hay una necesidad de nuevas metodologías que proporcionan información cuantitativa de monitorizar los efectos del fármaco sobre el crecimiento celular y los cambios morfológicos y fenotípicos que se acompañan en el nivel de células individuales. La pantalla de la droga ideal debería ser lo suficientemente sensible para evaluar rápidamente la respuesta de un pequeño número de células para una variedad de terapias potenciales con el fin de evaluar directamente la respuesta de un paciente o la eficacia de un fármaco particular. Aquí nos muestran que QPI [29] aborda esta brecha tecnológica. La microscopía espacial interferencia de la luz (SLIM) [30] es un enfoque QPI que tiene sensibilidad del nivel de femtogramo a los cambios en la masa seca y puede proporcionar esta información de forma simultánea tanto en la célula y de la población [31]. SLIM puede combinarse con la microscopía de fluorescencia para medir el ciclo de crecimiento celular dependiente de [31]. En este trabajo, se utiliza el receptor de estrógeno (ER) de la línea celular de cáncer de -positivo MCF-7 de mama [32], [33] como un sistema modelo para demostrar que SLIM se puede utilizar como un ensayo de proliferación de drogas altamente sensible.
la línea celular MCF-7 ha sido un modelo ampliamente utilizado para estudiar la influencia hormonal en el crecimiento del cáncer de mama, en particular, en respuesta a los estrógenos que juega un papel clave en la promoción del crecimiento y la progresión de las células cancerosas. Se midió el crecimiento de las células MCF-7 grupos de células en medios de cultivo celular estándar (Veh) y bajo la influencia de estradiol (E2), la forma predominante de estrógenos durante los años reproductivos, e ICI, 182, 780 - también conocido como Faslodex- [ ,,,0],34], un antagonista completa de la sala de emergencia para tratar el cáncer de mama metastásico en mujeres posmenopáusicas. Los resultados mostrados aquí establecen que, además de ser un ensayo de proliferación valioso, Fase cuantitativa de imágenes también proporciona información biológicamente relevante a nivel de población de células y el grupo de células individuales que no es accesible a través de otros métodos. Tales medidas, en combinación con los ensayos moleculares existentes tienen el potencial de mejorar el diseño de fármacos y caracterización y para cerrar la conexión entre nuestra comprensión molecular de cáncer y tratamiento de drogas efectos sobre las propiedades de crecimiento celular y fenotípicos tales como tamaño de la celda /masa.
Resultados
MCF-7 células fueron sembradas en una cámara de diapositivas dos bien y las mediciones se realizaron en tres condiciones de cultivo celular (ver
Materiales y Métodos
para más detalles sobre la cultura y el tratamiento de células) . En primer lugar, medios de cultivo celular típico como el vehículo control (Veh), segundos medios de cultivo celular que contiene 10 nM de estradiol (E2), y, finalmente, medios de cultivo celular con el antiestrógeno 1 M ICI182,780 10 nM E2 (E2 + ICI). Para el tratamiento E2 + ICI, las células se cultivaron en condiciones de E2 durante 10 horas antes de añadir ICI. El punto de 10 horas fue elegido para administrar el fármaco ya que este es el punto más próximo en el que se observó una diferencia significativa entre las tasas de crecimiento de Veh y las poblaciones tratadas con E2 (Fig. S1). Un 1,55 × 1,16 mm
2 área de cada pocillo se escanea cada 30 minutos utilizando un microscopio de contraste de fase comercial equipado con un SLIM módulo adicional. Para cada experimento, un pocillo contenía una población de control sin tratar (Veh) y el segundo bien contenida la población tratada E2 o E2 + ICI. Dos mediciones se realizaron de tal manera para cada condición. Se harán libremente disponibles bajo petición todos los datos.
Un esquema del instrumento y las imágenes SLIM representativas de un pozo se muestra en la Fig. 1 A y B respectivamente. SLIM mantiene resolución subcelular (fig. 1B) sobre un área grande de modo que cada cámara en un patrón de mosaico (para más detalles sobre la medición se refieren a
Materiales y Métodos
). De las grandes imágenes de mosaico, los bordes de los distintos grupos (2-3 compone de células en t = 0 horas) fueron trazadas en cada punto de tiempo y el área de superficie y la masa seca total se midieron (ver la película S1 durante un lapso de tiempo del campo de visión para todos los grupos). De esta manera, podemos analizar tanto las tendencias generales de crecimiento de cada grupo y la heterogeneidad a nivel de agrupación dentro de cada población. Cabe señalar que este tipo de medición es actualmente imposible de realizar con cualquier ensayo de proliferación existente.
