Extracto
El papel de neo-angiogénesis en el crecimiento del cáncer de próstata (PCA) y la metástasis está bien establecido, pero el desarrollo de inhibidores farmacológicos eficaces y no tóxicos de la angiogénesis sigue siendo una meta no cumplida. A este respecto, la orientación de la angiogénesis aberrante a través de fitoquímicos no tóxicos podría ser una estrategia atractiva angiopreventive contra PCA. La razón de ser del presente estudio fue comparar el potencial antiangiogénico de cuatro flavonolignans diastereoisómeros puros, es decir, silibina A, B silibina, isosilibina A y B isosilibina, que hemos establecido previamente como componentes biológicamente activos en el extracto de cardo de leche. Los resultados mostraron que la alimentación oral de estos flavonolignans (50 y 100 mg /kg de peso corporal) inhiben eficazmente el crecimiento de xenoinjertos de avanzada PCA DU145 humanos. análisis inmunohistoquímicos revelaron que estos flavonolignans inhiben biomarcadores tumorales angiogénesis (CD31 y nestina) y moléculas de señalización que regulan la angiogénesis (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, fosfo-Akt y HIF-1α) sin afectar negativamente a la vasija de recuento en los tejidos normales (hígado, pulmón, y riñón) de los ratones portadores de tumores. Estos flavonolignans también inhibieron la microvasos que brota de ratón aortas dorsales
ex vivo
, y la proliferación celular inducida por VEGF, la formación de tubos de tipo capilar y la invasividad de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)
in vitro
. Otros estudios en HUVEC mostraron que estos diastereoisómeros objetivo del ciclo celular, la apoptosis y la cascada de señalización inducida por VEGF. Tres ensayo de crecimiento dimensional, así como la invasión de co-cultivo y
in vitro
estudios de la angiogénesis (con células HUVEC y DU145) sugirió la eficacia diferencial de los diastereoisómeros hacia PCA y las células endoteliales. En general, estos estudios dilucidado la eficacia anti-angiogénico comparativo de flavonolignans puros de cardo de leche y sugieren su utilidad en la PCA angioprevention
Visto:. Profundo G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, M Gu, Agarwal C , et al. (2012) Eficacia de Angiopreventive flavonolignans puros de cardo de leche Extracto contra el cáncer de próstata: Alcance de VEGF-VEGFR señalización. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10.1371 /journal.pone.0034630
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 23, 2011; Aceptado: March 2, 2012; Publicado: 13 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Profundo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NCI R01 subvenciones CA102514 y CA104286. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (ACP) es el tumor maligno no cutáneo más frecuentemente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos, y es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer [1]. Las evidencias clínicas y experimentales han sugerido que los tumores humanos podrían persistir durante años como lesiones microscópicas en un estado de latencia y su posterior crecimiento depende de manera crítica de la consecución de un "fenotipo angiogénico '[2], [3], [4], [5] . 'interruptores' angiogénicos que implican la alta VEGF y receptor de VEGF (VEGFR) los niveles se han identificado y considerado responsable de PCA progresión desde el PIN de bajo grado (prostática neoplasia intraepitelial) etapa de PIN de alto grado y aún más agresiva, poco diferenciados, y andrógenos etapas malignos independientes [6]. Por otra parte, el nivel de la angiogénesis en la PCA se ha correlacionado directamente con la puntuación de Gleason, estadio tumoral, progresión, metástasis y la supervivencia [6], [7], [8]. Por lo tanto, la orientación de la angiogénesis ha sido el objeto de varias investigaciones clínicas para mejorar la calidad de vida de pacientes con cáncer [9], [10], [11]. Además, la prevención del inicio de la angiogénesis en tumores indolentes (denominado como 'angioprevention') ha sido sugerido como un enfoque novedoso y lógica para controlar el crecimiento PCA, la progresión maligna y metástasis a sitios secundarios. Se iniciaron
xenoinjertos DU145 y ratones se les administró vehículo (CMC) o 50 y 100 mg dosis /kg de peso de cada diastereoisómero. (A) El volumen del tumor se midió y se representó como una función del tiempo (días). Cada valor de las curvas es la media ± SEM de 10-12 ratones. (B-D) los tejidos de xenoinjerto se analizaron para PCNA, TUNEL y exfoliados caspasa-3 (CC3) por IHC. Los datos se muestran en los diagramas de barras es la media ± SEM de 4-5 muestras. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0.001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
tejidos de xenoinjerto de DU145 se analizaron para CD31, nestina, VEGF y VEGFR2 por IHC. Los análisis cuantitativos se realizaron utilizando Zeiss Axioscope 2 microscopio (Carl Zeiss, Alemania) y fotografías fueron capturados originalmente (a 400x) con una cámara Carl Zeiss AxioCam MRC5 con software Axiovision 4.5 Rel. Los datos se muestran en los diagramas de barras es la media ± SEM de 4-5 muestras. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.
