Extracto
Dos acontecimientos clave, a saber, la adherencia y la invasión, son fundamentales para la aparición de metástasis. Es importante destacar que el 37 kDa /67 kDa del receptor de laminina (LRP /LR) se ha implicado en la mejora de estos dos eventos, facilitando así la progresión del cáncer. En el estudio actual, el papel de PRL /LR en la adhesión y la invasión de cáncer de hígado se investigó (HUH-7) y células de la leucemia (K562). La citometría de flujo reveló que las células Huh-7 que se muestran niveles significativamente más altos de la superficie celular de PRL /LR en comparación con el cáncer de mama poco invasiva (MCF-7) células de control, mientras que las células K562 muestran niveles significativamente más bajos de la superficie celular de PRL /LR en comparación con las células de control MCF-7. Sin embargo, análisis de transferencia de Western y densitométrico reveló que las tres líneas celulares tumorigénicas no difirieron significativamente con respecto a los niveles totales de LRP /LR. Además, el tratamiento de las células de cáncer de hígado con anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 (0,2 mg /ml) reduce significativamente el potencial de adherencia de las células a la laminina-1 y el potencial invasivo de las células a través del Matrigel ECM-similares, mientras que la leucemia células no mostraron diferencias significativas en ambos casos. Además, los coeficientes de correlación de Pearson sugirió proporcionalidad directa entre los niveles de la superficie celular de PRL /LR y el adhesivo y el potencial invasivo de cáncer de hígado y las células de leucemia. Estos hallazgos sugieren el uso potencial de anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 como una herramienta terapéutica alternativa para el cáncer de hígado metastásico través de impedimento de la PRL /LR-interacción laminina-1 |
Visto:. Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias B, T Reusch, Knackmuß S, Little M, et al. (2014) Anti-PRL /LR específica de anticuerpos IgG1-IS18 Impide La adhesión y la invasión de las células del cáncer de hígado. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10.1371 /journal.pone.0096268
Editor: Corinne Ida Lasmezas, el Instituto Scripps de Investigación Scripps Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Noviembre 2013; Aceptado: 4 Abril 2014; Publicado: 5 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Chetty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación, la República de Sudáfrica y el Consejo de Investigación médica, la República de Sudáfrica. Las opiniones, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las del autor (s), y por lo tanto, la Fundación Nacional de Investigación no acepta ninguna responsabilidad en este sentido a la misma. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. S.F.T.W. Actualmente es una PLOS ONE Miembro del Comité Editorial. U.R., S. K. y M. L. están afiliado o empleado por Affimed Terapéutica A. G., una empresa comercial que produce anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de cáncer y enfermedades inflamatorias. Además, los anticuerpos anti-LRP /LR utilizados en este estudio para el bloqueo de la invasión y la adherencia se han descrito en dos patentes internacionales como posibles herramientas contra el cáncer terapéuticas. A saber patente, EP0984987, titulada "Un precursor del receptor de laminina soluble y métodos para inhibir sus interacciones" tiene pretensiones dirigidas a una composición farmacéutica que comprende un precursor del receptor de laminina soluble o derivado funcional o fragmento de la misma y es propiedad de la Universidad de Witwatersrand. Esta patente ha sido validado en el Reino Unido y Alemania. La segunda patente, EP1670826, es co-propiedad de la Universidad de Witwatersrand y Affimed Terapéutica AG y se titula "la actuación de anticuerpos de cadena única contra 37 kDa 67 kDa del receptor /laminina como herramientas para el diagnóstico y la terapia de las enfermedades priónicas y el cáncer, la producción y uso de los mismos ". Esta patente europea concedida fue validado en el Reino Unido, Francia, Alemania, Suiza y Austria. Las reivindicaciones se refieren a una única molécula de anticuerpo de cadena dirigido específicamente a LRP /LR para el tratamiento de enfermedades causadas por priones o cáncer. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer es una carga global que se ha demostrado que es la causa principal de muerte en los países económicamente desarrollados y la segunda causa principal de muerte en los países en vías de desarrollo económico [1]. Según el Fondo Mundial de Investigación del Cáncer (WCRF), se estima que 14,1 millones de casos de cáncer fueron diagnosticados en el año 2012 y se prevé que aproximadamente 24 millones de casos nuevos de cáncer serán diagnosticados en el año 2035, a nivel mundial (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). En la actualidad, el cáncer de pulmón ha sido identificado como el tipo de cáncer más comúnmente diagnosticado, con los dos tipos de cáncer centrales para el presente estudio es decir, cáncer de hígado y leucemia, que se clasifican como sexto y undécimo tipos más diagnosticados con cáncer, respectivamente (GLOBOCAN). Se ha informado de que alrededor de 782.000 casos de cáncer de hígado y 352000 casos de leucemia se diagnosticaron en el año 2012 (http://www.wcrf.org/cancerstatistics/world statistics.php cáncer), lo que indica la necesidad urgente de desarrollar efectiva tratamientos contra el cáncer.