(A) Representación esquemática de la configuración experimental. Un microscopio de contraste de fase comercial totalmente automatizada equipada con la parte superior etapa de control de la incubación y x, y, z capacidades de escaneo se utiliza para explorar un área de 1,5 mm x 1,2 mm en cada pocillo de una 2-así deslizar cada 30 minutos. Los componentes de la línea de puntos comprenden el SLIM módulo adicional: Fourier del objetivo 1 (FL1) proyecta el plano de la pupila del microscopio de contraste de fases en un cristal líquido de fase del modulador (LCPM), que proporciona control sobre el retraso de fase entre la dispersa y ONU dispersión de luz; Fourier lente 2 proyecta la imagen modulada en fase en un CCD. Todos los componentes del instrumento se sincronizaron utilizando la CPU. (B) Imágenes representativas de un campo de vista escaneada en una de las cámaras a las 0 horas y las 94 horas, en la zona de la línea amarilla discontinua se agranda y se muestran en cada punto de tiempo (barra amarilla escala es de 50 micras). (C) una superficie normalizada media para los clústeres de cada grupo en los plazos marcados. (D) la masa normalizada media para los clústeres de cada grupo en los plazos marcados. (C-D) marcadores cuadrados indican media, línea central es la mediana, la parte superior de la caja es de 25
ª línea de percentil, inferior está 75
ª línea de percentil, bigotes indican 5
º y 95
º percentiles , la significación fue probada usando una prueba t no-emparejado, o: p & gt; 0,05, *: p & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***: p & lt; 0,001. (E) Medición de ensayo de WST-1 proliferación a las 72 horas.
Los cambios temporales en la misa y la zona
En primer lugar, establecemos las capacidades de Slim como un ensayo de proliferación mediante la medición de los efectos del estradiol sobre los cambios relativos en crecimiento, que es cualitativamente similar a la información proporcionada por ensayos convencionales. Las cantidades de interés aquí son las cantidades relativas de crecimiento en tamaño y masa, no los valores absolutos. Para realizar este análisis, el área de la masa y la superficie de cada grupo se normaliza con respecto a su tamaño inicial, M (t) /M (t = 0) y la zona (t) /Área (t = 0), respectivamente. El área normalizada y la masa de todos los grupos analizados (por lo menos 5 por grupo) fueron separados en contenedores de 15 horas como se muestra en las Figs. 1C y 1D. No hay diferencia significativa en el área normalizada en cada punto de tiempo. Por el contrario, las diferencias en la masa normalizada son detectables en todo el periodo de medición (Fig. 1 C-D). Esto pone de relieve la importancia de la medición de la masa en lugar de simplemente el área de un clúster. Por otra parte, ICI tratamiento hace efecto rápidamente a medida que el grupo E2 exhibe mayor crecimiento relativo de la masa dentro de 30 horas. Una diferencia entre el E2 + ICI y el grupo control puede ser detectado por 60 horas. Hay que señalar que mientras que los ensayos de proliferación actuales se basan en el uso de un gran número de células, las mediciones SLIM se realizaron en el ámbito de la agrupación individual.
Comparación con Ensayo Colorimétrico
Para la comparación, las mediciones de una WST-1 de ensayo tomada después de 72 horas de tratamiento se muestran en la Fig. 1E. Se puede observar que existe una buena concordancia cualitativa entre los datos de WST-1, que indican indirectamente la tasa de proliferación, y las mediciones de área normalizada después de 75 horas. Sin embargo, la masa normalizada es mayor en el control que el grupo E2 + ICI después de 60 horas. Estas diferencias son probablemente debido a que el ensayo de WST-1 simplemente mide la reducción de un colorante de tetrazolio fuera de la célula. Aunque el nivel de esta reducción está relacionada con la actividad metabólica de las células y refleja el número de células viables en la población, no es una medida directa de la masa o el tamaño celular. Además, dichos ensayos se limitan a proporcionar un número para una población a granel y no proporcionan ninguna forma práctica para estudiar la heterogeneidad en la población. Con el fin de ilustrar mejor la variabilidad medida en los datos de la masa normalizada y el área para los clústeres individuales se muestran en la Fig. 2.
