Extracto
tiazol antibióticos, tioestreptona fue identificado recientemente como inhibidor del proteasoma. Se investigó el potencial terapéutico de la combinación de bortezomib tioestreptona y proteasoma inhibidor (Velcade) en varias líneas de células tumorales humanas. La combinación de concentraciones subletales de tioestreptona y bortezomib apoptosis inducida potente y la inhibición de la formación de colonias a largo plazo en una amplia variedad de líneas celulares de cáncer humano. La relación sinérgica entre tioestreptona y la combinación de bortezomib también se demostró cuantitativamente mediante el cálculo de sus valores de índice de combinación que eran muy inferiores a 1 en todas las líneas celulares estudiadas. La sinergia entre estos medicamentos se basó en sus actividades inhibidoras del proteasoma, debido a la modificación de tioestreptona, éster metílico tioestreptona, que no tiene anillo de ácido quináldico intacto y no inhibe la actividad del proteasoma no demostró ninguna sinergia en combinación con bortezomib.
Visto: Pandit B, Gartel aL (2011) tiazol Antibiótico Thiostrepton sinergia con bortezomib para inducir la apoptosis en células de cáncer. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10.1371 /journal.pone.0017110
Editor: José Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2010; Aceptado: 20 de enero de 2011; Publicado: 18 de febrero, 2011
Derechos de Autor © 2011 Pandit, Gartel. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionado por los Institutos nacionales de Salud subvenciones 1RO1CA1294414 y 1R21CA134615 (aL Gartel). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Combinación de fármacos /agentes dirigidos ha recibido un consenso como una posible estrategia viable para el tratamiento de tumores malignos. El tratamiento con una combinación de agentes que se dirigen mecanismo celular clave o proteínas críticas para varios tipos de cáncer están siendo investigados contra una variedad de tumores. Combinación de fármacos permite su uso a concentraciones subtoxic y disminuye la probabilidad de desarrollo de células cancerosas resistentes.
El proteasoma es un complejo de proteínas que se dirigen a proteínas de ubiquitina de etiquetado para la degradación de una manera dependiente de ATP. Los recientes avances en la comprensión de los mecanismos de la actividad del proteasoma condujeron al desarrollo de inhibidores del proteasoma como fármacos eficaces contra el cáncer humano [1]. Desde ciertos tipos de cáncer se basan en un proteasoma funcional para el crecimiento, la inhibición de la actividad del proteasoma mataría selectivamente estos tumores. Bortezomib (Velcade) es una de la primera en los inhibidores del proteasoma clase que inhibe la proteasoma 26S mediante la unión a los residuos de treonina N-terminal en el sitio activo de la región catalítica del proteasoma. Está aprobado para uso clínico en casos de mieloma múltiple en recaída, pero ha demostrado poca o ninguna actividad para el tratamiento de tumores sólidos como agente único. Sin embargo, mediante la inhibición de la vía del proteasoma y posterior efecto de vías importantes, bortezomib demuestra relación sinérgica cuando se combina con otros fármacos contra el cáncer y mejora la eficacia de los fármacos contra el cáncer.
En nuestros estudios anteriores hemos demostrado que los antibióticos de tiazol siomicina a y tioestreptona inducir la apoptosis en células de cáncer humano [2], [3] y actuar como inhibidores del proteasoma [4]. Se ha demostrado antes que la combinación de dos inhibidores del proteasoma MG132 lactacystin y sinérgicos contra las células de cáncer de próstata in vitro [5]. Además, la sinergia se demostró mediante la combinación de bortezomib con curcumina (que demuestra actividad inhibidora de proteasomal además de otros efectos) contra células de mieloma múltiple [6]. Del mismo modo, hemos demostrado que la combinación de tioestreptona y bortezomib demostrado fuerte sinergia contra el cáncer de próstata [7]. En este estudio se confirmó que co-tratamiento de varias líneas de células tumorales de diferente origen con concentraciones subletales de inhibidores del proteasoma tioestreptona y bortezomib revela una fuerte sinergia como se ha demostrado por la inducción de la apoptosis, los valores de índice de combinación y ensayo clonogénico a largo plazo.