las células son dependientes en gran medida de la matriz extracelular (ECM), que es el componente no celular de todos los tejidos y órganos que proporciona un andamio físico a los componentes celulares y también ayuda en la iniciación de bioquímica esencial procesos necesarios para la adecuada diferenciación de los tejidos, la homeostasis y la morfogénesis [2]. Las células se adhieren a la ECM a través de la acción de los receptores de ECM [2]. En particular, el receptor de laminina no integrina de 37 kDa /67-kDa (LRP /LR) es un componente principal de la matriz extracelular, la asistencia en numerosos procesos fisiológicos [3], [4], [5]. Se sugiere que 37-kDa LRP es el precursor de la alta afinidad LR receptor de laminina de 67 kDa, sin embargo, el mecanismo exacto por el que el precursor se forma el receptor es desconocido [6].
LRP /LR es predominantemente un receptor transmembrana, sin embargo, también es evidente en el núcleo y el citosol [7], [8]. En el núcleo, LRP /LR juega un papel crítico en el mantenimiento de las estructuras nucleares, mientras que en el citosol, que ayuda en los procesos de traducción [8]. Como un receptor transmembrana, LRP /LR sirve para varias funciones, tales como la migración celular [9], la adhesión célula-matriz [10], la viabilidad celular y la proliferación [3], [4], [5].
LRP /LR se ha demostrado que tienen una alta afinidad de unión para laminina-1. La laminina-1 es parte de una familia de lamininas, que son proteínas de la matriz extracelular que constituyen varias glicoproteínas no colágenas que se encuentran en la membrana basal [11], [12]. Esta glicoproteína se cree que desempeñan papeles críticos en la unión de las células [11], el montaje de la membrana basal [11], el crecimiento y la diferenciación celular [13], la migración celular [11], [14], el crecimiento de neuritas [11], [15 ] y la angiogénesis [16]. La laminina-1 también se ha demostrado para promover el fenotipo invasivo de las células tumorigénicas [17].
LRP /LR se ha encontrado que se sobre-expresa en la superficie de varias células tumorigénicas [18]. El resultado de esta sobreexpresión es un aumento de la interacción entre LRP /LR y laminina-1, y esta interacción se ha demostrado ser crucial en la mejora de la adherencia y la invasión - dos componentes clave de metástasis [19]. Esencialmente, laminina-1 en la membrana basal interactúa con LRP /LR en la superficie de células tumorigénicas que conducen a la adhesión [19]. Esto, a su vez, da como resultado la secreción de enzimas proteolíticas tales como colagenasa tipo IV con el fin de hidrolizar el colágeno de tipo IV en la membrana basal, lo que permite células tumorigénicas para invadir y, finalmente, se translocan a un sitio secundario [19].