(A) Masa normalizada frente a tiempo para todos los grupos que fueron analizadas. (B) Área normalizada en función del tiempo para todos los grupos. (A-B) Las líneas de puntos muestran los datos de clúster individuales y las líneas continuas muestran los datos promediados. Las líneas discontinuas indican que la diferencia entre los grupos se vuelve significativa.
Los cambios temporales en la tasa de crecimiento de masa
Además de proporcionar una comprensión cuantitativa de cómo diversos tratamientos afectan los cambios relativos en tamaño y masa , Slim también puede medir los cambios en la tasa de crecimiento de los pequeños grupos de células en función del tiempo o tamaño. La medición de la tasa de crecimiento con alta sensibilidad es más informativo que la simple medición de los cambios relativos en la masa, ya que proporciona una comprensión de cuando los tratamientos comienzan a hacer efecto y cuánto tiempo el efecto persiste. mapas de densidad de masa seca de grupos típicos de cada grupo en el tiempo se muestran en la Fig. 3A (ver la película S2 para). Higo. 3B muestra la tasa de crecimiento de racimos de cada grupo frente al tiempo. Una diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre los tres grupos se puede detectar tan pronto como 15 horas (5 horas después de que se administra el tratamiento ICI), que es de 15 horas antes que el cambio detectable tanto en la zona y de la masa. Además, aunque la masa normalizada es mayor para el grupo E2 + ICI que el control hasta 60 horas, la tasa de crecimiento del control excede el grupo E2 + ICI por 45 horas. También se puede ver que a pesar de las agrupaciones en el grupo E2 lograr masas y áreas relativas mucho mayor que el control, no hay ninguna diferencia significativa en las tasas de crecimiento entre los dos grupos después de 90 horas.
(A) en seco mapas de densidad en masa de grupos representativos de cada grupo de células MCF-7 de cáncer de mama en cada 22 horas. Los colores indican la densidad de masa seca en cada píxel como se muestra en la barra de colores. La barra amarilla escala es de 50 micras. Tenga en cuenta que en el grupo E2 + ICI, ICI se añadió a cada muestra en 10 horas. tasa de crecimiento (B) en cada grupo de clústeres en el período de tiempo que se muestra. tasa de crecimiento (C) Cluster en cada grupo como una función de la masa normalizada. Las líneas continuas se muestran como una guía para el ojo para determinar cómo la tasa de crecimiento está cambiando como una función de crecimiento de la masa. (B-C) marcadores cuadrados indican media, línea central es la mediana, la parte superior de la caja es de 25
ª línea de percentil, inferior está 75
ª línea de percentil, bigotes indican 5
º y 95
º percentiles , la significación fue probada usando una prueba t no-emparejado, o: p & gt; 0,05, *: p & lt; 0,05, **: p & lt; 0,01, ***:. p & lt; 0,001
Por el trazado de la tasa de crecimiento como una función de la masa normalizada (Fig. 3C) la tendencia de crecimiento (exponencial o lineal) de los grupos se puede determinar. Se puede observar que la tasa de crecimiento media de grupos en los grupos E2 y Veh continúa aumentando hasta que se consigue un aumento de 4 veces en masa, después de lo cual la tasa de crecimiento es estable o disminuye. Esta tendencia implica que para aproximadamente dos duplicaciones de masa ambos grupos exhiben crecimiento exponencial, después de lo cual el crecimiento es lineal. En contraste, el grupo E2 + ICI exhibe crecimiento exponencial (tendencia lineal en la Fig. 3C) hasta que se consigue un aumento de 2 veces en masa, después de lo cual el crecimiento es lineal (curva constante en la Fig. 3C). Es importante señalar aquí que una duplicación de la masa no corresponde necesariamente a un ciclo celular completo como el estrógeno y la ICI son conocidos por resultar en cambios en la forma de una célula progresa a través del ciclo celular, es decir, el tiempo de duplicación y tamaño y división tanto puede verse afectada.
