Extracto
El cáncer de próstata es un grupo heterogéneo de enfermedades y hay una necesidad de métodos más eficientes y específicas de tratamiento. En este estudio, el potencial de la técnica de datos de expresión génica y la interferencia de ARN se combinaron para avanzar futuras terapéutica del cáncer de próstata personalizados. Para distinguir los más prometedores
in vivo
prevalidated objetivos de medicamentos de cáncer de próstata, un análisis bioinformático se llevó a cabo utilizando los datos de expresión de genes en todo el genoma de 9873 muestras de tejido humano. En total, se seleccionaron 295 genes para estudios adicionales funcionales en células de cáncer de próstata cultivadas debido a su alta expresión de mRNA en la próstata, cáncer de próstata o en muestras de cáncer de próstata metastásico. En segundo lugar, ensayo de viabilidad celular basado RNAi se realizó en células de cáncer de próstata LNCaP y VCAP. Con base en los resultados de siRNA, los patrones de expresión génica en tejidos humanos y la novedad, la función del retículo endoplásmico objetivos asociados
AIM1
,
ERGIC1
y
TMED3
, así como la regulación de la mitosis
se seleccionaron TPX2 Opiniones de validación adicional.
AIM1
,
ERGIC1
, y
TPX2
, se mostró a ser altamente expresado sobre todo en tejidos de cáncer de próstata, y la expresión de ARNm de alta
ERGIC1
y
TMED3 servicios asociados con
AR
y
ERG
oncogén expresión.
ERGIC1
silenciamiento regulado específicamente la proliferación de
ERG
oncogén células de cáncer de próstata positivas e inhibió la expresión de ARNm de ERG en estas células, lo que indica que se trata de un objetivo de drogas potentes en ERG subgrupo positivo de los cánceres de próstata.
TPX2
expresión asociada con el fracaso de PSA y
TPX2
silenciamiento de la expresión de PSA reducido, lo que indica que TPX2 regula la señalización mediada por receptor de andrógenos. En conclusión, el uso de técnicas de RNAi combinatoria de microarrays y cedió en un gran número de potenciales nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas, para el desarrollo futuro de los enfoques dirigidos y personalizados para el manejo del cáncer de próstata
Visto:. Vainio P, JP Mpindi , Kohonen P, Fey V, Mirtti T, Alanen KA, et al. (2012) de Alto Rendimiento Transcriptomic y Análisis de ARNi Identifica
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
y
TPX2
como dianas farmacológicas potenciales en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (6): e39801. doi: 10.1371 /journal.pone.0039801
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2011; Aceptado: 31-may de 2012; Publicado: 28 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Vainio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha sido apoyado por Marie Curie Canceromics (MEXT-CT-2003-2728), proyecto de la UE-PRIMA (contrato#LSHC-CT-204 a 504.587), proyecto de colaboración tiempo, las organizaciones del cáncer de Finlandia, la Fundación Sigrid Juselius, Academia de Finlandia y Escuela de Graduados de descubrimiento de fármacos en la Universidad de Turku. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más comúnmente diagnosticado y la segunda causa más común de mortalidad por cáncer en la población masculina occidental [1]. Sin embargo, los cánceres de próstata forman un grupo heterogéneo de enfermedades y algunos hombres todavía son diagnosticados con la enfermedad de alto grado y finalmente fallan tratamiento [1], [2]. A pesar de la heterogeneidad fenotípica y molecular de la enfermedad existe una falta de biomarcadores de pronóstico robustos y específicos para distinguir entre cánceres indolentes y agresivos en fases tempranas de la enfermedad. Además, debido a la falta de biomarcadores de pronóstico y terapéuticas eficientes, así como agentes terapéuticos específicos, la gestión clínica está todavía lejos de personalizado.
