Extracto
Antecedentes
cáncer de ovario
epitelial es el más letal de todos los tumores malignos ginecológicos, y alto grado serosa cáncer de ovario (HGSC) es el subtipo más común de cáncer de ovario. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia y tipos de mutaciones puntuales somáticas en HGSC utilizando un protocolo de detección de la mutación llamada OncoMap que emplea la tecnología de genotipado basado en la espectrometría de masas.
Metodología /Principales conclusiones
el Centro de Descubrimiento del Genoma del cáncer (CCGD) Programa en el Instituto de cáncer Dana-Farber (DFCI) se ha adaptado una plataforma de alto rendimiento del genotipo para determinar el estado de la mutación de un gran grupo de genes del cáncer conocidos. El protocolo de detección de mutaciones, denominado OncoMap se ha ampliado para detectar más de 1000 mutaciones en oncogenes en 112 (FFPE) muestras de tejido incluido en parafina fijado en formol. Se realizó OncoMap en un conjunto de 203 muestras FFPE en fase avanzada HGSC. Se aislaron ADN genómico a partir de estas muestras, y después de una serie de pruebas de control de calidad, encontramos cada una de estas muestras en la plataforma v3 OncoMap. muestras tumorales 56% (113/203) albergaban mutaciones candidatos. Sesenta y cinco muestras tenían mutaciones individuales (32%) mientras que las muestras restantes tenían ≥ 2 mutaciones (24%). 196 candidatos llamadas mutaciones se hicieron en 50 genes. Las mutaciones somáticas oncogenes más comunes se encuentran en
EGFR
,
KRAS, PDGRFα, KIT, y PIK3CA
. Otras mutaciones encontradas en los genes adicionales fueron encontrados en las frecuencias más bajas (& lt; 3%).
Conclusiones /Importancia
Análisis Sequenom utilizando OncoMap sobre el ADN extraído de las muestras de cáncer de ovario FFPE es factible y da lugar a la detección de mutaciones potencialmente druggable. La detección de mutaciones somáticas HGSC en oncogenes puede conducir a terapias adicionales para esta población de pacientes
Visto:. Matulonis UA, Hirsch M, Palescandolo E, Kim E, Liu J, van Hummelen P, et al. (2011) de Alto Rendimiento de Interrogación de mutaciones somáticas en alto grado del cáncer seroso del ovario. PLoS ONE 6 (9): e24433. doi: 10.1371 /journal.pone.0024433
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Agosto, 2011; Aceptado: 9 Agosto de 2011; Publicado: 8 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Matulonis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada por las siguientes fuentes: ovárico cáncer Programa Especializado de Excelencia en la Investigación (P50CA105009), el Fondo de cáncer de ovario Franchi Madeline, y el Consejo Ejecutivo de la Mujer del Instituto de cáncer Dana-Farber. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Dres. Hahn y Drapkin ambos sirven como consultores para y han recibido becas de investigación de Novartis Pharmaceuticals. Esto no alteró la adherencia de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses que reportan.
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es el más letal de todos los tumores malignos ginecológicos, y se necesitan nuevos tratamientos para los pacientes recién diagnosticados, así como pacientes con cáncer recurrente [1]. Dentro de cáncer epitelial de ovario, HGSC es el subtipo más común y se asocia a una reacción inicial de la quimioterapia cuando se diagnostica por primera vez. Sin embargo, la mayoría de los cánceres se repiten y vuelven cada vez más resistentes a la quimioterapia. El éxito de la quimioterapia convencional para el tratamiento de cáncer de ovario ha alcanzado una meseta, y los nuevos medios de caracterizar molecularmente y cáncer de ovario genéticamente con el fin de "personalizar" y mejorar el tratamiento se necesitan [2], [3].
mutaciones puntuales Activación de proto-oncogenes se han observado en muchos cánceres humanos, y dichas mutaciones pueden conferir 'adicción oncogén' sobre las células de cáncer pertinentes [4]. Esta dependencia oncogén proporciona una base para la orientación oncogenes activados en el tratamiento como lo demuestra el éxito de imatinib y erlotinib en cánceres que albergan
BCL-ABL
y
EGFR
alteraciones, respectivamente. Hay abundantes pruebas que ahora indica que estas mutaciones con ganancia de función no se producen al azar dentro de los oncogenes, pero en su lugar, las mutaciones que afectan a un número relativamente pequeño de codones representan la inmensa mayoría de la activación de eventos en el cáncer. Por ejemplo, los cambios de una sola base en los codones 12, 13 y 61 en
KRAS
mutaciones constituyen la mayoría de la activación de mutaciones oncogénicas [5]. Del mismo modo,
BRAF
mutaciones que afectan codón 600 constituyen & gt; 90% del melanoma
BRAF
mutaciones; cambios genéticos en un 10-12 codones adicionales representan la mayor parte de los
BRAF
mutaciones identificadas hasta la fecha [6], [7].