Efectos del estradiol en tamaño de celda y la duplicación de Tiempo,
para determinar cómo los cambios en el nivel de células individuales contribuyen a los cambios mensurables en el tamaño relativo, la masa y las tasas de crecimiento , que mide la duplicación de cambio de tiempo y el porcentaje en el tamaño celular media para células individuales que componen los grupos (Fig. 4). El tiempo de duplicación se calcula simplemente como, donde
t
f
es el último punto de tiempo,
t
0
es el punto inicial de tiempo, y
N
celular (t)
es el recuento de células en el momento
t
. Se encontró que los tiempos de duplicación para el grupo E2 a ser significativamente menor que ambos grupos de E2 + ICI Veh y (Fig. 4A). Estos datos muestran que el estradiol induce células se dividan en casi el doble de la tasa del grupo de control y que el tratamiento con ICI invierte casi por completo este efecto. En línea con los estudios previamente reportados, encontramos que los estrógenos aceleran células a través del ciclo celular, resultando en un aumento en la proliferación celular. Es de destacar que el efecto de ICI en el aumento del tiempo de duplicación celular no implica que el ciclo celular se devuelve a las condiciones normales pero más probablemente es el resultado de las células que pasan una mayor cantidad de tiempo en una fase específica del ciclo celular.
(a) tiempo de duplicación en cada grupo, el tiempo de duplicación medio se reduce en 12 horas en el grupo E2 en comparación con los grupos de Veh y E2 + ICI, lo que indica que la adición de ICI devuelve el tiempo de duplicación para controlar los niveles. (B) Porcentaje de cambio en la masa celular media durante el periodo de medición para cada grupo. Una disminución significativa en la masa celular se observa tanto en el E2 y grupos E2 + ICI en comparación con el control. (C) Medido tiempo frente a cambio en la masa celular media para cada grupo que se midió la duplicación, estos dos parámetros se puede utilizar para separar los tres grupos completamente y puede servir como una firma crecimiento.
The cambio en la masa celular medio en el tiempo se calculó dividiendo la masa total de cada grupo por el número de células en el cluster. La figura 4B muestra el porcentaje de cambio en la masa celular media entre los puntos inicial y final de tiempo para cada clúster. Los resultados indican una disminución significativa en la masa celular media en el tiempo en las células E2 y E2 + ICI en comparación con el control. Esta disminución de la masa celular y la duplicación de tiempo muestran que en comparación con el control, los resultados de estrógeno en las células en división, más rápido más pequeñas, y que la adición de los resultados de ICI en veces más tiempo de duplicación junto con las células más pequeñas. Las células más pequeñas en los grupos de E2 + ICI implican que aunque ha vuelto el tiempo de duplicación para controlar los niveles, ICI está afectando a la actividad y la capacidad de crecer normalmente metabólica de las células. Como se muestra en la figura 4C, el tiempo de duplicación y el cambio en la masa celular media proporcionan una "firma crecimiento" fiable para cada grupo y sugieren que los niveles de expresión del receptor de estrógeno o la presencia de un modulador de ER pueden evaluarse simplemente mediante el examen de estos dos parámetros. Dado que los ensayos actuales no proporcionan una medición directa del crecimiento celular, estas son las primeras mediciones, realizadas de forma continua en una población, que esclarecer la manera como el estrógeno afecta las células MCF-7 cinética de crecimiento en el nivel de células individuales.
Discusión
Los resultados mostrados aquí establecen que las mediciones SLIM de densidad de masa seca se pueden utilizar como ensayos de proliferación de alta sensibilidad. Las principales ventajas sobre los métodos existentes son que SLIM puede detectar cambios en la cinética de crecimiento en menor número de células, en menos tiempo, y puede ser utilizado para estudiar las diferencias dentro de una población en lugar de sólo proporcionar un número mayor para el crecimiento de un cultivo. Como comparación, el ensayo de WST-1 trabaja con el número de células en 10
3-10
5 rango [27] mientras que SLIM es sensible a los cambios en la proliferación de incluso una sola célula. Además, SLIM proporciona la capacidad de analizar la tasa de crecimiento de las células individuales y grupos en función de su masa, proporcionando información sobre el mecanismo de regulación del crecimiento (por ejemplo, si se están utilizando un tamaño de celda o puesto de control de edad) [35]. Esta información es inaccesible a cualquier ensayo de proliferación existente. Este sistema se puede utilizar fácilmente para medir la cinética de crecimiento y los efectos fenotípicos de cualquier tipo de célula y el tratamiento.