Dado que el /interacción LRP LR-laminina-1 ha sido identificado como el evento crucial en la adhesión y la invasión, el bloqueo de esta interacción podría considerarse como un mecanismo esencial para el tratamiento de cáncer metastásico. Esto implica LRP /LR como un objetivo para el tratamiento del cáncer metastásico. Además, varios estudios han demostrado que la aplicación de anticuerpos específicos anti-LRP /LR reduce significativamente el adhesivo y el potencial invasivo de ciertas células tumorigénicas, como HT1080 de fibrosarcoma [18], pulmón [4], cervical [4], colon [4] , de próstata [4], de mama [20] y [20] las células de cáncer de esófago. Particularmente, anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 se ha sugerido para interrumpir el /la interacción laminina-1 LR LRP [4], por lo tanto IgG1-IS18 puede considerarse como una posible herramienta terapéutica en el tratamiento de cáncer metastásico.
En este estudio, se investigó la capacidad del anticuerpo anti-LRP /LR-específico IgG1-IS18 para impedir que el adhesivo y el potencial invasivo de células de leucemia y cáncer de hígado. Debido a la tasa de mortalidad con respecto a estos dos tipos de cáncer de alta incidencia y, las opciones terapéuticas alternativas se convierten en una necesidad. Es de destacar que se han realizado estudios similares, sin embargo, es posible que no todos los tipos de células cancerosas metastásicas pueden ser sensibles a los tratamientos IgG1-IS18. Por lo tanto, se hace necesario llevar a cabo estos estudios de metástasis en diferentes tipos de cáncer con el fin de ganar la penetración en el uso del anticuerpo como un amplio espectro de anticuerpos terapéutico alternativo para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Por lo tanto, este estudio se llevó a cabo con el objetivo de determinar si IgG1-IS18 es capaz de reducir significativamente el adhesivo y potencial invasivo de células de leucemia y cáncer de hígado, por lo tanto, proporcionar la posibilidad de que el anticuerpo a ser utilizado como una herramienta terapéutica alternativa en el tratamiento de estos dos tipos de cáncer.
Materiales y Métodos
cultivo de células y condiciones
adenocarcinoma de mama humano (MCF-7), carcinoma de hígado (HUH7) y leucemia (K562) líneas celulares obtenidas a partir de ATCC se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) alto contenido de glucosa (4,5 g /l) suplementado con suero de ternera fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina a 5% de CO
2 y 37 ° C.
Reactivos y anticuerpos
Matrigel utilizado para los ensayos de invasión de células se deriva de la Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de ratón y se obtuvo de BD Biosciences.
la laminina-1used para los ensayos de adhesión celular se obtuvo de Sigma-Aldrich.
el cloranfenicol acetil transferasa (CAT) de anticuerpos se obtuvo de Sigma-Aldrich.
IgG1-IS18 se produce de forma recombinante en un sistema de expresión de mamífero como se informó por
Zuber et al., (2008)
la microscopía confocal
con el fin de visualizar la ubicación de PRL /LR en la superficie celular, se empleó la microscopía confocal
. Las células se sembraron primero en cubreobjetos y se deja que alcance el 70% de confluencia. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante aproximadamente 15 minutos, seguido de varios lavados con PBS. Las células fueron bloqueadas en 0,5% de BSA en PBS durante 5-10 minutos. Después de un lavado con PBS, el exceso de PBS se transfirió fuera. cubreobjetos que contenían células se colocaron en un portaobjetos de vidrio (con las células hacia arriba) y esto fue seguido por la adición de anticuerpo primario IgG1-IS18 (1:100) diluido en 0,5% de BSA. Publicación de una incubación durante la noche a 4 ° C, los cubreobjetos se lavaron tres veces en PBS /BSA. Después de la adición del anticuerpo secundario acoplado a FITC que se había diluido en BSA al 0,5%, la incubación en la oscuridad se dejó durante 1 hora. Seguido de tres lavados como antes, DAPI diluido en PBS se administró a continuación, durante 5-10 minutos para permitir la tinción del núcleo. Las células se lavaron finalmente una vez en PBS solo y se montaron en un portaobjetos limpio usando GelMount (Sigma-Aldrich). Un período de 45 minutos se le asignó para permitir el establecimiento a tener lugar.