Además de regular el desarrollo y mantenimiento de la próstata, los andrógenos apoyar el desarrollo y el crecimiento de la mayoría de los cánceres de próstata primarios y receptor de andrógenos (AR) desempeña el papel de un oncogén en el cáncer de próstata [3] - [7]. En consecuencia, la ablación de andrógenos es actualmente el tratamiento de elección para el cáncer de próstata avanzado. Sin embargo, aunque el bloqueo de andrógenos inicialmente se traduce en una buena respuesta al tratamiento, casi nunca es curativa [2]. las células cancerosas independientes de andrógenos normalmente comienzan a aparecer durante el tratamiento, llevando eventualmente a la recurrente, refractario a las hormonas de la enfermedad [8], [9]. Además de las alteraciones que prevalecen en la expresión de AR y la función, aproximadamente la mitad de las muestras de cáncer de próstata puerto un gen de fusión oncogénica combinando regulada por andrógenos transmembrana serina proteasa 2 (
TMPRSS2
) con oncogénicos factores de transcripción ETS [10]. Con mayor frecuencia, la pareja de fusión es
ERG gratis (v-ets virus de la eritroblastosis E26 homólogo de oncogén, aviar), seguido por
ETV1 gratis (ets variante 1),
ETV4
, y
ETV5
[11] - [13]. ERG mRNA no se expresa en tejidos de la próstata sanos, pero como resultado de la
TMPRSS2-ERG
fusión del gen temprano en la carcinogénesis, un aumento significativo en los niveles de transcripción ERG se puede detectar en los cánceres de próstata. ETS fusiones de genes promueven múltiples vías de señalización asociadas con la formación y progresión del cáncer, y ectópico
ERG
oncogén expresión se ha asociado con una firma específica molecular en el cáncer de próstata [14] - [19]. Aunque
activación mediada por ERG
procesos oncogénicos pueden ser excluidas en el cáncer de próstata avanzado, expresión de la hormona regulada de
ERG
se ha descrito a persistir también en el cáncer de próstata resistente a la castración, que apoya la importancia de este reordenamiento también en la enfermedad avanzada [15], [20], [21]. Tomados en conjunto, fusiones ETS son alteraciones moleculares clave que impulsan el desarrollo y la progresión de una clase distinta de los cánceres de próstata, y por lo tanto podrían beneficiarse de la terapia dirigida.
En los últimos años las técnicas genéticas moleculares avanzados combinados con el desarrollo de análisis bioinformático novela herramientas han ofrecido formas eficientes para examinar los perfiles de expresión de genes del tumor, lo que facilita el descubrimiento de biomarcadores, así como la identificación de posibles nuevas dianas farmacológicas. perfiles de expresión génica permite mejorar el diagnóstico y la estadificación de la enfermedad, proporciona información sobre la respuesta al tratamiento y conduce a efectos secundarios reducidos [22], [23]. la interferencia de ARN técnica (RNAi) permite la exploración del efecto funcional de genes individuales en las características celulares de cáncer, como el crecimiento y la supervivencia, avanzando aún más el desarrollo de terapias dirigidas y personalizados [24] - [26]. En este estudio, el potencial de estas técnicas se combinó mediante la preselección de los genes para ensayos funcionales RNAi utilizando datos de expresión génica. Para identificar posibles vulnerabilidades presentes en los cánceres de próstata, un análisis de la expresión de ARNm bioinformático se llevó a cabo en primer lugar sobre la base de 9873 muestras de tejidos humanos, incluyendo el cáncer de próstata 349 y 147 muestras de próstata no malignos, para distinguir los genes específicos de la próstata y el cáncer de próstata de tejido. En segundo lugar, un alto rendimiento RNAi (HT) de perfiles funcionales de los
prevalidated posibles objetivos seleccionados in vivo del fármaco se lleva a cabo en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP VCAP y con el fin de identificar los genes y las vías esenciales para la proliferación de células de cáncer de próstata y la supervivencia. Los resultados pusieron de relieve el potencial de la orientación del retículo endoplasmático (ER), la oxidación, citoesqueleto de actina y la mitosis en el manejo del cáncer de próstata, y una validación adicional identificaron
AIM1 gratis (ausente en el melanoma 1),
ERGIC1 gratis ( retículo endoplasmático Golgi compartimento intermedio proteína 1),
TMED3 gratis (transmembrana emp24 dominio transporte de proteínas que contiene 3) y
TPX2 gratis (proteína de direccionamiento para Xklp2) como posibles nuevos objetivos de drogas en el cáncer de próstata.