tejidos de xenoinjerto de DU145 se analizaron para VEGFR1, HIF-1α, Akt fosforilada
Ser473 y los niveles totales de Akt por IHC. Los análisis cuantitativos se realizaron utilizando Zeiss Axioscope 2 microscopio (Carl Zeiss, Alemania) y fotografías fueron capturados originalmente (a 400x) con una cámara Carl Zeiss AxioCam MRC5 con software Axiovision 4.5 Rel. Los datos se muestran en los diagramas de barras es la media ± SEM de 4-5 muestras. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.
Acerca de hace cuatro décadas, Judah Folkman predijo por primera vez el papel potencial de los inhibidores antiangiogénicos contra cánceres sólidos, y hasta la fecha, varios inhibidores de la angiogénesis han sido probados contra muchas enfermedades malignas [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Muchos de estos inhibidores han sido ya aprobados por la FDA para su uso ya sea solo o en combinación con fármacos quimioterapéuticos del cáncer [13], [15], [16]. Por ejemplo, el anticuerpo VEGF humanizado fue aprobado contra colorrectal, cerebro, pulmón, y cáncer renal [16]. Del mismo modo, la inhibidores de tirosina quinasa sorafenib y sunitinib, que tienen como objetivo la actividad de VEGFR, han sido aprobados para su uso contra el carcinoma avanzado de células renales [16]. A pesar de que la inhibición de la angiogénesis en el cáncer, en principio, es un sonido /estrategia terapéutica preventiva, el enfoque actual de dirigirse a una sola molécula tal como VEGF o VEGFR es errónea, ya que las células cancerosas desarrollan resistencia a través de eludir estas moléculas y siguen extendiéndose redes vasculares [17 ]. Al lado de su eficacia limitada en cuanto a la mejoría en la supervivencia del paciente, estas opciones de tratamiento son muy caros y han demostrado niveles inaceptables de toxicidad [18], [19]. Por lo tanto, racionalizamos la necesidad de identificar los agentes naturales no tóxicas con amplio espectro de eficacia anti-angiogénico; y en este sentido, en el presente estudio, nos centramos en la eficacia anti-angiogénico de cuatro diastereoisómeros puros a partir de cardo de leche (
Silybum
) extraer, a saber, el silybin A, B silibina, isosilibina A y B. isosilibina estos diastereoisómeros son flavonolignans con un resto de flavonoides idénticas y sólo se diferencian en sus configuraciones sobre el resto de los lignanos, y sus propiedades químicas y biológicas se han detallado anteriormente [20], [21], [22], [23], [24]. Aquí, por primera vez, se analizó la eficacia de estos angiopreventive flavonolignans en PCA modelo de xenoinjerto y varios
ex vivo
,
in vivo
y
in vitro
ensayos de angiogénesis.
(a-B) pulmones, el hígado y los riñones de cada ratón se recogieron y analizaron para la inmunorreactividad de CD31, así como para los análisis histopatológicos. Los análisis cuantitativos se realizaron utilizando Zeiss Axioscope 2 microscopio (Carl Zeiss, Alemania) y fotografías fueron capturados originalmente (a 400x) con una cámara Carl Zeiss AxioCam MRC5 con software Axiovision 4.5 Rel. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B.
flavonolignans (A) inhibe la angiogénesis
ex vivo. aortas de ratones se sembraron en matrigel y se trataron con flavonolignans. Las flechas en la ilustración marcan los vasos emergentes de las aortas. (B) flavonolignans inhiben la formación de tubo inducida por VEGF en HUVEC. HUVEC se sembraron en matrigel y efecto del tratamiento diastereoisómeros se analizó en la formación de tubo inducida por VEGF. microfotografías de red tubular representativos se muestran a 100X (panel superior). La longitud del tubo se cuantificó como se detalla en "Métodos" (panel inferior). Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0,001.