Para identificar estas mutaciones oncogénicas asociados con el cáncer restantes de archivo tejidos, que se han adaptado una plataforma de alto rendimiento del genotipo para determinar el estado de la mutación de un gran panel de oncogenes conocidos para el cáncer [8], [9]. Específicamente, hemos desarrollado un protocolo de detección de la mutación, denominada OncoMap, que emplea la tecnología de masa de genotipificación basados en la espectrometría de (Sequenom) para identificar mutaciones oncogénicas. La versión actual de este protocolo es capaz de detectar más de 1000 mutaciones en 112 genes mutados comúnmente en ambas muestras de tejido congelado y embebidos en parafina frescas. Este informe describe nuestra aplicación exitosa de OncoMap a una cohorte de pacientes con avanzado HGSC con el fin de identificar las mutaciones oncogénicas.
Resultados
En el análisis OncoMap inicial, el 56% (113/203) de tumores muestras albergaban candidatos mutaciones oncogénicas. Sesenta y cinco muestras tenían mutaciones individuales (32%) mientras que el resto tenía ≥2 mutaciones (24%). En total, se realizaron 196 candidatos llamadas mutaciones en 50 genes.
Los oncogenes más frecuentemente mutados fueron
EGFR gratis (9,4%),
KRAS gratis (4,5%),
PDGFRa gratis (4,5%),
KIT gratis (3,0%), y
PIK3CA gratis (3%); otros que fueron menos comúnmente mutado incluyen:
BRAF gratis (1%),
CUBN gratis (0,5%),
y las ANR gratis (2,5%). También se identificaron mutaciones en muchos otros genes en las frecuencias más bajas, incluyendo:
ABL1 gratis (2,5%),
STK11 gratis (2,5%),
EphA1 gratis (2%),
RET gratis (1,5%),
SMARCB1 gratis (1,5%),
ATM gratis (1%),
FLT3 gratis (1%),
MLL3 gratis (1%),
MYC gratis (1%),
NF-2 gratis (1%),
NOTCH1 gratis (1%),
NTRK1
(1%),
PIK3R1 gratis (1%),
robo2 gratis (1%),
APC gratis (0,5%),
FES
(0,5%),
FYN gratis (0,5%),
GATA1 gratis (0,5%),
NF1 gratis (0,5%),
NTRK3 gratis (0,5 %),
PALB2 gratis (0,5%),
PKHD1 gratis (0,5%),
PTEN gratis (0,5%),
RUNX1 gratis (0,5%) ,
SMO gratis (0,5%),
SPTAN1 gratis (0,5%), y
TSHR gratis (0,5%).
La mutación somática más común identificado involucrado el gen supresor de tumor
TP53
, que fue detectado en 24,8% de las muestras. Desde OncoMap interroga sólo un subconjunto de
TP53
mutaciones y no detecta supresión eventos, la frecuencia observada de
TP53
alteraciones de acuerdo con trabajos recientes de El Proyecto del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) [10] que ha confirmado el hallazgo de que
TP53
mutaciones son la mutación somática más común en los cánceres HGSC. Además, se identificaron mutaciones en otros genes supresores de tumores, incluyendo
RB1 gratis (3%) y
BVS gratis (3,5%).
Las mutaciones somáticas fueron validados por HME, y las siguientes fueron validados:
EGFR
,
HRAS
,
KRAS
,
ANR
,
PIK3CA
,
BRAF
,
RB1
,
TP53
,
ATM
,
CUBN
, y
FLNB
. Tabla S1 enumera las mutaciones validadas que se encuentran en nuestra cohorte de HGSC.
Discusión
Nuestro grupo ha demostrado que las mutaciones somáticas oncogenes pueden ser detectados en HGSC usando un ensayo basado en Sequenom llamada OncoMap que utiliza ADN deriva a partir de tejido FFPE. Aunque HGSC se caracteriza por cambios de número de copias de genes [11], se encontraron mutaciones de baja frecuencia en una serie de genes oncogénicos en el 56% de los cánceres en nuestra cohorte muestra de 203, y muchas de estas mutaciones son potencialmente druggable el uso de agentes biológicos novedosos. La mayoría de las mutaciones se encontraron en baja frecuencia, y las mutaciones más específicos se encuentran en menos de 5% de las muestras. Validación utilizando HME se realizó en los genes de interés, y no se encontraron varios genes importantes para ser mutado; todas las mutaciones no fueron validados debido al costo y nivel de interés. En la práctica clínica, esperamos que todas las mutaciones identificadas por perfiles OncoMap serán validados en laboratorios CLIA-aprobado.