Métodos
in silico
minería de datos
La base de datos GeneSapiens [27] se aplicó para explorar bioinformatically los niveles de expresión génica a través de 9783 muestras de tejido humano. Brevemente, GeneSapiens (http://www.genesapiens.org/) es una colección de 9873 experimentos Affymetrix microarrays. Todas las muestras se reannotated y normalizado con un algoritmo personalizado. Los datos son recogidos de diversas fuentes disponibles públicamente, incluyendo Gene Expression Omnibus y matriz-Express y abarca 175 tipos diferentes de tejidos. La media de expresión de cada gen se determinó en el cáncer de próstata (n = 349), próstata sana (n = 147), y todas las muestras de tejido normal (n
=
1476). Se utilizaron los datos de las muestras de cáncer de próstata disponibles en la base GeneSapiens también en el
in silico
análisis de co-expresión. Las anotaciones de ontología de genes funcionales se analizaron para determinar los genes co-expresada (R & gt; 0,5 y P & lt; 0,001) utilizando DAVID funcional herramienta de anotación [28] y Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, EE.UU.).
se recibieron Cell Cultura y
células de cáncer de próstata VCAP de Kenneth Pienta (Universidad de Michigan, MI) o adquiridos de la American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Suecia) y crecido en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se recibieron las células LNCaP del Dr. Marco Cecchini (Universidad de Berna, Suiza) y se mantuvieron en T-mediano (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC-3, las células DU145 y MDA-PCa-2b se adquirieron de la American Type Culture Collection (LGC Promochem AB), y las células 22Rv1 de Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Se recibieron las células epiteliales de la próstata EP156T no malignas del Dr. Varda Rotter (Instituto de Ciencia Weizmann, Rehovot, Israel) y RWPE-1 en las células adquiridos de la American Type Culture Collection (LGC Promochem AB). las células epiteliales de la próstata primarios (PREC) fueron adquiridos de Lonza (Lonza Group Ltd, Basilea, Suiza). LNCaPs independientes de andrógenos y sus homólogos parentales fueron recibidos por el Dr. Zoran Culig (Universidad Médica de Innsbruck, Austria) y se cultivaron en suero bovino fetal RPMI-1640 (Invitrogen) que contiene carbón despojado o normal, respectivamente. andrógeno sintético R1881 fue adquirido de PerkinElmer.
genes knock-down El uso de ARN de interferencia
Antes de la detección, el número de células se ajustó para ambas células LNCaP VCAP y por separado para asegurar que la proliferación celular se mantuvo en forma lineal fase-exponencial durante todo el experimento. Para los estudios de ARNi, cuatro siRNAs por gen (HP genómica, Qiagen) se sembraron en placas de 384 pocillos (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania), seguido de la adición del agente de transfección (reactivo de lípidos siLentFect; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en medio Opti-MEM (Invitrogen) y una cantidad apropiada de células (1500-2000 por pocillo), utilizando el manejo de líquido robot automatizado (Hamilton) y dispensador de líquido (ThermoFisher). La concentración de siRNA final fue 13 nM. De AllStars control negativo (codificado siRNA, Qiagen) y lípidos solamente se utilizaron como controles negativos, siRNAs contra el
KIF11 gratis (miembro de la familia kinesin 11; SI02653770) y
Plk1 gratis (polo-quinasa como 1; SI02223844) se utilizaron como controles positivos. Para los experimentos de validación células fueron transfectadas con siRNAs dos por gen (
AIM1
: SI03126704, SI03212846;
ERGIC1
: SI03164763, SI04302872;
TMED3
: SI00746711, SI00746718;
TPX2
:. SI00097188, SI00097195) como se describe más arriba en las placas apropiadas
Viabilidad celular y la apoptosis Ensayo
CellTitre-Blue (CTB) y CellTiter-Glo (CTG) celular ensayos de viabilidad (Promega), y apoptosis ApoONE (inducción de la caspasa -3 y 7 actividades) ensayo (Promega) se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante en respuesta a 48 h o tratamiento siRNA 72 h. Los resultados fueron escaneados con EnVision Multilabel lector de placas (PerkinElmer /Wallac).