(A) HUVEC fueron inducidos con VEGF y se trata con cada flavonolignan en medio con suero al 0,5%, y se analizó el número total de células después de 24 h. (B) HUVEC se sembraron en la cámara superior con DMSO o diastereoisómero individual, mientras que el VEGF se añadió en la cámara inferior y se estudió HUVEC invasión. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0.001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
(A-B) HUVEC fueron tratados con DMSO o flavonolignan individuales y se analizó el número total de células y la distribución del ciclo celular. (C) HUVEC fueron tratados con flavonolignans, y 24 h más tarde, los lisados de células totales se prepararon y analizaron para los reguladores del ciclo celular. Los valores de densitometría se presentan a continuación son las bandas de 'factor de cambio "en comparación con el control después de cargar el control (α-tubulina) la normalización. (D) HUVEC fueron tratados con flavonolignans (en 30 mM dosis) durante 36 h y se analizó la morfología (fotomicrografías representativas se muestran a 100X), los niveles de CPARP, exfoliados caspasa 3 y 9, y las células apoptóticas porcentuales. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; *, P ≤ 0.001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.
HUVEC fueron suero de hambre durante 22 h, se trató con diastereoisómeros durante 2 horas y estimuladas con VEGF (10 ng /ml) durante 10 minutos. Total de lisados de células se prepararon y analizaron para las moléculas de señalización mencionadas. Los valores de densitometría se presentan a continuación son las bandas de 'doble cambio' en comparación con el control después de cargar el control (β-actina) la normalización.
(A) Efecto de flavonolignans (a 90 mM dosis) en los tres dimensiones se estudió el crecimiento de las células DU145 como se detalla en "Materiales y Métodos". esferoides representativos se muestran fotomicrografías a 100X y 400X. (B) En ensayo de invasión Transwell, cualquiera de las células DU145 (enchapados en la cámara inferior) o HUVEC (enchapados en la cámara superior) fueron tratados con diastereoisómeros individuales (a 30 dosis M), y se midió la capacidad de invasión de HUVEC. células DU145 (C) se trataron con diastereoisómeros individuales (al 30 dosis mu M) y se recogió el medio acondicionado. HUVEC se sembraron en matrigel junto con 0,5% de FBS o medio acondicionado a partir de diferentes grupos de tratamiento; y se analizó la formación de tubos. fotomicrografías representativas de la red tubular se muestran a 100x. Abreviaturas: A Sil: Silibina A; Sil B: Silibina B; Iso A: isosilibina A, B Iso: isosilibina B; CM: medio acondicionado; *, P ≤ 0.001; #, P ≤ 0,01.
Silibina A, B silibina, isosilibina A y isosilibina angiogénesis objetivo B en los tumores de próstata a través de la orientación moléculas de señalización en células de CaP, así como en las células endoteliales, el componente importante de la PCA microambiente.
Métodos
Línea celular y reactivos
Las células humanas DU145 PCA fueron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [25]. HUVEC eran de Lonza (Walkersville, MD) y se cultivaron en medios EBM2 con EGM-2 suplementos SingleQots. Matrigel y la cámara de invasión eran de BD Biosciences (New Bedford, MA). kit de ensayo de TUNEL fue de Promega (Madison, WI). Carboximetilcelulosa (CMC), Harris hematoxilina y anticuerpo β-actina fueron de Sigma (St. Louis, MO). kit DAB era de Vector Laboratories (Burlingame, CA). Estreptavidina y anticuerpo PCNA eran de Dako (Carpinteria, CA). Los anticuerpos para CD31, VEGF y nestin eran de Abcam (Cambridge, MA). Los anticuerpos para VEGFR1, VEGFR2, y HIF-1α [utilizados para inmunohistoquímica (IHC) análisis], así como anticuerpos para Cdk2, Cdk4, Cdc2, ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, p21, p27, Skp 2, Cdc25A y Cdc25C y suero normal de cabra eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticuerpo p27 era de Neomarkers (Fremont, CA) y el anticuerpo p21 fue de Upstate (Charlottesville, VA). Los anticuerpos que reconocen los niveles de proteína fosforilados y /o total de VEGFR1, VEGFR2, Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, exfoliados caspasa 3, exfoliados caspasa 9, y de cabra anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados con HRP eran de la célula señalización (Beverly, MA). ECL sistema de detección y anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón eran de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). VEGF era de R & amp; D (Minneapolis, MN). Silibina A, B silibina, isosilibina A y B se aislaron isosilibina (pureza & gt; 97%) a partir de extracto en polvo de los frutos de
Silybum gratis (L.) Gaertn. [Obtenido a partir de Euromed, S.A. (Barcelona, España)]. Los cromatográficas híbrido /técnicas y procedimientos para la purificación precipitative escala de gramos de estos flavonolignans ya se informó anteriormente [26].