Nuestros resultados también demuestran que la medición de crecimiento en el nivel celular y el grupo no sólo ofrece ventajas en términos de mejora de la sensibilidad y redujo tamaño de las muestras, sino que también aporta información adicional que no es accesible por los métodos existentes. En particular, se muestra la cinética y la modalidad de acción de E2 en las células MCF-7. De hecho MCF-7 bajo la influencia de E2, se dividen más rápidamente y alcanzar masas más bajas, lo que resulta en un aumento del número de células que son en promedio más pequeño. Debido a el tiempo de duplicación reducida, esto todavía da como resultado un aumento global de la masa total de E2 en comparación con el grupo control. Para las células cultivadas en E2 y posteriormente tratados con ICI los tiempos de duplicación devueltos a los encontrados en el control, sin embargo, la reducción en el tamaño celular fue aún mayor que en el grupo control.
Los efectos de E2 y anti-estrógenos en la progresión del ciclo celular han sido previamente estudiado en detalle [11], [15], [36], [37]. Ambos efectos rápidos y transitorios se han observado debido a la actividad funcional tanto en el núcleo (efectos genómicos) y el compartimiento de extranuclear (efectos no genómicos) [38]. Los efectos rápidos sobre el crecimiento son claramente observable en nuestros datos como las diferencias en la tasa de crecimiento entre el E2 y Veh expusieron células son observables después de 10 horas (Fig. S1) y se pueden atribuir a la activación temprana de genes relacionados con el metabolismo [39 ]. Después de la adición de ICI, un antagonista de ER pura, las diferencias en la tasa de crecimiento entre los grupos E2 y E2 + ICI comienzan a aparecer con el tiempo (Fig. 3B). Los efectos transitorios de E2 + ICI también se manifiestan en la forma en que cambia la tasa de crecimiento en función del aumento de tamaño de las células (Fig. 3C), una clara ruptura en la tasa de crecimiento se pueden observar cuando los racimos ICI aproximadamente el doble de tamaño.
Los estrógenos son conocidos para activar cascadas de transducción de genes que regulan muchos -tanto positiva como negativa, que juegan un papel clave en la proliferación celular y el metabolismo [10] - [15], [39]. También se ha demostrado que los estrógenos hacen que las células que no ciclan (G
0 fase) para entrar en el ciclo celular y a progresar rápidamente a través de la G
1 a la fase S [11] [15], [37, ]. Esta rápida progresión a través del ciclo celular en cuenta tanto la disminución del tiempo de duplicación y la reducción de la masa celular promedio observado en el grupo E2 (Fig. 4). Por otra parte, ICI se ha demostrado que bloquear las células MCF-7 en el G0-G
1 fase [15], [28], [37]. Esta acción inhibidora sobre la progresión a través de G1 se manifiesta en el aumento del tiempo de duplicación del grupo E2 + ICI en comparación con el grupo E2. ICI también afecta a la transcripción de varios genes responsables de la regulación del crecimiento en todas las fases del ciclo celular. La regulación a la baja de los genes conocidos para ser responsable de la proliferación en combinación con el aumento del tiempo pasado en G1 es probable responsable de la reducción en el tamaño de las células observada en el grupo E2 + ICI [15].
Como en el caso del receptor de estrógeno, la proliferación celular también se controla a través de la activación y modulación de cascadas de señalización de regulación por factores de crecimiento; medir el crecimiento a nivel celular tiene el potencial de reducir la brecha entre el conocimiento molecular del crecimiento del cáncer y el crecimiento tumoral real. Por lo tanto, es de gran interés para combinar estas medidas de crecimiento con marcadores de fluorescencia para la fase del ciclo celular (como se hizo previamente para U2OS células [31]) o por otras proteínas que se sabe que juegan un papel clave en la regulación de la proliferación. La medición de los cambios en la cinética de crecimiento como una función del ciclo celular o, más específicamente activaciones de genes, permitirá una mejor comprensión de la acción particular de un compuesto /fármaco sobre la progresión del ciclo celular.