Normalización y Análisis Estadístico de siRNA pantalla de resultados
Los resultados primas obtenidas de los ensayos de viabilidad celular y la apoptosis se normalizaron utilizando
B
-score [29], y siRNAs reducción de la viabilidad celular por -2 SD de la media de los controles (que corresponde a P & lt; 0,05) en al menos dos de las pantallas o la inducción de apoptosis por 3 SD (que corresponde a P & lt; 0,01) fueron considerados antiproliferativo o siRNAs golpe pro-apoptóticos.
muestras de tejido de la próstata clínico
Las 33 muestras de tumores primarios de próstata (19 ERG oncogén positivo y negativo 14 ERG) y 3 de la próstata no maligno muestras utilizadas en este estudio se han descrito anteriormente [30].
análisis cuantitativo de la transcriptasa inversa PCR
La validación de los niveles de expresión de ARNm se realizó mediante PCR cuantitativa de la transcriptasa inversa TaqMan (qRT-PCR) ( DNA microarrays Centro Finlandés, Centro de Biotecnología de la Universidad de Turku). Las muestras de ARN se extrajo con RNeasy Mini Kit (Qiagen) se transcribieron inversamente en ADNc (alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit, Applied Biosystems) y muestras de reacción de PCR se analizaron en 96 pocillos o 384 pocillos formato. RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) y la cuantificación se llevó a cabo utilizando el
método ΔΔCT con software de gestión de 1,2 RQ (Applied Biosystems). Tres muestras replicadas fueron estudiados para la detección de la expresión del ARNm diana y β-actina se utilizó como control endógeno. Los cebadores y sondas fueron diseñados y seleccionados con la ayuda de ensayo universal ProbeLibrary Design Center (Roche Diagnostics) (cuadro justificante S1).
Análisis Western Blot
lisados de células enteras se prepararon mediante lisis tampón (Tris 62,5 mM, SDS al 1%, 5%, β-mercaptoetanol 10% de glicerol, azul de bromofenol). Los anticuerpos utilizados incluyen anti-AR (1:1,000, NeoMarkers, Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA), anti-PSA (1:1,000, A0562, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), así como secundario Alexa Fluor (1: 4000, Molecular Probes, Invitrogen) anticuerpos. β-actina (1:5,000, anticuerpo de Sigma) se utilizó como control de carga. La señal se detectó utilizando Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) según las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student (*, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001) y el coeficiente de correlación de Pearson
Resultados
alta. -throughput Revisión resultados ponen de relieve el papel de retículo endoplásmico y la mitosis en los genes relacionados con la regulación del crecimiento celular del cáncer de próstata y la supervivencia
para seleccionar
in vivo
prevalidated dianas farmacológicas potenciales biomarcadores y para estudios posteriores en la próstata cultivadas las células cancerosas se utilizan los datos de expresión génica disponibles en la base de datos GeneSapiens. En total, se seleccionaron 295 de próstata y /o cáncer de próstata genes específicos basados en la expresión de alto mRNA en la próstata, cáncer de próstata o en muestras de tejido de cáncer de próstata metastásico, y una biblioteca de siRNA se construyó para los estudios funcionales (Figura 1). Para los estudios de ARNi 4 siRNAs por gen se compraron y pantallas siRNA HT basado placa se realizaron con líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y VCAP. VCAP es un modelo para TMPRSS2-ERG cáncer de próstata positivo, expresando AR de tipo salvaje, mientras que LNCaPs albergan un mutante
AR gratis (T877A) con especificidad ligando extendida. Para identificar los genes y las vías terapéuticas relevantes en la carcinogénesis de próstata, los cambios en la viabilidad celular y la inducción de la apoptosis (caspasa -3 y 7 activación) fueron estudiados como los criterios de valoración (con soporte para el cuadro S2).
Una presentación del mapa de calor la media de los niveles de expresión génica de los 295 genes (eje x) seleccionados para una mayor exploración RNAi en todos los tejidos (sanas y malignas) presentes en la base de datos GeneSapiens (eje y). La posición de cáncer de próstata (asterisco superior) y salud de la próstata (menor asterisco) se han indicado. El color ilustra el nivel de expresión en diferentes tejidos, y los valores que faltan grises. El mapa de calor se extrae basados en la agrupación jerárquica sin supervisión.