En Vivo
tumoral Estudio de xenoinjerto
atímicos (
nu /nu
) ratones desnudos masculinos eran del NCI (Frederick, MD). El protocolo de tratamiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Colorado en Denver. Acerca de 3 × 10
6 DU145 células se suspendieron en 50 l de medio libre de suero, se mezcla con 50 l de Matrigel, y se inyectaron s.c. en el flanco derecho de cada ratón. El día después de la implantación del xenoinjerto, los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de nueve, y todos los tratamientos se realizaron por sonda oral como: los ratones del Grupo I (grupo de control de vehículo) con 200 l de 0,5% de CMC (w /v) en agua estéril; Grupos II y III ratones con 50 y 100 mg /kg de peso corporal dosis de silibina A; Grupos IV y V ratones con 50 y 100 mg de dosis /kg peso corporal de Silibina B; Los grupos VI y VII ratones con 50 y 100 mg /kg de peso corporal dosis de isosilibina A; y ratones Grupos VIII y IX con 50 y 100 mg /kg de peso corporal dosis de isosilibina B, respectivamente. Todos estos tratamientos (5 días /semana) se dan en 200 l de 0,5% de CMC. Dado que los cuatro compuestos tienen el mismo peso molecular (482,1), cada nivel de dosis fue equimolar a través de estos agentes. Una vez que el crecimiento de xenoinjertos de tumores se inició, tamaños tumorales se midieron dos veces por semana usando el volumen de pinza y el tumor digitales se calculó mediante la fórmula: 0,5236 L
1 (L
2)
2, donde L
1 es larga de diámetro, y L
2 es el diámetro corto.
IHC Análisis
Las muestras tumorales fueron procesados y siguientes métodos publicados inmuno-manchado [27], [28], [29]. Porcentaje de PCNA, TUNEL, se escindió de la caspasa 3 y células positivas HIF-1α se calculó contando el número de células teñidas positivas (marrón manchado) y el número total de células en cinco campos seleccionados arbitrariamente de cada tumor en un aumento de 400x. Microvasos manchadas de CD31 y nestina se cuantificaron en 5 (400 aumentos) microscópicos campos al azar por tumor. VEGF, VEGFR1, VEGFR2, pAkt
Ser473, y Akt inmunoreactividad se analizó en 5 áreas aleatorias para cada tejido tumoral y se anotó como 0+ (sin manchas), 1+ (tinción débil), 2+ (tinción moderada), 3+ (tinción fuerte), 4+ (muy fuerte tinción).
Ex Vivo
capilar Formación Ensayo
Las aortas aisladas de ratones se limpiaron, se corta en fragmentos pequeños y colocado en pozos matrigel cubierta y cubierta con otra matrigel 100 l. Después de estas aortas se cultivaron durante 24 h, el medio (completa medios HUVEC) fue reemplazado con o sin flavonolignans (30 y 60 m). Los tratamientos fueron reemplazados después de 48 h. Después de 6 días de incubación total vasos que brotan de las aortas fueron fotografiados utilizando cañón Potencia de disparo de la cámara A640 en microscopio invertido Zeiss.