Por lo tanto, OncoMap que utiliza la tecnología Sequenom es capaz de pantalla de bajo costo para múltiples mutaciones utilizando ADN extraído de muestras FFPE en tipos de cáncer como HGSC que tienen múltiples mutaciones presentes en baja frecuencia. Otras ventajas de OncoMap incluyen la capacidad de expandir rápidamente la biblioteca mutación "punto caliente" como mutaciones adicionales son descubiertos y nuevos agentes biológicos novedosos son probados con éxito. Limitaciones de OncoMap incluyen que sólo "punto caliente" mutaciones se localizan y que la validación de las mutaciones es necesario; otras mutaciones no incluidos en el panel OncoMap se puede perder. A pesar de todo o exoma secuenciación del genoma completo, ahora es posible en laboratorios de investigación, el uso rutinario de estas tecnologías en las muestras incluidas en parafina no es posible. Por lo tanto, OncoMap proporciona un método económico rápido, razonable para identificar las mutaciones oncogénicas en muestras humanas de cáncer
.
Las implicaciones clínicas de las mutaciones somáticas en HGSC son desconocidos y tendrán que ser investigado más a fondo. Las mutaciones somáticas en cánceres pueden conducir a la activación constitutiva de las vías que normalmente se activan por receptores de factores de crecimiento activados de señalización, y estas mutaciones pueden conducir a la inestabilidad genómica general [12]. Las alteraciones en el número de copias de genes y la expresión génica han sido ambos demostrado ser importante en el cáncer de ovario, mientras que las mutaciones se han sentido a ser menos importante [11].
Varios oncogenes mutados de interés se encuentran en nuestra cohorte de HGSC muestras probadas y analizadas con OncoMap.
EGFR
fue encontrado para albergar mutaciones en cerca de 10% de los casos, y los inhibidores de EGFR tales como erlotinib podría ponerse a prueba en este subgrupo de cánceres. En el cáncer de pulmón, estos inhibidores se usan para tratar los cánceres que albergan el exón 20 variantes, codón 719 variantes y sustituciones L858R además de otros tipos de
EGFR
mutaciones [13], [14]. Se identificaron HGSC con una variante codón 719 que fueron validados por HME. Por lo tanto, las pruebas de los inhibidores de EGFR parece justificado cuando se detectan mutaciones de EGFR. inhibidores de EGFR se han probado en el cáncer de ovario con tasas de respuesta de 10% o menos [15] - [17]; Sin embargo, ninguno de estos estudios de forma prospectiva probado para los cánceres de ovario mutaciones de EGFR, una práctica ahora se hace de forma rutinaria para el cáncer de pulmón de células no pequeñas que se ha traducido en el uso dirigido molecularmente de los inhibidores de EGFR.
EGFR
mutaciones y se analizó la expresión de forma retroactiva de Schilder et al, y se observó una respuesta parcial en 1 paciente que tenía una mutación de EGFR [17].
Nuestra tasa de
PIK3CA
mutaciones del 3% se encuentran en HGSC paralelos que se encuentran por el Centro Sanger [18]. Otros grupos han informado de tasas bajas de ambos
AKT Opiniones y
PIK3CA mutaciones
pero mayor frecuencia de amplificación de genes para
PIK3CA
[19]. Inhibidores de la vía PI3kinase actualmente están siendo estudiados en el cáncer de ovario, y la actividad de estos agentes ha sido reportado en el cáncer de ovario [20], [21]. Por ejemplo, MK2206, un inhibidor de AKT, se puso a prueba en un estudio de fase 1 en pacientes con tumores sólidos avanzados. Los 3 pacientes con cáncer de ovario que se inscribieron en este estudio demostraron una disminución de sus niveles de CA125, lo que sugiere la actividad anti-tumor de MK-2206 en el cáncer de ovario. GDC0941, un inhibidor de PI3kinase, también ha demostrado actividad en el cáncer de ovario específicamente en situaciones de
PIK3CA
amplificación. Con el desarrollo de inhibidores adicionales de la vía de PI3kinase y debido a la actividad anti-cáncer de estos agentes en el cáncer de ovario, la identificación de las aberraciones de esta vía será cada vez más importante en HGSC.