La pantalla siRNA viabilidad celular se realizó en tres repeticiones y el ensayo de la apoptosis una vez en ambas líneas celulares. Los siRNAs de control positivo de orientación principales reguladores conocidos de la progresión mitótica, así como la proliferación de células de cáncer de próstata, KIF11 y Plk1 [31], [32], fueron capaces de reducir significativamente la viabilidad celular (Figura 2A) confirmando de este modo la eficacia de transfección. Las pantallas de viabilidad celular replicar una correlación positiva (0,67 Se convierte la R & lt; 0,78 en LNCaP y 0,36 Se convierte la R & lt; 0,66 en VCAP) en ambas líneas celulares compatibles con la funcionalidad de las pantallas principales (Figura 2B y Apoyo S2 tabla).
A. Descripción general de la LNCaP normalizado y resultados de la pantalla de viabilidad celular VCAP (B-score). Los resultados de los ARNip de control positivo (KIF11 y Plk1) se indican en azul, pocillos de control negativo (negativo de AllStars revueltos siRNA y sólo tampón) en verde, y siRNAs gen diana en gris. B. Una presentación de mapa de calor de los resultados de la pantalla viabilidad celular (B-score). El ensayo se repitió tres veces, tanto en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y VCAP. El color azul indica disminución de la viabilidad celular, rojo aumento de la viabilidad celular. El mapa de calor se extrae basados en la agrupación jerárquica sin supervisión. C. La superposición entre los genes de RNAi de golpe pantalla (disminución de la viabilidad celular en respuesta a silenciar) en las líneas celulares LNCaP y VCAP. D.
in silico
análisis de co-expresión de los genes de viabilidad celular de golpe en muestras de cáncer de próstata. Los genes están organizados en el mismo orden en ambos Y y el eje x, y las correlaciones (R) entre los genes se indican con colores. El color rojo indica una correlación positiva, correlación negativa azul.
Las pantallas siRNA dado lugar a la proliferación potencial de promoción de 94 (hits en al menos dos de las pantallas de viabilidad celular) y 97 genes anti-apoptóticos en las células LNCaP. Fuera de la viabilidad celular 94 reproducido hit genes de 45 (47,9%) también fueron anti-apoptótica. En las células VCAP la tasa de éxito final fue de 35 proliferación reproducida promover y 34 genes anti-apoptóticos de golpe, 9 (25,7%) de los cuales promovió la viabilidad celular y la apoptosis protegida. El silenciamiento de genes 17 resultó en una respuesta anti-proliferativo en ambas células LNCaP y VCAP. (Figura 2B-C y el cuadro justificante S2).
El
in silico
análisis de co-expresión de los genes de la proliferación de golpe (n = 112) sugirieron tres principales subgrupos de cáncer de próstata con diferentes mecanismos de regulación del crecimiento celular. El conjunto más grande de genes tuvo un papel en ER y el aparato de Golgi, desarrollo de la glándula de la próstata, así como en la reducción de la oxidación. Los otros subgrupos de viabilidad cáncer de próstata que regulan los genes estaban involucrados en citoesqueleto de actina y la mitosis (Figura 2D).
nuevas dianas putativas del cáncer de próstata de drogas
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, y
TPX2
fueron seleccionados para una mayor validación
las pantallas de RNAi confirmaron el papel de múltiples publicado anteriormente objetivos farmacológicos cáncer de próstata como el crecimiento y la regulación de los genes de la apoptosis en el cáncer de próstata cultivadas Células. Entre otros, estos genes incluyen
CLDN3
,
CYP4F8
,
EPHX2
,
FAAH
,
FOXA1
,
MTDH
,
ODC1
,
PLA2G2A
,
PLA2G7
,
SIM2
y
UBE2C
[30], [33] -. [41] (Cuadro justificante S2): perfil
Cuatro nuevas dianas farmacológicas candidato,
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, y
TPX2
, fueron seleccionados para estudios adicionales en base a la alta expresión en el cáncer de próstata en comparación con la próstata normal y todos los demás tejidos normales incluidos en la base de datos GeneSapiens (Apoyando Figura S1), así como su novedad como reguladores de la proliferación de células de cáncer de próstata y apoptosis.