Tubo de Ensayo de Formación
HUVEC (4 × 10
4) se cultivaron en 1 ml EBM2 (suplementado con 0,5% de FBS y 4 ng /ml VEGF) con varios diastereoisómeros (5-30 mM) en placas recubiertas con matrigel. Después de 9 h de incubación, la formación de estructura tubular se cuantificó mediante el cálculo de la longitud del tubo (en 100x) con microscopio invertido Zeiss utilizando cañón Potencia de disparo de la cámara A640 y software AxioVision Rel.4.7. En un experimento relacionado, las células DU145 se trataron con 30 dosis mu M de cada flavonolignan durante 72 h, y se añadió y se recogieron después de 12 h (etiquetadas como "medio acondicionado ') de medio nuevo (0,5% FBS). Los medios acondicionados se mezclaron con 0,5% de FBS complementan EBM2 medios (relación 75:25) se añadió a HUVEC y la formación del tubo se estudió como se ha descrito anteriormente.
viabilidad celular Ensayo
HUVEC fueron tratados con o sin VEGF (10 ng /ml) y diferentes concentraciones de flavonolignans (5-30 mM). Después del tratamiento deseado, se determinó el número total de células usando un hemocitómetro.
Transwell Invasion Ensayo
En este ensayo, las cámaras inferiores de Transwell se llenaron con EBM2 medio que contiene 0,5% de FBS suplementado con 4 ng /ml de VEGF, y en las cámaras superiores HUVEC (4 × 10
4) se sembraron en 500 l EBM2 (0.5% de FBS), además de 30 dosis mu M de cada flavonolignan. Después de 10 h, se cuantificaron las células invasoras, como se describe anteriormente [30], [31]. ensayo similar también se realizó con células DU145 se sembraron en la cámara inferior (medio RPMI con 0,5% de suero) y (medios EBM2 con 0,5% de suero) HUVEC en la cámara superior. En dos experimentos separados, se añadieron flavonolignans ya sea en las cámaras superiores o en las cámaras inferiores y la invasividad de HUVEC fue estudiada en cada caso.
Ciclo Celular y Apoptosis Distribución
La distribución del ciclo celular (saponina /PI tinción) y la apoptosis (anexina-PI tinción) se analizaron por FACS [32], [33].
Immunoblotting
HUVEC fueron tratados con 30 dosis mu M de cada flavonolignan con o sin estimulación VEGF, los lisados se prepararon y analizaron por el método de inmunotransferencia estándar como se describe anteriormente [33], [34]. α-tubulina y β-actina se utilizaron para confirmar la igualdad de proteínas de carga.
Tres formación de esferoides de dimensiones Ensayo
En placas de 24 pocillos, se añadieron 100 l de Matrigel. A partir de entonces, ~ 1 × 10
se añadieron 100 l de RPMI-1640 y mezcla de Matrigel (50:50) que contiene 3 DU145 células. Después de 15 min, 1 ml medio RPMI-1640 con se añadieron 10% de FBS que contienen vehículo DMSO o 90 concentración mu M de cada flavonolignan en el pozo; tratamientos fueron reemplazados cada 48 h durante 2 semanas. Al final del experimento, la formación de esferoides se contó bajo microscopio invertido Zeiss a 100x.
Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Sigma Stat versión 2.03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). La significación estadística de las diferencias entre el control y los grupos tratados se determinó mediante la prueba t y p & lt del estudiante; 0.05 valor fue considerado significativo. Una ANOVA manera seguido de la prueba de Tukey fue utilizada para comparaciones múltiples. Los autorradiogramas /bandas fueron escaneados, y la media de densidad de las bandas (donde se menciona) se determinó usando Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).