Otros genes validados de interés que se encuentra en nuestro estudio incluye
BRAF
,
KRAS
,
HRAS
, y
ANR
, y todos estos genes tienen agentes biológicos disponibles que podrían dirigirse los efectos de estas mutaciones oncogénicas.
TP53
mutaciones se encuentran comúnmente en el cáncer de ovario [22], y nuestros soportes de datos paralelos y estos datos
Este trabajo corrobora los datos del TCGA publicados recientemente [10].; futuros estudios serán necesarios para correlacionar la presencia de estas mutaciones con la actividad biológica y el pronóstico de cáncer y si estas mutaciones predecir la actividad contra el cáncer de agentes biológicos específicos. Además, la correlación de mutaciones somáticas con otras evaluaciones objetivas de la composición genética de los cánceres tales como perfiles de expresión génica y el número de copias de genes será de vital importancia para la comprensión de una imagen más completa de genética HGSC.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de los pacientes
Patología registros fueron revisados entre 1999 y 2004 de la División de Patología ginecológica en el hospital Brigham and Women de Boston MA, y la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) etapa se seleccionaron los casos de cáncer de ovario III o IV HGSC. El Dana-Farber /Centro Junta de Revisión Institucional del Cáncer de Harvard (IRB) concedió la aprobación para recoger muestras FFPE. Debido a que todas las muestras fueron identificados de-, el IRB nos concedió una exención para recoger las muestras sin el consentimiento del paciente.
FFPE muestras fueron examinadas por un patólogo oncología ginecológica (MH) que revisó los informes de patología, así como FFPE bloques de tejido y seleccionado las áreas de mayor porcentaje de cáncer que finalmente se quitó el corazón para la extracción de ADN. Los pacientes con mutaciones de la línea germinal BRCA conocida fueron excluidos en este conjunto y se están estudiando en otro conjunto de datos. Se seleccionó un total de 203 muestras.
extracción de ADN y la cuantificación
ADN genómico fue extraído de las muestras de tejido de pacientes con núcleo FFPE con Tissue Kit QIAamp FFPE de ADN (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, los núcleos se desparafinaron en xileno y se lisaron en más de desnaturalización tampón de lisis que contiene proteinasa K. El lisado de tejido se incubó a 90 ° C para revertir reticulación formalina. Usando QiaCube, el lisado se aplicó a la columna de unión al ADN y la columna se lavó en serie, y después se eluyó en 30 ul de agua destilada. El ADN genómico se cuantifica usando Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. 250 ng de ADN genómico se utilizó para el análisis.
OncoMap v3.0 se realizó en todas las muestras, y los genes y el número de mutaciones analizadas en la presente versión de la versión OncoMap se enumeran en la Tabla 1. Inicialmente, se diseñaron los cebadores que permiten la detección de mutaciones. ADN genómico derivado de un tumor se sometió a la amplificación de todo el genoma. A continuación, multiplex PCR se realizó sobre DNA genómico tumor para amplificar las regiones que albergan loci de interés, o nucleótidos de consulta ''. Después de la desnaturalización, los productos PCR fueron incubadas con oligonucleótidos que recocido inmediatamente adyacente al nucleótido de consulta, y una reacción de extensión del cebador se llevó a cabo en presencia de de terminación de cadena di-desoxinucleótidos que generan productos de ADN específicos de alelo. productos de extensión de cebadores fueron vistos en un chip especialmente diseñado y se analizaron por MALDI-TOF espectrometría de masas para determinar el estado de la mutación. Desde alelo (o mutación) de llamada depende exclusivamente de la masa del producto de extensión del cebador resultante, el ensayo de Sequenom no requiere marcaje de cebador caro fluorescencia y tiene una tasa de error muy bajo. El costo de funcionamiento exclusivamente el ensayo de mutación OncoMap es de aproximadamente $ 200 por muestra independiente del número de muestras analizadas.
Una vez que se identificaron las mutaciones, la validación se realizó en un subconjunto seleccionado de mutaciones utilizando el multibase HME química de extensión tal como se describe anteriormente [8], [9]. Los cebadores y sondas fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo Sequenom MassARRAY 3.0, aplicando los parámetros por defecto de extensión multi-base, pero con las siguientes modificaciones: el máximo nivel de entrada múltiplex ajustó a 6; máxima pase iteración de base ajustado a 200.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Las mutaciones
Validado por HME. Esta tabla muestra las mutaciones validadas que se encuentran en nuestra cohorte de HGSC. La validación se realizó por HME
doi:. 10.1371 /journal.pone.0024433.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores desean reconocer Robert T. Jones, Christina K. Van, y Christine A. Roden por su trabajo sobre los aspectos técnicos del manejo de OncoMap en estas muestras.