AIM1
,
TMED3
y
TPX2
estaban entre los 17 genes, el silenciamiento de que indujeron efectos antiproliferativos en células tanto VCAP y LNCaP así como la apoptosis en al menos una de las líneas celulares. El silenciamiento de
ERGIC1
efecto antiproliferativo inducida específicamente en las células positivas VCAP ERG oncogén (cuadro justificante S2).
AIM1
,
ERGIC1
y
TMED3
se co-expresa en el conjunto de genes funcionalmente anotado a ER y el aparato de Golgi y redox reacciones, mientras que
TPX2
se expresó entre los genes implicados en la mitosis (Figura 2D).
proteína AIM1 es un miembro de la superfamilia βγ-cristalino. A diferencia de otros materiales cristalinos-ß-gamma y conocidos, que se expresa específicamente en el alargamiento de células de fibra óptica que están experimentando grandes cambios en la arquitectura del citoesqueleto y la composición, AIM1 tiene un papel no-objetivo. Sin embargo, secuencia de la proteína AIM1 tiene una similitud débil con filamento o proteínas de unión a actina, lo que indica un posible papel en la gestión de la morfología y la forma [42] de la célula.
AIM1
gen se localiza en 6 q21, dentro de la región supresor de tumor putativo de melanoma humano, y la expresión AIM1 se ha demostrado que ser alterado en asociación con la supresión de tumores en un modelo de melanoma humano [43]. Sin embargo, estudios recientes indican que
AIM1
no es el principal gen supresor tumoral en del6q21 en tumores malignos de células asesinas naturales [44], [45]. Apoyando el posible papel de
AIM1
como un supresor de tumor, AIM1 metilación se ha asociado con el carcinoma nasofaríngeo y la invasión del tumor primario de cáncer de vejiga [46], [47]. Por otro lado, la expresión AIM1 se ha demostrado que ser alta en líneas celulares de cáncer resistentes a TRAIL [48].
ERGIC1 es una proteína de membrana de ciclismo que contribuye a que el tráfico de membrana y transporte selectivo de la carga entre el ER, la compartimento intermedio, y el aparato de Golgi [49], mientras que TMED3 es un constituyente de las vesículas recubiertas que están implicados en el transporte de moléculas de carga desde el RE a la función compleja y Golgi como receptores de carga secretora específica [50]. Aunque la función exacta de ERGIC1 y TMED3 en el cáncer aún no se ha dilucidado, la disfunción del Proteostasis y ER se sabe que inducen una respuesta de estrés (respuesta a proteínas desplegadas) que conducen a la apoptosis en células de cáncer [51], [52].
TPX2 se expresa exclusivamente en la proliferación de células de la transición G1 /S hasta el final de la citocinesis. La mitosis es un proceso biológico importante desregulado en el cáncer y el proceso biológico principal blanco de los fármacos citotóxicos. Curiosamente, TPX2 se sabe que está altamente expresado en diversos tejidos de cáncer, y se ha sugerido como un biomarcador para mal pronóstico [53] - [55]. Como un importante regulador de ciclo celular y una pareja de unión para Aurora A quinasa, TPX2 ha sugerido también como un objetivo potencial de drogas en múltiples tumores malignos [56] - [58]. Sin embargo, TPX2 no se ha estudiado en el cáncer de próstata previamente. Se ha sugerido que TPX2 dirigida terapéutica podría ser más eficaz que el uso de inhibidores de Aurora A quinasa debido a la naturaleza no específica de inhibidores de la quinasa convencionales [58]. Además, la combinación TPX2 y Aurora quinasa A terapias dirigidas podrían inhibir el desarrollo de resistencia a los medicamentos [59], [60].