Resultados
Efecto de flavonolignans el PCA DU145 xenoinjerto crecimiento
en términos de eficacia anti-tumor, la administración oral de flavonolignans inhibe eficazmente el crecimiento de xenoinjertos de DU145 en ratones desnudos, y esto fue discernible de la tercera semana en adelante (Fig. 1A). Al final del experimento (10 semanas), silibina Un tratamiento inhibido el volumen del tumor en un 44 y 50% con 50 y 100 mg /dosis kg de peso corporal, respectivamente (p & lt; 0,05) (Fig. 1A); mientras silibina B inhibió el volumen del tumor en un 38 y 47% en mismas dosis, respectivamente (P & lt; 0,05) (Fig. 1A). En isosilibina A los ratones tratados, el volumen del tumor se inhibió en un 44 y 50% (p & lt; 0,05) (Fig. 1A), mientras que en los ratones tratados con isosilibina B el volumen del tumor fue inhibida por 46 y 67% con 50 y 100 mg /kg dosis de peso corporal, respectivamente (P & lt; 0,05) (Fig. 1A). En general, isosilibina B era más eficaz en la inhibición del crecimiento de xenoinjerto de DU145, seguido de silibina A o isosilibina A y B. Aunque silibina, estas diferencias en el efecto biológico de cada diastereoisómero no alcanzaron significación estadística; Estos resultados fueron consistentes con los reportados previamente
in vitro
estudios [21], [22].
En el momento de la necropsia, todos los animales fueron examinados para la patología general, y no observamos ningún signos de anormalidad en todos los órganos vitales examinados. Además, la administración de estos compuestos a través de una sonda oral no causó ningún cambio significativo en la ganancia patrón de consumo de la dieta o el peso corporal de los ratones (datos no presentados). Además, no se observó ningún efecto adverso en términos de comportamiento general de los animales, lo que sugiere una cantidad global de seguridad de estos compuestos.
Efecto de flavonolignans sobre la proliferación y la apoptosis en xenoinjertos DU145
El IHC análisis de muestras de tumores DU145 mostró que el tratamiento flavonolignans inhibe significativamente la inmunotinción para PCNA (un biomarcador para la proliferación celular) (Fig. 1B), pero aumenta el TUNEL y 3 células positivas-caspasa escindidos (biomarcadores para la apoptosis) (Fig. 1C y 1D ). Aunque estadísticamente significativa, el efecto de flavonolignans sobre la proliferación y biomarcadores relacionados con apoptosis fue modesto, y no podía explicar completamente el crecimiento de xenoinjertos más lento observado y cerca de la inhibición del crecimiento del 50% con el tratamiento flavonolignan (Fig. 1A). Por lo tanto, la próxima se analizaron los tejidos tumorales para el efecto flavonolignans sobre la angiogénesis, que es absolutamente necesario que los tumores crezcan más allá del tamaño de 1-2 mm [3].
Efecto de flavonolignans sobre la angiogénesis en xenoinjertos DU145
para investigar si estos flavonolignans individuales inhibieron el crecimiento de xenoinjertos mediante la supresión de la angiogénesis tumoral, teñidas con la sección del tumor CD31 (un marcador biológico para microvasos madurado) y nestina (un biomarcador de microvasos inmaduros y recién formados). Los cuatro compuestos inhibieron la densidad de los microvasos, tanto madura y de nueva formación, pero isosilibina B fue relativamente más eficaz en su efecto inhibidor sobre los microvasos nestina positivas (Fig. 2). VEGF es un factor pro-angiogénicos potente [17], [35], y el análisis IHC de las secciones tumorales mostró claramente que el tratamiento con estos diastereoisómeros disminuye tanto VEGF y la expresión de VEGFR2 en los tejidos tumorales (Fig. 2). Cabe destacar que, excepto silibina A, expresión VEGFR1 fue también disminuyó significativamente por estos agentes (Fig. 3). En general, isosilibina B fue relativamente más potente en su eficacia en VEGF, VEGFR2 y VEGFR1 expresión. HIF-1α es el factor transcripcional maestro que se estabiliza en condiciones de hipoxia en tumores y controles metabolismo del tumor, así como la expresión de factores pro-angiogénicos de crecimiento tales como VEGF [36], [37], [38]. Aunque la estabilización de HIF-1α se produce en condiciones de bajo oxígeno, su expresión también es controlado por la serina /treonina quinasa Akt [39]. Akt también juega un papel importante en varios procesos celulares, tales como la supervivencia celular, la apoptosis, la migración y el metabolismo de [40], [41]. IHC análisis de los tumores mostraron que los cuatro flavonolignans disminuir fuertemente HIF-1α y pAkt
niveles Ser473, con efecto marginal sobre la expresión de Akt total de sólo isosilibina A y B isosilibina (Fig. 3).
efecto de flavonolignans sobre la angiogénesis en los órganos objetivo no
para confirmar que los efectos anti-angiogénicos de estos flavonolignans son específicos de tejidos tumorales, se analizaron los órganos no objetivo (hígado, pulmón, riñón y para CD31) expresión para determinar la densidad de los microvasos. No hubo diferencias en la densidad de los microvasos en el hígado, pulmón y riñón entre el control y los ratones alimentados con flavonolignans puros (Fig. 4A, los datos de cuantificación CD31 no mostrados). H & amp; E también análisis mostraron que estos diastereoisómeros no tienen ningún efecto adverso sobre la histología de los órganos normales (Fig. 4B).