La citometría de flujo
La cuantificación de los niveles de la superficie celular de PRL /LR se llevó a cabo mediante citometría de flujo. EDTA (5 mM) en PBS se utilizó para facilitar la separación de células adherentes que fue seguido de centrifugación a 1200 rpm, 10 min. Las células se fijaron posteriormente por las células re-suspensión en PFA durante 10 min a 4 ° C. Las células se centrifugaron de nuevo en 1X PBS que permitió la preparación de cinco suspensiones de células, al que se añadió uno no anticuerpo (sirviendo así como el control sin teñir), al que se añadió un anticuerpo anti-CAT (que sirve como un control de isotipo) y uno al que se añadió anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18. Las dos suspensiones de células restantes se incubaron solo en PBS con el fin de ser utilizados como controles negativos para la IgG1-IS18 y anticuerpo anti-CAT. Todas las suspensiones se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de tres etapas de lavado con PBS 1X, cabra ficoeritrina anti-humano (PE) -junto se añadió anticuerpo secundario (Beckman Coulter) a la suspensión celular que contiene el anticuerpo primario IgG1-IS18, así como una de las suspensiones que se incubó en PBS solamente . La suspensión celular que se incubó con el anticuerpo anti-CAT, así como la suspensión celular restante que se incubó sólo en PBS, se complementa con un tanto aloficocianina de cabra anti-conejo (APC) -junto anticuerpo secundario seguido de otro período de incubación de 1 hora de todas las suspensiones de células. Por otra parte, se realizaron tres lavados post-incubación y las suspensiones de células se analizaron mediante el BD Accuri C6 citómetro de flujo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
SDS PAGE y Western Blot
niveles totales de LRP /LR se determinaron mediante el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE ). Para llevar a cabo la SDS-PAGE, se usó 10 g de proteína total. Las proteínas que se han separado según el tamaño mediante SDS-PAGE fueron identificados mediante la aplicación de anticuerpos específicos en el proceso de transferencia de Western. Las proteínas resueltas en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando tampón de transferencia 1X (20% de metanol en glicina 192 mM y Tris 25 mM) durante 45 minutos a 350 mV y un aparato de transferencia semi-seco. tampón (3% BSA en 1X PBS Tween) de bloqueo se utilizó a continuación con el fin de bloquear la membrana sometida a transferencia durante 1 hora. Una vez bloqueado, la membrana se sondó con anti-LRP /LR específica anticuerpo primario IgG1-IS18 (1:10000) durante 1 hora. Antes de la incubación de la membrana con anticuerpo de cabra anti-humana-peroxidasa (1:5000) anticuerpo secundario, se realizaron tres lavados con PBS 1X Tween. Otros tres lavados en 1X PBS Tween se realizaron después de la incubación en el anticuerpo secundario, seguido de la detección de HRP por el uso de un sustrato quimioluminiscente intensificado (Thermo científica). La fluorescencia resultante se desarrolló y fijada sobre una película de rayos X. Los experimentos fueron ejecutados por triplicado y se repitieron al menos 3 veces.