resultados y Discusión
Hemos demostrado anteriormente que tioestreptona inhibidor del proteasoma inhibe el crecimiento de diversas líneas celulares de cáncer con IC
50 valores de (1-5 M /L) y la apoptosis inducida [2 ], [3]. Bortezomib se ha demostrado para inhibir la viabilidad de líneas de células tumorales con IC
50 valor de 10 a 100 nM /L. Para determinar si tioestreptona puede sinergizar con bortezomib frente a líneas celulares de cáncer humano de diferente origen se trataron varias líneas celulares de cáncer humano, ya sea con concentraciones sub-apoptóticos de tioestreptona o bortezomib solo o con combinaciones de los dos durante 24 horas y utilizamos la caspasa-3 para servir como un indicador de la muerte celular por apoptosis (Figura 1). Mientras que el tratamiento con tioestreptona o bortezomib solo indujo poca o ninguna caspasa-3 escisión en estas células, el tratamiento con la combinación de estos fármacos mostró potente de la caspasa-3 escisión en osteosarcoma U2OS-C3, MiaPaca-2 de páncreas, PA-1 de ovario, colon HCT116 y MDA-MB-231 células de cáncer de mama (Figura 1), y los niveles de apoptosis inversamente correlacionada con la expresión FoxM1 (Figura S1). Desde que establecimos anteriormente sinergia entre bortezomib y tioestreptona en células de cáncer de próstata [7], nuestros datos actuales sugieren que este efecto puede tener importancia general para el tratamiento del cáncer.
A. Osteosarcoma, U2OS-C3, B. MiaPaca-2 de páncreas, C. PA-1 de ovario, D. HCT-116 de colon, 231-MDA-MB células de cáncer de mama E. fueron tratados con concentraciones sub-apoptóticos de tioestreptona, bortezomib o ambos como se muestra durante 24 horas, los lisados celulares totales se extrajeron y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para la caspasa-3 escindida y β-actina.
para demostrar adicionalmente que el tratamiento combinado de tioestreptona y bortezomib induce la apoptosis sinérgica, teñidas estas células (DMSO tratada, tioestreptona tratada, bortezomib tratada y tratada junto con los dos fármacos) con anexina V-PE /7AAD y las analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 2A, el tratamiento de células HCT-116 con 0,75 M tioestreptona o 10 nM bortezomib apoptosis inducida de sólo el 6,1% y el 6,9% sobre el control, mientras que el tratamiento con ambos fármacos en las mismas dosis causó 35,2% de las células para experimentar apoptosis . Similar efecto sinérgico de la combinación de tioestreptona /bortezomib se observó por tinción con anexina-VPE-7AAD en mama MDA-MB231 y MiaPaca-2 células de cáncer de páncreas (Figura 2B y C).
A. HCT-116, colon, B. MDA-MB-231, de mama y C. MiaPaca-2, células de cáncer pancreático tratados con concentraciones sub-apoptóticos de tioestreptona, bortezomib y tioestreptona /combinación bortezomib durante 24 horas, teñidas con AnnexinV-PE y 7-AAD y se analizó mediante citometría de flujo.
Para validar cuantitativamente la naturaleza sinérgica de la interacción entre tioestreptona y bortezomib, se analizó la viabilidad celular después de los tratamientos individuales y la combinación de fármacos mediante el Chou-Talalay-mediana método de la ecuación efecto [8]. valores de CI por debajo de 1 indican un efecto antiproliferativo sinérgico, y los valores de rango de CI para los tratamientos combinados con tioestreptona /bortezomib en HCT-116, Mia-Paca-2, MDA-MB231 y PA-1 líneas celulares de cáncer humano fueron de 0,1 a 0.8 (Figura 3A, B, C, D) para el efecto fraccionario correspondiente a 0,3 a 0,9, lo que sugiere un fuerte efecto sinérgico. Los efectos a largo plazo del tratamiento de combinación con tioestreptona y bortezomib se evaluaron mediante ensayo clonogénico. Se encontró que la formación de colonias en HCT-116 colon y células MDA-MB 231 de cáncer de mama tratado con la combinación de estos fármacos durante 24 horas fue suprimida de 5 a 10 veces (Figura 4A y B).
índice de combinación tabla para la combinación de fármacos tioestreptona /bortezomib se representó con IC en eje y efecto fraccional (FI) en el eje x. El porcentaje de inhibición de la proliferación se determinó tras el tratamiento con un solo fármaco o la combinación de tioestreptona /bortezomib. índice de combinación (IC) los valores de los dos agentes trazan para HCT-116 (A), MIAPaCa-2 (B), MDA-MB231 (C) y PA-1 en las células de ovario (D).