Efecto de flavonolignans sobre la angiogénesis en
Ex Vivo
y
in vitro
los ensayos
además, examinó la actividad antiangiogénica de los flavonolignans en
ex vivo
ensayo de formación capilar utilizando aortas dorsales del ratón. Después de seis días de cultivo en matrigel en condiciones angiogénicos, se observó un número significativo de vasos que brotan de las aortas de ratón (marcado por flechas), que fue inhibida de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento flavonolignans (Fig. 5A).
Uno de los pasos importantes durante neo-angiogénesis es la formación y fusión de tubos producidos por las células endoteliales que forman una compleja red de vasos y capilares [42], [43]. Para entender el efecto de flavonolignans en este evento biológico, se realizó un ensayo de formación de tubo. Como se muestra en la Fig. 5B, panel inferior, los cuatro compuestos inhibió significativamente la longitud del tubo inducida por VEGF en HUVEC. Como se muestra en las imágenes (Fig. 5B, panel superior), tratamiento con VEGF induce la formación de redes tubulares por HUVEC, que fue interrumpido por flavonolignan tratamientos.
Efecto de flavonolignans sobre la proliferación inducida por VEGF y Quimiotácticos Motilidad
VEGF juega un papel importante durante la neo-angiogénesis a través de su efecto mitogénico y motogénica en células endoteliales [17], [35]. En nuestros estudios, el tratamiento VEGF indujo el crecimiento HUVEC que fue fuertemente inhibida por el tratamiento flavonolignans (Fig. 6A). Tales tratamientos también inhibieron la motilidad quimiotáctica de HUVEC hacia VEGF en el ensayo de invasión Transwell (Fig. 6B). Es importante destacar que, isosilibina B era el menos eficaz en comparación con los otros diastereoisómeros, en términos de efecto inhibidor sobre la motilidad quimiotáctica de HUVEC.
Efecto de flavonolignans en la viabilidad, la progresión del ciclo celular y la apoptosis en HUVEC
para aclarar aún más el efecto biológico de estos flavonolignans sobre las células endoteliales, se analizó la viabilidad, el ciclo celular y la apoptosis en HUVEC. Como se muestra en la Fig. 7A, las cuatro flavonolignans (5-30 mM) inhibió HUVEC viabilidad de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Los análisis del ciclo celular reveló que todos los diastereoisómeros inducen arresto G1 después de 24 h de tratamiento, pero sólo silibina A, B y silibina isosilibina A también causado G2 /M detención (Fig. 7B). Después de 48 h de tratamiento, el efecto notable de silibina A, B y silibina isosilibina A en HUVEC fue la inducción de la G2 /M detención, que faltaba con el tratamiento isosilibina B (Fig. 7B). Isosilibina Un tratamiento (a 30 mM) inducida significativamente detención de la fase S después de 48 h de tratamiento, que podría estar relacionado con fuerte muerte apoptótica inducida por isosilibina A (Fig. 7B).
examinó el efecto de estos flavonolignans con diversas moléculas reguladoras del ciclo celular, a saber, las ciclinas, inhibidores de Cdks y Cdk, así como sus reguladores Skp2 y fosfatasas Cdc25. Como se muestra en la Fig. 7C, los cuatro flavonolignans disminuyó los niveles de Cdk2 y Cdk4 con efecto marginal sobre Cdc2. Estos compuestos también disminuyeron los niveles de ciclina D1, ciclina D3, ciclina A, y ciclina B1. Silibina A y isosilibina Un aumento moderado en la expresión de p27, pero se redujeron en isosilibina B (Fig. 7C). Por el contrario, la expresión de p21 se redujo en silibina A, B y silibina isosilibina A pero no por isosilibina B (Fig. 7C). Sin embargo, los cuatro diastereoisómeros disminuyó fuertemente la expresión de Skp2 y Cdc25C con ninguna o moderado efecto inhibidor en el nivel Cdc25A (Fig. 7C). Estos resultados sugieren que estos cuatro diastereoisómeros tienen pocos efectos similares (pero que difieren en la medida) y unos contrastantes sobre la expresión de moléculas reguladoras del ciclo celular.