Ensayo de adhesión
Con el fin de evaluar el potencial de adherencia de las líneas celulares tumorigénicas distintas a la membrana basal
in vitro
se utilizó, laminina-1 (10 mg /ml) (BD Biosciences) para recubrir placas de 96 micropocillos, dejando los pozos no recubiertos para ser utilizados como controles negativos. Después de que el recubrimiento de los pocillos durante 1 hora y el lavado con 0,1% de BSA en DMEM, otros sitios de unión a proteínas en la placa de micropocillos se bloquearon usando 100 l de 0,5% de BSA en DMEM durante una hora. Las células se suspendieron en medio de cultivo libre de suero y se añadieron a los pocillos a una densidad de 4 x 10
5 células /ml con el fin de evaluar el potencial de la adhesión. Además, las células que han sido pre-incubadas con IgG1-IS18 (0,2 g /ml) y con anti-CAT (Sigma, 0,2 mg /ml) de anticuerpo como control negativo se añadieron a los pocillos pertinentes con el fin de examinar los efectos de los anticuerpos sobre el potencial de adhesión de las células. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 1 hora y después de eso, las células no adherentes fueron lavados con PBS y las células adherentes se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Las células adherentes se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. La mancha se extrajo utilizando 1% de SDS y la absorbancia de la muestra extraída a 550 nm se ensayó como una medida del potencial de adhesivo. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Invasión de ensayo
in vitro
análisis de la capacidad de las líneas celulares tumorigénicas para invadir la membrana basal se realizó a cabo utilizando el Matrigel ECM-similares. medio de cultivo frío libre de suero (DMEM) se utilizó con el fin de diluir el Matrigel y este gel diluido se dispensa sobre la cámara superior de una placa de 24 transwell (BD Falcon, 8 micras de tamaño de poro). A continuación se dejó Este gel para solidificar durante aproximadamente 5 horas a 37 ° C. Después de ser cosechadas, las células se resuspendieron en medio de cultivo libre de suero a una densidad de 1 x 10
6 células /ml. tratamientos con anticuerpos células requeridas para ser incubadas con IgG1-IS18 (0,2 g /ml) o el control negativo anti-CAT (Sigma, 0,2 mg /ml) de anticuerpo. Las células se cargan posteriormente en la cámara de Matrigel cubierta superior y se incubaron durante 18 horas. La cámara inferior se llenó con 500 l de medios de cultivo que contienen 10% de FCS (para la prueba) y sin FCS (para el control), y se incubó a 37 ° C durante 18 horas. Esto fue seguido por la aspiración de los medios de comunicación en la cámara inferior y superior. Las células no invasoras se eliminaron entonces mediante el uso de un bastoncillo de algodón. Después, las células invasoras restantes se lavaron con 300 l de PBS y se fijaron con 300 l de paraformaldehído al 4%, 10 min. Las células se tiñeron con colorante azul de toluidina al 0,5% y después de la extracción del colorante usando 1% de SDS, a continuación, se midió la absorbancia a 620 nm usando un lector de ELISA. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Las evaluaciones estadísticas
Se utilizó la prueba t de Student de dos colas con un intervalo de confianza del 95% con el fin de analizar los datos , con valores de p inferior a 0,05 se consideró significativo. La extensión o grado de asociación entre los niveles de PRL /LR en la superficie celular y el potencial invasivo /adhesivo se midió utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. coeficiente de correlación de Pearson también se utilizó para medir la correlación entre el adhesivo y el potencial invasivo de las líneas celulares. Un coeficiente positivo era una indicación de proporcionalidad directa entre las dos variables, mientras que un coeficiente negativo implica proporcionalidad inversa.
Resultados
células de cáncer de hígado y leucemia revelan PRL /LR en la superficie celular
Pivotal a la aparición de metástasis es la interacción entre laminina-1 y LRP /LR en la superficie celular. Por lo tanto, era necesario para visualizar LRP superficie celular /LR como medio de confirmación de que las células de hecho hacen pantalla LRP /LR en su superficie. Ambas líneas celulares tumorigénicas, así como el control del cáncer de mama poco invasiva, revelaron LRP /LR en la superficie celular tal como se representa en la figura 1 a). La fluorescencia verde en las imágenes de abajo es indicativo de la superficie de la célula PRL /LR como células no fueron permeabilizadas y el anticuerpo secundario se demostró que no se unen de forma no específica, como lo confirman los controles representados en la figura 1 b) y la figura 1 c) a continuación. El anticuerpo anti-CAT se utilizó como control negativo debido a su capacidad para unirse específicamente a la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que es una proteína bacteriana y es por lo tanto ausente en células de mamífero.
Las células no fueron permeabilizadas con el fin de permitir la visualización de la superficie celular. a) Las células se marcaron con el anticuerpo primario IgG1-IS18 y un anticuerpo secundario acoplado a FITC. b) Las células se marcaron con acteyltranferase anti-cloranfenicol (CAT) como anticuerpo control negativo. c) Las células se marcaron sólo con el anticuerpo secundario acoplado a FITC para confirmar que el anticuerpo secundario no se une de forma no específica.
