Extracto
cáncer de ovario
epitelial (EOC) es el más letal de todos los cánceres ginecológicos, y abarca distintos subtipos histológicos que tienen diferencias genéticas y tejidos de origen específicas. carcinoma de células claras de ovario (OCCC) representa aproximadamente el 10% de los casos y se ha denominado un cáncer sensible estrés. OCCC se caracteriza por aumento de la expresión del estrés oxidativo y los genes relacionados con la glucólisis. En el presente estudio, la hipótesis de que el perfil bioenergético podría distinguir de forma única OCCC de otros subtipos histológicos de EOC. El uso de un analizador de flujo extracelular, líneas OCCC (ES-2, TOV-21-G) mostraron ser metabólicamente muy activo, con alta tasa de consumo de oxígeno (OCR) y de alta velocidad de acidificación extracelular (ECAR), indicativo de una mayor fosforilación oxidativa mitocondrial y la tasa glucolítica, respectivamente. Un perfil de alta bioenergética se asoció con la capacidad de las líneas celulares 'para formar esferoides de anclaje independiente. Dada su alta actividad glicolítica y mitocondrial, las células OCCC muestran fuerte sensibilidad a la 2-desoxi-D-glucosa y la inhibición del crecimiento rotenona, aunque este perfil quimiosensibilidad no era específico de sólo las células OCCC. perfilado bioenergético también identificó una línea celular no OCCC, OVCA420, al haber comprometido gravemente la función mitocondrial, basado en baja OCR y una falta de estimulación de la respiración máxima después de la aplicación del desacoplador FCCP. Esto fue acompañado por cambios en la morfología mitocondrial indicativos de la fisión mejorada, aumento de la expresión de la proteína de fisión mitocondrial Drp1, una pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la dependencia de la glucólisis. Es importante destacar que esta pérdida de la función mitocondrial fue acompañada por la incapacidad de OVCA420 células para hacer frente al estrés hipóxico, y una capacidad comprometida para estabilizar HIF-1α en respuesta a 1% O
2 hipoxia. Este conocimiento puede ser imprescindible para los investigadores planean utilizar esta línea celular para realizar nuevos estudios del metabolismo y la hipoxia, y sugiere que las alteraciones en la dinámica de fisión mitocondrial representa un fenotipo de una subpoblación de los EOC
Visto:. De Dier T, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel N (2014) Análisis Bioenergético de líneas celulares de cáncer de ovario: perfiles de los subtipos histológicos e identificación de una línea celular Las mitocondrias-defectuoso. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10.1371 /journal.pone.0098479
Editor: Jianhua Zhang, de la Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Enero, 2014; Aceptado: 2 de mayo de 2014; Publicado: 23 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 de Dier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) conceder R00CA143229 del Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario sigue siendo uno de los cánceres más mortales en las mujeres, con poca mejoría en la supervivencia global se expresará en las últimas tres décadas. Se ha hecho evidente que el cáncer de ovario es un término amplio utilizado para un número de enfermedades distintas, compartiendo la misma localización anatómica dentro de la cavidad intraperitoneal (IP). Los cinco subtipos de cáncer de ovario epitelial (EOC) difieren significativamente en su tejido de origen, marcadores genómicos y la dependencia de diferentes vías pro-tumorigénico de señalización celular [1] - [3]. Alto grado de cáncer de ovario seroso (SOC) es el subtipo histológico más común y se caracteriza por alta frecuencia en las mutaciones TP53, la inestabilidad genómica y como de origen trompa de Falopio [3], [4]. Los carcinomas de células claras de ovario (OCCC) representan aproximadamente el 10% de los casos de EOC en las poblaciones occidentales (hasta un 25% en las poblaciones asiáticas) [5]. OCCCs parecen consistir en subpoblaciones heterogéneas que muestran diversos grados de aberraciones genómicas [6]. Los más comunes están asociados con el dominio de interacción rica en AT que contiene la proteína 1A (ARID1A mutación ~ 50%) [7], [8] y la vía PI3K (pérdida de PTEN ~ 40% [9], la mutación PIK3CA [10]; AKT2 amplificación [5]). ARID1A mutaciones han permitido a los investigadores a asociarse con lesiones tempranas OCCC tejidos endometrioide y quistes de endometriosis [8], [11].