En suma, tenemos demostrado un nuevo ensayo de proliferación de alta sensibilidad para aplicaciones de cribado de fármacos. Aunque nos hemos centrado en un sistema de células modelo específico aquí, la configuración experimental se aplica sin alteración de otros tipos de células y tratamientos. Además de medir la cinética de crecimiento, nuestro método también proporciona simultáneamente información sobre la morfología celular y la motilidad [40], y también se puede combinar fácilmente con otras modalidades de microscopía. Un objeto de estudio en el futuro será entender y caracterizar las diferencias morfológicas que surgen como resultado de la modulación de la sala de emergencia (ver la película S1 y S2). Los conocimientos biológicos proporcionados por las mediciones SLIM en combinación con otros ensayos moleculares, sin duda, mejorar nuestra comprensión del crecimiento de células cancerosas en general, y tienen el potencial de conducir a mejoras en el diseño de fármacos, la caracterización y la eficacia terapéutica.
Materiales Métodos y
Cell Cultura y
disponibles comercialmente células MCF-7 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en MEM (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) suplementado con 5% de suero de ternero (Hyclone, Logan, UT), 100 g /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), y 25 g /ml de gentamicina (Invitrogen). Las células fueron sembradas en MEM libre de rojo fenol que contiene carbón dextrano de suero de ternero tratado con 5% incubar durante 4 días. Dos portaobjetos de cámara (Lab-Tek) con el vidrio cubreobjetos de fondo se utilizaron para permitir la formación de imágenes de lado a lado del control y las muestras tratadas. El medio se cambió en días 2 y 4 antes del tratamiento con el vehículo de control o tratamientos de ligando (Estradiol (E2, 10 nM) y ICI 182.780 (ICI fulvestrant, 1 M)). Para las mediciones colorimétricas, se utilizó un WST1-ensayo (Roche, Basilea, Suiza) y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas BioRad 680.
Durante estas pruebas se mantuvieron las células a 37 ° C y en una atmósfera de CO2 al 5% con una incubadora y el inserto con el calentamiento. Cada pocillo se escaneó cada 30 minutos en un patrón de 4 × 4-azulejo con un Zeiss Plan-CE Neofluar 10 × /0,3 PH 1 objetivo proporcionar un campo visual total de 1,55 × 1,16 mm
2. Un z-pila de 12 rebanadas (48 micras) se registró en cada posición. El tiempo de exposición fue de 15 ms para cada imagen a plena potencia de la lámpara (3.200 K, o 10,7 V). Para cada experimento, un pocillo se dejó sin tratar para servir como un control de la población y el otro bien se trató con o bien el E2 o condición E2 + ICI. Cada condición se mide a lo largo de control con sus dos veces.
Imaging
imágenes se realizó mediante microscopía espacial interferencia de la luz (SLIM) [30], [41]. SLIM es una modalidad de interferometría óptica con luz blanca diseñada como un módulo adicional de un microscopio de contraste de fase comercial. En resumen, SLIM opera mediante la proyección de la focal de un objetivo de contraste de fase en un modulador de fase de cristal líquido (LCPM). El LCPM está calibrado para cambiar precisamente la fase de la luz dispersada por la muestra en relación con la luz dispersada por las Naciones Unidas. mapas de intensidad se registran a los cambios de fase de cero, π /2, π, y 3π /2.
La configuración SLIM utilizada en este estudio se basa en un Observador Z1 Zeiss Axio (catálogo Zeiss#431007901000) motorizado invertida investigación microscopio de formación de imágenes. La base del microscopio está equipado con una unidad de enfoque motorizado (paso mínimo ancho de 10 nm). Los objetivos utilizados para este estudio es un Zeiss Plan-CE Neofluar 10 × /0,3 PH 1 M27. La imagen intermedia después de la lente objetivo y el tubo se dirige a la izquierda de puerto del microscopio donde se une el módulo de SLIM.