Altos porcentajes de células tumorigénicas muestran LRP /LR en la superficie celular
a pesar de la microscopía confocal confirmó que las líneas celulares de hecho pantalla PRL /LR en su superficie celular, era necesario seguir cuantificación de los niveles de la superficie celular de PRL /LR. Citometría de flujo se emplea para esta cuantificación.
Como se muestra en la figura 2 A, C y E, las tres líneas celulares tumorigénicas revelaron altos porcentajes de células dentro de una población específica que deben mostrarse LRP /LR en la superficie celular, con el cambio entre los dos picos en cada gráfico indicativo de un cambio en la intensidad de fluorescencia debido a la tinción de la superficie celular de las células con anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 y el anticuerpo secundario acoplado a un fluorocromo. HUH-7 de cáncer de hígado muestran un mayor porcentaje de células que muestran LRP /LR en la superficie celular en comparación con células de leucemia K562, así como el cáncer de mama poco invasiva (MCF-7) línea celular de control. Higo. 2 B, D y F incluir adicionalmente el control sin teñir y este control sirve para demostrar que el anticuerpo secundario PE no se une de forma no específica. Los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células no teñidas, APC solamente y anti-CAT-APC marcados (los controles negativos) se representan en la Fig S1. También es digno de mención que añadir que los desechos de células y células agregados fueron excluidos del análisis, ya que estaban fuera de la puerta definida (Fig. S3).
El primer pico en los gráficos A, C y E es representativa de la no células marcadas, es decir, células marcadas sólo con anticuerpo secundario de cabra PE acoplados anti-humano, mientras que el segundo pico es indicativo de células marcadas con tanto anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 y el anticuerpo secundario, ambos a una concentración de 30 mg /ml. Los gráficos B, D y F muestran la inclusión de un control sin teñir para mostrar ninguna unión anticuerpo secundario no específica. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron al menos tres veces con 20 000 células son contados por muestra.
células de cáncer de hígado muestran significativamente mayor y las células leucémicas muestran niveles significativamente más bajos de la superficie celular de PRL /LR en comparación con células de cáncer de mama poco invasivos
Además del porcentaje de células que muestran LRP /LR en su superficie celular, los niveles reales de PRL de la superficie celular /LR dentro de una población de células específica se analizó mediante citometría de flujo. El mismo número de células (20000 células) dentro de las poblaciones específicas de las tres líneas celulares tumorigénicas fueron etiquetados con la misma concentración (30 mg /ml) de anticuerpos primarios y secundarios mencionados anteriormente, durante el mismo período de tiempo. Así, cuanto más LRP /LR que está presente en la superficie de las células tumorigénicas, el anticuerpo más primaria IgG1-IS18 se uniría a LRP /LR y, posteriormente, el anticuerpo secundario fluorocromo acoplado más IgG-specifc se uniría al anticuerpo primario . Por lo tanto, las intensidades de fluorescencia media (MFI) diferirían entre las tres líneas celulares (Tabla 1) y por lo tanto se pueden utilizar como un indicador de los niveles de PRL /LR de la superficie celular. Se observó que, en comparación con la línea celular de control de cáncer de mama MCF-7 mal invasivo, las células de cáncer de hígado (HUH-7) muestran niveles más altos de LRP /LR en su superficie celular (Fig.3). Además, las células de leucemia K562 reveló niveles más bajos de la superficie celular de PRL /LR en comparación con las células MCF-7 (fig.3).