Validación de
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, y
TPX2
expresión y siRNA inducida por objetivo silenciamiento de genes en células de la próstata cultivadas
La expresión de mRNA
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, y
TPX2
se estudió en seis cáncer de próstata (VCAP, PC-3, 2b-MDA-PCa, LNCaP, DU145 y 22Rv1) y células epiteliales de próstata tres no maligno líneas (RWPE-1, pREC, EP156T) (Figura 3A). Especialmente
ERGIC1
y
TMED3
se encontraron para ser altamente expresado en el cáncer, pero no en las líneas de células no malignas. Entre las líneas de células malignas
AIM1
,
ERGIC1
, y
TMED3
fueron más altamente expresado en VCAP, y
TPX2 Hoteles en células LNCaP. Dos siRNAs por gen, elegidos en base a la eficacia de silenciamiento objetivo, fueron seleccionados para estudios de validación (Figura 3B y Apoyo a la figura S2). Los resultados de 72 h la viabilidad celular y ensayo de apoptosis confirmaron el efecto antiproliferativo de
TMED3
y
TPX2
silenciamiento en las dos líneas celulares. Como era de esperar sobre la base de los resultados del cribado,
ERGIC1
tenían un papel específicamente en el oncogén ERG expresar la viabilidad celular VCAP. Sin embargo, aunque siRNAs AIM1 fueron capaces de disminuir la viabilidad celular VCAP, no se observaron efectos consistentes en las células LNCaP (Figura 3C). La actividad de la caspasa 3/7 se mejoró principalmente en respuesta a
TPX2
y
TMED3
silenciamiento en las células LNCaP, mientras que
TPX2 Opiniones y ERGIC1 silenciar a la apoptosis inducida en células VCAP con tanto siRNAs (Figura 3D).
A. La expresión de mRNA de los genes diana en 6 cáncer de próstata (VCAP, PC-3, MDA-PCa-2b, LNCaP, DU145 y 22Rv1) y 3 líneas celulares de próstata no malignas (RWPE-1, PREC, EP156T). Para cada gen la expresión de mRNA relativa en RWPE-1 línea celular se pone a 1. B. Validación del silenciamiento del gen diana. El nivel de ARNm de cada gen en la muestra de control se ha establecido como 100%. C. El efecto de silenciamiento del gen diana en VCAP y LNCaP viabilidad celular a 72 h punto de tiempo. D. El efecto de silenciamiento del gen diana en la inducción de la apoptosis en las células LNCaP y VCAP en 72 h punto de tiempo. Los resultados han sido comparados con los cambios inducidos siRNA revueltos y la importancia de los efectos antiproliferativos y pro-apoptóticos se han indicado. KIF11 siRNA se ha utilizado como control positivo.
AIM1
,
ERGIC1
, y
TPX2 ¿Cuáles son altamente expresado en el cáncer de próstata clínico Las muestras
Validación de genes diana patrones de expresión en muestras de próstata clínicos confirmó que AIM1, ERGIC1, y los niveles de ARNm de TPX2 fueron significativamente elevados en tejidos de cáncer de próstata (n = 33), en comparación con muestras de tejido de control no malignas (n = 3). Todas las muestras de cáncer expresan ARNm AIM1 a niveles más altos que ninguna de las muestras no malignas; mientras ERGIC1 se sobre-expresa en 94% (n = 31), y TPX2 en 64% (n = 23) de las muestras de cáncer. Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores de TMED3 patrones de expresión en células de la próstata cultivadas, TMED3 ARNm se expresó en niveles iguales en los tejidos no malignos y cáncer (Figura 4A). Para la comparación, los niveles de ARNm para la tecla de cáncer de próstata oncogenes AR y ERG también se determinaron en las mismas muestras clínicas, y los resultados se presentan como un mapa de calor en la Figura 4B. De los cuatro posibles nuevos genes diana,
ERGIC1 gratis (R = 0,51) y
TMED3 gratis (r = 0,69) los patrones de expresión correlacionó significativamente con más
AR
expresión (Figura 4C). Además, aunque ERGIC1 y TMED3 fueron altamente expresado en los dos tipos de cáncer de próstata negativo y positivo ERG, sus niveles de expresión de mRNA correlacionó positivamente con la ERG niveles de expresión en las muestras positivas ERG (P = 0,002 y P = 0,007, respectivamente) (Figura 4D). Comparación de la expresión del gen diana con parámetros clínicos reveló que
AIM1
correlacionaron significativamente (P = 0,03) con la edad joven (& lt; 60 años) (Figura 4E). Además, la alta
TPX2
expresión correlacionada con insuficiencia antígeno (PSA) específico de la próstata (P = 0,02), y se asocia con alto grado de la OMS y la edad joven (Figura 4F). Ninguna de estas asociaciones se encontraron con ERG1C1 o expresión de ARNm TMED3.