A continuación, examinó el efecto de los flavonolignans puros (en 30 mM) sobre la apoptosis después de 36 h de tratamiento en HUVEC. Como se muestra en la Fig. 7D, isosilibina B fue el menos eficaz en términos de inducción de características morfológicas relacionados con la apoptosis (desprendimiento y redondeo), moléculas involucradas en la apoptosis (CPARP, exfoliados caspasa 3 y 9) y porcentaje de la población celular apoptótica en HUVEC señalización. Por el contrario, el silybin A, B y Silibina isosilibina Una muerte apoptótica inducida fuertemente en HUVEC (Fig. 7D).
Efecto de flavonolignans en la señalización inducida por VEGF en HUVEC
A continuación, se examinó el efecto flavonolignans en la cascada de señalización inducida por VEGF que controla la formación de la proliferación, la motilidad y el tubo en las células endoteliales [35]. tratamiento VEGF aumentó fuertemente la fosforilación VEGFR2 en Ser1175 sitio, un marcador confiable para su actividad, que fue inhibida por pre-tratamiento con flavonolignans (Fig. 8). Del mismo modo, el VEGF aumenta la fosforilación de VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR, y p70S6K. Como se muestra en la Fig. 8, excepto ERK1 /2 y mTOR, la fosforilación en otros sitios fue inhibida por estos compuestos aunque en diferente medida. En comparación con sus otros diastereoisómeros, isosilibina B fue el menos eficaz en términos de efecto sobre las moléculas de señalización inducidos por VEGF en HUVEC.
Sensibilidad diferencial de flavonolignans Hacia PCA y las células endoteliales
hallazgos anteriores [ ,,,0],20], [21], [22], [24] y el presente estudio sugiere que entre los cuatro flavonolignans puros, isosilibina B es el más eficaz en términos de eficacia contra las células de PCA pero, sorprendentemente, que tiene la menor eficacia en términos de su efecto sobre HUVEC (inhibición de la motilidad quimiotáctica o inducción de la apoptosis) (Figs. 6 y 7). Por lo tanto, se realizó una serie de experimentos para aclarar la eficacia relativa de estos cuatro diastereoisómeros contra células de CaP vis-à-vis las células endoteliales. En primer lugar, hemos analizado su efecto sobre el crecimiento tridimensional de las células DU145 en matrigel. El tratamiento con estos compuestos inhibió fuertemente el número y tamaño de esferoide formado por las células DU145 con isosilibina B ser más eficaz (Fig. 9A). A continuación, hemos realizado estudios de co-cultivo utilizando cámaras Transwell. Hacemos enchapado en HUVEC en la cámara superior, mientras que las células DU145 se cultivaron en la cámara inferior. En dos experimentos separados, las células HUVEC o DU145 se trataron con flavonolignans puros, y a partir de entonces, HUVEC invasión a través de Matrigel se estudió en cada caso. Como se muestra en la Fig. 9B, isosilibina B fue el más eficaz en la disminución de la migración HUVEC cuando se trataron las células DU145, pero fue menos eficaz cuando HUVEC fueron tratados.
Para seguir esta, se trataron las células DU145 con estos diastereoisómeros (30 mM) y recogido el medio condicionado. El potencial pro-angiogénica de los medios acondicionados se analizó en un ensayo de formación de tubo HUVEC usando. Como se muestra en la Fig. 9C, medio acondicionado a partir de células DU145 se incrementó la longitud del tubo, así como la red tubular formado por HUVEC. Los medios condicionados de las células DU145 tratadas flavonolignan disminuyeron significativamente la longitud del tubo, así como la red tubular (Fig. 9C). En este ensayo también, isosilibina B era el diastereoisómero más eficaz (Fig. 9C).