Las células se marcaron con el anticuerpo primario IgG1-IS18 (01:25) y anti- ficoeritrina humano (PE) anticuerpo secundario. se analizaron 20000 células en las tres líneas celulares, y se utilizaron las intensidades de fluorescencia media (MFI) como un indicador de los niveles de PRL /LR de la superficie celular. Los valores de MFI que se indican en la última columna de la Tabla 1 se utilizaron para construir esta figura y hay que destacar que el valor MFI correspondiente a la línea de células MCF-7 se establece en 100%. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. ** P = 0,0025, *** p & lt;. 0,0001
Las intensidades de fluorescencia obtenidas mediana de etiquetado y detección poste anti-CAT demuestran que no hay diferencias significativas en el grado de por células CAT tinción superficial en las tres líneas celulares (Fig. S2)
niveles /LR LRP total no difieren significativamente entre las líneas celulares tumorigénicas
Como se mencionó anteriormente, la PRL /LR no aparece exclusivamente en la superficie celular, pero que se ve, además, en el núcleo y el citosol, por lo tanto, el análisis de transferencia Western se realizó con el fin de evaluar los niveles totales de LRP /LR. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces. Una transferencia representativa se representa en la figura 4. Es de destacar afirmar que sólo el precursor kDa receptor de laminina 37 podría ser detectado mediante el uso de anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18.
Anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 se utilizó como anticuerpo primario en combinación con un anticuerpo HRP-junto secundaria. β-actina se utilizó como control de carga.
Después de la detección de PRL, la cuantificación de los niveles totales de PRL se requería y densitometría fue empleado para lograr este objetivo. La figura 5 muestra el análisis densitométrico, que reveló que estadísticamente, no hubo una diferencia significativa observada en los niveles totales de LRP entre las tres líneas de células tumorigénicas.
La cuantificación se llevó a cabo utilizando densitometría y los datos son representativos de experimentos llevados a cabo en triplicado y se repitió tres veces. No significativa (NS):. P & gt; 0,05
IgG1-IS18 obstaculice de manera significativa el potencial de adherencia de las células del cáncer de hígado
Un elemento crucial de la iniciación de la invasión es la adhesión de un tumorigénico célula a la membrana basal a través de la interacción LRP /LR-laminina-1, ya que permite a otros que se produzcan interacciones que facilitan la degradación de la membrana basal. Las células se incubaron con anticuerpos anti-CAT (0,2 mg /ml) IgG1-IS18 y y después de una hora, las lecturas de absorbancia de la solución resultante fueron indicativos del grado de unión de las células a las placas recubiertas con laminina-1.
como se muestra en la figura 6, el control sin anticuerpo permitió la determinación del potencial de adhesivo de las líneas celulares y se observó que tanto el cáncer de hígado (HUH-7), así como células de leucemia (K562) fueron más adherentes que las células de control de cáncer de mama poco invasiva (MCF-7). Sin embargo, IgG1-IS18 sólo era eficaz en impedir el potencial de adherencia de las células de cáncer de hígado y ninguna reducción significativa en la adhesión se observó para las células de leucemia tratados con el anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18. Como se esperaba, el anticuerpo de control anti-CAT no tenía un efecto significativo en el potencial de adhesivo de las líneas celulares tumorigénicas
los valores de p se muestran en rojo (* p = 0,0238; *** p = 0,0002). son indicativos del aumento en el potencial de adhesivo de cáncer de hígado (HUH-7) y células de leucemia (K562) en comparación con el cáncer de mama línea celular de control (MCF-7). los valores de p se muestran en negro (** p = 0,0031; *** p = 0,0005) representan la reducción en el potencial de adhesivo después del tratamiento de las células con los anticuerpos apropiados. Se observó una reducción de 63,35% en el potencial de adhesivo después de la administración de IgG1-IS18 a las células de cáncer de hígado HUH-7. Los datos representan experimentos realizados por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Invasión del Matrigel por las células de cáncer de hígado (HUH-7) se ve impedida significativamente por anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18
la invasión de la membrana basal se considera como un prerrequisito para la progresión de un cáncer metastásico, por lo tanto ensayos de invasión usando un Matrigel, que imita los componentes de la membrana basal, se llevaron a cabo para determinar el potencial invasivo de la líneas celulares tumorigénicas. De manera similar a los ensayos de adhesión, el control sin anticuerpo permitió la determinación del potencial invasivo de las líneas celulares. Además, las células se trataron con anticuerpo específico anti-LRP /LR IgG1-IS18 y el anticuerpo anti-CAT (0,2 mg /ml).