A. La expresión de mRNA de los genes diana en 33 cáncer de próstata primario y 3 muestras de tejido de próstata no malignos. La expresión significa las muestras no malignas se ha establecido como 1. B. visualización de mapa de calor de los valores de expresión relativa del mRNA del gen-sabia escalados para
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
,
TPX2
,
ERG
, y
AR Hoteles en 33 tejidos primarios de cáncer de próstata. El mapa de calor se extrae basados en la agrupación jerárquica sin supervisión de los valores de expresión. nivel de expresión relativa media en las muestras de control normales se fijó como 0. patrones C. Co-expresión entre ERGIC1 y mRNA AR, así como TMED3 y mRNA AR en 33 primarias muestras de cáncer de próstata. D. Asociación de ERGIC1 y expresión TMED3 ARNm con la expresión de ARNm ERG en los tumores de próstata primario ERG positivos (n = 19). E. expresión de mRNA relativa de
AIM1 Hoteles en muestras de cáncer de próstata primario en comparación con la edad del paciente. F. expresión de mRNA relativa de
TPX2 Hoteles en muestras de cáncer de próstata primarios en comparación con aparición de insuficiencia PSA, grado tumoral OMS y la edad del paciente.
AIM1
,
ERGIC1
,
TMED3
, y
TPX2 ¿Cuáles son todas ellas reguladas por
ERG
Oncogene y los andrógenos en células cultivadas de cáncer de próstata
Para evaluar el papel potencial del ERG y AR en la regulación de éstos crecimiento celular del cáncer de próstata promoción de los genes, el efecto de
ERG
y
AR
silenciamiento, así como la privación de andrógenos y la estimulación en el gen diana se analizó la expresión. Sorprendentemente,
ERG
silenciar de manera significativa disminución de la expresión de mRNA de los cuatro genes diana en las células VCAP (Figura 5A). Por otra parte,
AR
silenciamiento disminución de la expresión de ARNm de
AIM1 Hoteles en células LNCaP y
TPX2
tanto en las células LNCaP y VCAP, mientras que se incrementó la expresión de ARNm TMED3 (Figura 5B). Sorprendentemente, a pesar de
ERG1C1
expresión se asoció con
AR y AR
impulsado
ERG
expresión en los cánceres de próstata clínicos, no se observaron cambios significativos en la expresión de la expresión de mRNA en ERGIC1 respuesta a silenciamiento AR. A pesar de los diversos efectos de silenciamiento AR sobre la expresión del gen diana, la privación de andrógenos disminuye y el andrógeno sintético R1881 indujo la expresión de todos los genes diana en las células LNCaP en comparación con los niveles de expresión detectados en condiciones de andrógenos privado (Figura 5C). La expresión de los genes diana se estudió también en derivados LNCaP cultivadas en condiciones de ablación de andrógenos estable que imitan los tumores resistentes a la castración. Los resultados muestran un aumento significativo en la expresión en las células AIM1 ablación en comparación con las células parentales se cultivan en medio normal (Figura 5D).
A. El efecto de 48 h
ERG
silenciamiento de la expresión de los genes diana en las células VCAP. B. El efecto de 48 h
AR
de silenciamiento de la expresión de los genes diana en las células LNCaP y VCAP. C. El efecto de 24 h de privación de andrógenos y 24 h de estimulación de andrógenos secuencial (10 nM R1881) en la expresión de los genes diana en las células LNCaP. D. El nivel de expresión del ARNm diana en las células LNCaP cultivadas en medios de comunicación normal (FBS) y en (CS-FBS) medios de andrógenos ablación chargoal-pelado. E. El efecto de las 72 h
TPX2
silenciamiento de la expresión proteica de AR y PSA. β-actina se ha utilizado como control de carga. La significación estadística de los resultados en comparación con el control experimento se han indicado.
En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de los posibles objetivos de drogas novela
AIM1
,