A. ensayo clonogénico de células HCT-116 tratadas con DMSO o tioestreptona combinación /bortezomib durante 24 horas como se detalla; se muestra una fotografía de placas petri en un experimento representativo. B. ensayo clonogénico de células MDA-MB231 se trató con DMSO o tioestreptona /combinaciones bortezomib durante 24 hrs.
Después de la demostración de sinergia entre tioestreptona y la combinación de bortezomib, la importancia de la actividad inhibidora proteasomal de tioestreptona utilizado en la combinación fue investigado. La actividad de la combinación de éster de tioestreptona de metilo (anillo abierto inactivo análogo estructural de tioestreptona) y la combinación de bortezomib se comparó con tioestreptona y bortezomib. Se demostró previamente que se requiere un anillo macrociclo ácido quináldico intacto en tioestreptona para la actividad inhibidora del proteasoma de los antibióticos de tiazol [9]. La ausencia de este anillo o la presencia de un anillo abierto dictado la molécula inactiva [10]. En contraste con la combinación de tioestreptona /bortezomib, bortezomib y éster de metilo de tioestreptona fallado en demostrar la inducción de la apoptosis, lo que confirma la importancia de la actividad inhibidora del proteasoma de tioestreptona utilizado en la combinación de fármacos (Figura 5). Algunos estudios han demostrado una sinergia siguiente co-tratamiento con inhibidores del proteasoma, lactacistina y MG132 [5], bortezomib y curcumina [6] contra el cáncer. En este estudio utilizando diferentes métodos nos informan de que tioestreptona sinergia con bortezomib después de co-tratamiento con concentraciones subletales de los dos agentes, lo que sugiere que la combinación de dos inhibidores del proteasoma para ser de valor potencial como una estrategia general contra el cáncer.
el tratamiento con la combinación de los resultados de tioestreptona /bortezomib en la apariencia de la sub-G
0 pico que reduce la intensidad de la fluorescencia en las células HCT-116 en comparación con las células control sin tratar debido a la fragmentación de la cromatina. El cambio de la FI era comparable con el control positivo proporcionado en el kit (estaurosporina, datos no presentados). éster metílico Thiostrepton-B con el anillo abierto no afecta a la intensidad de fluorescencia en comparación con las células no tratadas (control).
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
U2OS-C3 osteosarcoma, colon HCT116, ovárico PA1 y MiaPaca-2 células de cáncer de páncreas se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen). células MDA-MB231 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen). Los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals) y 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO) y las células se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO
2. Las líneas celulares se ensayaron para determinar la contaminación por micoplasmas usando un kit de detección de Mycoplasma MycoAlert (Lonza Rockland) y se encontró que eran negativos. Thiostrepton se adquirió de Sigma, bortezomib fue proporcionado amablemente por Millennium Pharmaceuticals /Takeda. analógico anillo abierto de tioestreptona, éster metílico tioestreptona fue proporcionado amablemente por los Drs. Walsh y Bowers (Universidad de Harvard).
Combinación ensayo de índice de
ensayo MTT se realizó para medir la viabilidad de las células después del tratamiento con agentes individuales o combinación de tioestreptona y bortezomib. Cada experimento consistió en el tratamiento con diversas concentraciones de tioestreptona, bortezomib, combinación de tioestreptona y bortezomib y un tratamiento no de fármacos. Además, las concentraciones más altas de tioestreptona, bortezomib y la combinación de fármacos se ensayaron en ausencia de células y no demostraron ninguna interferencia con los reactivos de ensayo MTT.
3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il ) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) se adquirió de Sigma. Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
4 por pocillo en 200 l de medio de cultivo completo y se trataron con tioestreptona solo, bortezomib solo y combinación de tioestreptona y bortezomib en placas de 96 pocillos de microvaloración. Después de la incubación durante 72 horas a 37 ° C en un incubador humidificado, 10 l de MTT (/ml en PBS 5 mg) se añadió a cada pocillo, después de lo cual la placa se centrifugó brevemente. Después de la retirada cuidadosa del medio, 0,1 ml tamponadas DMSO se añadió a cada pocillo. La absorbancia se registró en un lector de micro-placa a la longitud de onda de 540 nm. En nuestros experimentos, la IC
30, IC
50, IC
70, IC
80, y IC
90 valores (es decir, la concentración de fármaco necesaria para causar 30%, 50% , 70%, 80%, y 90% de reducción en la viabilidad celular) fueron elegidos para la comparación.
para evaluar el efecto del tratamiento de combinación con tioestreptona y bortezomib, el índice de combinación (IC) del método isobolograma de Chou y Talalay se utilizó [8]. Este método implica el trazado de curvas de dosis-efecto para cada agente y combinaciones en múltiples concentraciones diluidas mediante el uso de la ecuación del efecto mediano y la ecuación de índice de combinación. los valores del índice de combinación 1, & lt; 1 y & gt; 1 indican un efecto aditivo, la sinergia, y el antagonismo, respectivamente. Los valores de índice de combinación se determinaron en diferentes niveles de efecto, y de los isobologramas trazan.