Si bien existen diferencias significativas en las aberraciones genómicas entre muestras individuales OCCC, Yamaguchi y colegas han informado recientemente una gen firma la expresión que está asociado de forma única con OCCC [12]. En particular, este estudio confirmó otros informes que OCCC se caracteriza como un cáncer de estrés sensible [12] - [14]. Alta expresión de enzimas antioxidantes y los genes asociados con el metabolismo de la glucosa son también frecuentes [12], [15]. Este perfil de expresión se cree que representan adaptaciones de OCCC contra los factores de estrés del microambiente del tumor, incluyendo el estrés redox inducida por el hierro libre y la inflamación [16]. Algunos de estos cambios de expresión se observan de manera similar en los quistes de endometrio, lo que sugiere, además, que esto representa el tejido precursor de la OCCC [12]
.
Mientras que los pacientes etapa temprana OCCC generalmente tienen una mejor tasa de supervivencia que los pacientes en estadio SOC primeras, la etapa III y IV OCCC se asocia con una baja supervivencia. Además, a menos de 10% de OCCC recurrente responde a la terapia y este subtipo histológico se ha asociado con altas de cisplatino resistencia [5]. Dado que hay diferencias significativas en el genoma y la expresión perfil OCCC comparación con SOC, hay una necesidad de entender mejor los mecanismos moleculares que conducen OCCC tumorigénesis y progresión de adaptar la terapéutica para este subtipo histológico particular. Dado que OCCCs se caracterizan por una alta expresión de los mediadores de la vía glucolítica, el objetivo del presente estudio fue investigar si las líneas celulares OCCC también difieren significativamente en su perfil bioenergética en comparación con otras células en cultivo EOC. Usando las mediciones de células vivas de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular, hemos sido capaces de establecer que las líneas celulares OCCC son altamente metabólico. Además, este análisis reveló una línea de células COS con la función mitocondrial defectuoso, que se manifiesta en una pérdida de la respuesta hipóxica de estas células.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 y NOSE007 células fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Susan K. Murphy (Universidad de Duke) y se cultivaron en RPMI1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DSV-13 células fueron originalmente aislado de ovario ascitis de pacientes con cáncer [17], [18]. NIHOVCAR3 células (denominadas aquí como OVCAR3) y líneas celulares de carcinoma de células claras de ovario ES-2 y TOV-21-G se adquirieron de ATCC. ES-2 células se cultivaron en medio 5a de McCoy modificado con 10% de FBS. células TOV-21-G se cultivaron en una mezcla 01:01 de MCDB 105 que contiene bicarbonato de 1,5 g /L de sodio y Medio 199 conteniendo 2,2 g /L de bicarbonato de sodio, con suero bovino fetal 15%. células OVCAR3 se mantuvieron en RPMI1640, que contiene 0,01 mg /ml de insulina bovina y 20% de FBS. La glutamina y la privación de glucosa se llevaron a cabo utilizando MP Biomedicals RPMI 1640, 1X Liq., W /o L-glutamina y glucosa.
Análisis Bioenergético de consumo de oxígeno (OCR) y extracelular acidificación Rate (ECAR)
El Seahorse XF24
3 extracelular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) fue utilizado para evaluar fenotipos bioenergéticos de líneas celulares de cáncer de ovario. El extracelular Flux analizador permite la medición de células vivas simultánea de la tasa de consumo de oxígeno (OCR), un indicador de la respiración mitocondrial, y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), un indicador de la pérdida neta de protones durante la glucólisis. Antes del comienzo del experimento, las células se sembraron de manera uniforme (40.000 células /pocillo; siguientes optimización del número de células de siembra) en la placa de cultivo celular XF24 y que se pueden conectar por 24 horas. medios de cultivo celular se reemplazó con medio XF (Seahorse Bioscience), que carece de bicarbonato de sodio y FBS, después de un lavado previo con medios XF. Las células se colocan en un no-CO
2 37 ° C incubadora durante 1 hora, antes de comenzar el experimento. OCR y ECAR se midió durante un período de 3 minutos, seguido de 3 min y la mezcla de re-oxigenación de los medios de comunicación. Tres mediciones de la tasa basal fueron tomadas antes de la inyección de manipuladores farmacológicas de las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial, también conocida como la prueba de estrés mitocondrial. Varios parámetros bioenergética se pueden deducir mediante la supervisión de OCR en respuesta a estos compuestos [19]. Tras el establecimiento de una lectura basal OCR, se aplica oligomicina A para inhibir de protones (H +) fluya a través de la ATP sintasa, bloqueando esencialmente todo el consumo de oxígeno unido a ATP. respiración máxima puede ser iniciada mediante la exposición de las células a carbonilo hidrazona cianuro ptrifluoromethoxyphenyl (FCCP), que es un ionóforo que transporta H + a través de la membrana mitocondrial que conduce al colapso del potencial de membrana y rápido consumo de O