Como se muestra en la figura 7, (HUH-7) células de cáncer de hígado son significativamente más invasiva en comparación con el cáncer de mama poco invasiva (MCF-7) línea celular de control, mientras que la leucemia de células (K562) mostró un potencial significativamente menor invasiva en comparación con el control. Por otra parte, IgG1-IS18 obstaculizada con éxito el potencial invasivo de cáncer de hígado (HUH-7) células mientras que no se observó ningún resultado significativo para las células de leucemia. Como era de esperar, el control de anticuerpo anti-CAT no afectó significativamente el potencial invasivo de las líneas celulares tumorigénicas
p-valores indicados en rojo (* p = 0,0485; ** p = 0,0053). Representar los cambios en la potencial invasor de las líneas celulares en comparación con el control MCF-7, mientras que los valores de p se muestran en negro (* p = 0,0214; ** p = 0,0091) son indicativos del efecto de los anticuerpos apropiados sobre el potencial invasivo de las líneas celulares. Tras la administración de IgG1-IS18 a las células de cáncer de hígado HUH-7, se observó una reducción de aproximadamente el 39,75% en relación con el potencial invasivo de las células. Los datos son representativos de experimentos llevados a cabo por triplicado y se repitió al menos tres veces.
Discusión
Varios estudios han puesto de manifiesto que, en la superficie celular, diversas líneas de células oncogénicas presentan una sobreexpresión de la 37 kDa /67 kDa LRP /LR, por lo tanto, lo que sugiere que el /interacción LRP LR-laminina-1 puede ser crucial para las células cancerosas a someterse a metástasis [21]. Por lo tanto, puede ser útil para inhibir esta interacción como un medio de obstaculizar la adherencia y la invasión - dos eventos encontrado que son cruciales para la aparición del proceso de metástasis. Un estudio realizado por Zuber
et al
ha demostrado que el anticuerpo IgG1-IS18 es altamente específico para LRP /LR [18]. Además, la investigación reciente ha demostrado que los anticuerpos anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 impide significativamente el adhesivo y el potencial invasivo de cuello de útero [4], de pulmón [4], de próstata [4], colon [4], de mama [20] y esofágicas [20] las células cancerosas. El presente estudio investigó el papel de la LRP /LR en la adhesión e invasión de cáncer de hígado (HUH-7), así como células de leucemia (K562), y el objetivo de establecer si la aplicación de anti-LRP /LR anticuerpo específico IgG1-IS18 significativamente reduce el adhesivo y el potencial invasivo de estas dos líneas celulares tumorigénicas.
Inicialmente, la microscopía confocal reveló que las tres líneas celulares tumorigénicas de hecho display LRP /LR en su superficie celular (Fig. 1a). Sin embargo, esta técnica está limitada por el hecho de que no es cuantitativo y se requiere un análisis adicional con el fin de establecer los niveles en los que se muestra LRP /LR en la superficie celular de estas líneas celulares tumorigénicas.
significativamente alto porcentajes (& gt; 87%) de las tres líneas celulares tumorigénicas, a saber, HUH-7, K562, y MCF-7 (control de cáncer de mama poco invasiva) las células que se muestra LRP /LR en su superficie celular (Fig.2). Además, se observó por análisis de las diferencias en las intensidades de fluorescencia media que, en comparación con la línea celular de control MCF-7, células de cáncer de hígado (HUH-7) reveló células de leucemia significativamente más altos y (K562) reveló significativamente menor LRP superficie celular /niveles LR (fig.3). Como se dijo anteriormente, LRP /LR juega un papel esencial en la adhesión, invasión, proliferación y migración de las células [9]. Al ver que la línea de células Huh-7 se sabe que es invasiva y el K562 se entiende que es una línea celular de suspensión (ATCC), los niveles de superficie celular de LRP /LR que se han observado pueden correlación con el potencial invasivo de estas células