Detección de apoptosis
El kit de tinción de AnnexinV-PE (Roche Diagnostic Corp.) se utilizó para la detección de apoptosis cuerpos siguiendo el protocolo del proveedor. Este kit utiliza un protocolo de doble tinción en el que las células muestran la fluorescencia de la anexina V (células apoptóticas) y la fluorescencia de 7AAD (células necróticas o células apoptóticas tardías). Brevemente se cultivaron las células tumorales a una densidad de 50% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm y se trataron con concentraciones variables de las drogas durante 24 horas. las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, y se procesaron para el etiquetado con AnnexinV-7AAD. Las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo.
Immunoblotting
células activamente en división se sembraron en una placa de 100 mm a una densidad de 7,5 x 10
5 células. Las células se trataron con bortezomib solo, tioestreptona solo y combinación de tioestreptona y bortezomib durante 24 horas después de lo cual se lisaron las células. Las células se lisaron en tampón IP (HEPES 20 mM, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, Na 10
4P
2O
7, ortovanadato de sodio 1 mM, 0,2 mM PMSF complementado con la tableta de inhibidor de proteasa (Roche Applied Sciences) y la concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad. Cincuenta microgramos de los lisados celulares se separaron por electroforesis en el mini gel SDS-poliacrilamida y transferidos a membrana de PVDF. inmunotransferencia se realizó con anticuerpos específicos para exfoliados caspasa-3 (9664 señalización celular), FoxM1 (especie de regalo del laboratorio de Dr. Costa) y β-actina (A5441, Sigma).
Nucleares Identificación verde condensación de la cromatina detección
las células fueron teñidas utilizando
in vitro
kit de detección de apoptosis (Cat#ENZ-51021-K200 Enzo Life Sciences), según las recomendaciones del fabricante. brevemente 3-4 × 10
5 células se sembraron en placas de cultivo de 60 mm y se dejaron crecer durante la noche. las células se trataron con las concentraciones subletales de tioestreptona, éster metílico bortezomib o tioestreptona o combinación de tioestreptona y éster bortezomib y tioestreptona-metilo y bortezomib. Después de la incubación durante la noche de células Los fármacos se trataron con tripsina y se sometió a análisis de citometría de flujo. El análisis se realizó mediante el uso de FL-1 canal de citómetro de flujo con la longitud de onda de excitación de 488 nM. La estaurosporina, proporcionado en el kit se utilizó como control positivo.
supervivencia clonogénico ensayo
células HCT-116 y MDA-MB231 se sembraron a placas de medio a los 3 × 10
5 células confluencia y se trató con la combinación de tioestreptona y bortezomib durante 24 hrs. Después las células se trataron con tripsina, se resuspendieron en los medios de comunicación y se contaron. fueron re-sembraron las células (750 células por placa de medio) y se incubaron durante 10 días. Se añadió medio fresco en el quinto día. En el décimo día, se retiró el medio de las placas y se lavó una vez con PBS helado. Las colonias se tiñeron con 2 ml cada uno de 0,25% 1, 9-dimetil-azul de metileno en 50% de etanol durante 45 minutos en una plataforma oscilante. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se seca al aire y se contaron las colonias.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con Microsoft Excel utilizando el Student
t
prueba.
Los valores P Red de & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos
Apoyo a la Información
Figura S1..
niveles relativos de FoxM1 pueden afectar la sensibilidad al tratamiento combinado de tioestreptona /bortezomib en células cancerosas humanas. U2OS-C3 osteosarcoma y PaCa-2 células de cáncer de páncreas MIA se trataron con DMSO o indicaron concentraciones de tioestreptona y borteozomib juntos durante 24 horas. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia para FoxM1, troceados caspasa-3 y β-actina como control de carga
doi:. 10.1371 /journal.pone.0017110.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Albert Bowers y el Dr. Christopher Walsh amablemente para proporcionar éster metílico de tioestreptona se usa en el presente documento.