2. Antimicina A impide la respiración mitocondrial mediante el bloqueo de complejo III (Ubiquinona: citocromo complejo b-c). la inhibición de la ATP sintasa se consiguió mediante la inyección de 1 M oligomicina A (Sigma), que fue seguido por la inyección de 750 nM FCCP (Sigma) para la medición de máxima OCR. Esto fue seguido por la adición de 1 M antimicina A (Sigma) para apagar todo la respiración mitocondrial. Se obtuvieron tres mediciones de OCR /ECAR después de la inyección de cada uno de las concentraciones de drogas y drogas optimizados en las líneas celulares antes de los experimentos. OCR y ECAR lecturas se normalizaron a los niveles de proteína total (ensayo de proteína BCA, Pierce) en cada pocillo. Cada línea celular se representó en 5 pocillos por experimento y replicar los experimentos llevados a cabo al menos tres veces. respiración basal se obtiene restando la tercera lectura OCR, tras antimicina A Además, a partir de la tercera lectura basal de OCR. Estado respiratoria aparente, una indicación del estado respiratoria mitocondrial, se calculó utilizando: 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) [20]. Antes del comienzo de estos experimentos curvas de dosis respuesta (100 nM-3 M) se llevaron a cabo para establecer la concentración de FCCP necesarios para alcanzar máxima OCR. Todas las líneas celulares respondido por el logro de una meseta de máxima OCR en 750 FCCP nM, con una inhibición de OCR observaron en 3 M en algunas líneas celulares (OVCA429, Ovca433, OVCAR3, ES-2). OVCA420 células no responden a FCCP en cualquiera de las concentraciones ensayadas
tiempo real semi RT-PCR cuantitativa
Después de aislamiento de ARN. (RNeasy Mini Kit; Qiagen) y la transcripción inversa utilizando iScript síntesis de cDNA (BioRad), en tiempo real semi-cuantitativos de RT-PCR se llevó a cabo en un Applied Biosystems 7500 ciclador PCR en tiempo real, utilizando iTaq universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los siguientes pares de cebadores fueron utilizados para el análisis en tiempo real semi-cuantitativos RT-PCR: sentido HNF-1β: 5'-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 '; HNF-1β antisentido, 5'-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 '[21]. GLUT-1 sentido 5'-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 '; GLUT-1 antisentido 5'-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 '[22]. Los datos fueron analizados utilizando el método comparativo CT con los valores normalizados para los niveles de ß-actina y se expresaron en relación con los niveles en las células NOSE007.
esferoide Formación Ensayo
Se sembraron líneas celulares de cáncer de ovario (1000 células /pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo redondo ultra bajo de fijación (ULA) (Corning) y controlada por la formación de agregados de esferoides hasta el día 9 en condiciones normales de cultivo (medios totalmente suplementados, 37 ° C, 21% de O
2, 5 % de CO
2).
ensayos de viabilidad celular
igual número de células se sembraron en placas de 96 pocillos y la viabilidad celular en respuesta a los agentes quimioterapéuticos medido tras 72 horas de tratamiento con fármacos indicados dosis. La viabilidad celular se evaluó por la captación de cristal violeta. Brevemente, las células se tiñeron con cristal violeta durante 10 minutos, seguido de lavado en PBS y H
2O. colorante cristal violeta se libera de las células utilizando ácido acético al 30% y la absorbancia medida a 590 nm, usando un lector de microplacas Molecular Devices SpectraMax paradigma. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de viabilidad en relación con células no tratadas. Cisplatino (cis-Diamineplatinum (II) dicloruro), paclitaxel y 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) se adquirieron de Sigma. Rotenona se obtuvo a partir de caballitos de mar Biosciences.
Mitotracker tinción
células cultivadas sobre cubreobjetos fueron incubadas con 250 nM Mitotracker Red CMX ROS (Life Technologies) durante 15 minutos, seguido de lavado en PBS y fijación con 4% de paraformaldehído. Las muestras se montaron en portaobjetos usando Prolong oro /DAPI (Life Technologies) y la imagen usando un LED basada en microscopio de fluorescencia eVOSfl AMG (100x aceite objetivo de inmersión).
Relación de ADNmt /ADNn tiempo real RT-PCR
para la cuantificación de las mitocondrias se extrajo ADN (ADNmt) y el ADN nuclear (ADNn) DNA total a partir de células de cáncer de ovario usando AllPrep ADN /ARN /proteína Mini Kit (Qiagen), que se diluyó a una concentración final de 10 ng /l. Para cuantificar el ADN mitocondrial relativa: relación de ADNn se utilizaron los siguientes cebadores; 16S rRNA gen de ADN (MT) mitocondrial (sentido: 5'-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 '; antisentido: 5'-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3'); 18S rRNA de (n) de ADN nuclear (sentido: 5'-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 ', antisentido: 5'-CACCAGACTTGCCCTCCA-3') [23], [24]. valores de CT para mt16S y n18S se obtuvieron siguiendo PCR en tiempo real de 50 ng de ADN total utilizando iTaq universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), a una temperatura de hibridación de 59 ° C.
mitocondrial potencial de membrana
potencial de membrana mitocondrial se midió usando JC-1 colorante (5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro; Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se incubaron con 10 mg ml de colorante /JC-1 durante 15 min y de fluorescencia imágenes tomadas utilizando un objetivo de 20x. La relación de fluorescencia roja JC-1 agregados y verdes monómeros JC-1 se midió usando la imagen J, después de la corrección imagen de fondo.
clonogenicidad
Se sembraron células (100 células /pocillo) en una 6 placa de pocillos y se cultivaron durante 10 días en condiciones normales de cultivo (21% o
2) o hipoxia (1% o
2, la cámara hipóxica Biospherix). Clonogenicidad se evaluó mediante la tinción de las colonias con violeta cristal y el número de colonias contadas usando la imagen J y datos expresados como fracción de supervivencia celular.
inmunotransferencia
Las líneas celulares fueron cultivadas en platos de 10 cm a sub-confluencia y se lisaron en tampón RIPA (+ inhibidores de la proteasa), seguido por electroforesis en 4-12% de geles de SDS-PAGE (Bio-Rad). Después de la transferencia Western, las membranas se probaron con anticuerpo primario anti-Drp1 (Millipore) o GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) durante la noche en 5% de leche no grasa /TBS, 0,1% Tween 20. De acuerdo con manchas de incubación de anticuerpo secundario se visualizaron utilizando sustrato de quimioluminiscencia femto o Pico (Thermo Scientific). Para el análisis de HIF-1α, las células se cultivaron bajo condiciones hipóxicas (1% O
2) durante dos horas. Las células se lisaron inmediatamente en tampón de muestra 2x SDS y cantidades iguales cargados en SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad), seguido de la transferencia Western e inmunotransferencia para HIF-1α y control de carga β-actina. anticuerpo anti-HIF-1α fue adquirido de BD Transducción Laboratories y anticuerpos β-actina de Applied Biosystems-Life Technologies.
Datos y Análisis Estadístico
Todos los datos presentados son representativos de al menos tres replicados experimentos. Image J se utilizó para cuantificar la fluorescencia relativa y medir el tamaño del área de esferoide. Todos los datos se representan como media ± error estándar de la media. análisis de datos estadísticos (ANOVA con la prueba de Tukey posterior, o T-test) se realizó utilizando GraphPad Prism Software (v6), y los datos se consideraron significativos valores de p & gt;. 0.05
Resultados
Perfil Respiratorio de líneas celulares de cáncer de ovario
para caracterizar el perfil de la bioenergética de líneas celulares de cáncer de ovario se utilizó un analizador de flujo extracelular para determinar la tasa de oxígeno en vivo de células consumo (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR; Seahorse Bioscience). Dos líneas celulares OCCC, ES-2 y TOV-21-G se compararon con las líneas que no son OCCC EOC celulares (OVCA420, OVCA429, OVCA433, DSV-13, OVCAR3) y una línea de células epiteliales normales superficial del ovario (NOSE007).
Figura 1A muestra el OCR de líneas celulares en respuesta a compuestos utilizados en la prueba de esfuerzo mitocondrial con el tiempo. Basal y las lecturas de OCR dependientes de ATP se indica que la mayoría de las líneas celulares de cáncer analizadas, con la excepción de OVCA420 células, tenían significativamente más alta en comparación con OCR una línea de células epiteliales de ovario superficie normal (NOSE007, las figuras 1B & amp; C). La línea celular NOSE007 no fue elegido como representante para el tejido de origen cáncer de ovario, ya que éstos varían mucho entre los subtipos histológicos, sino más bien como un representante de una línea de células epiteliales normales. Basales lecturas OCR mitocondrial (Figura 1B) se normalizaron restando no mitocondrial OCR, que fue baja y no significativamente diferente entre las líneas celulares ensayadas (no mostrados). La mayor parte de la Basal mitocondrial OCR se dedicó a ATP-producción, como se indica por oligomicina A inhibición (Figura 1C). Cualquier OCR restante puede ser algo atribuirse a las fugas de protones a través de la membrana [19], que fue similar en todas las líneas celulares ensayadas, excepto TOV-21-G y DOV-13 células, que muestra un ligero pero significativo incremento en comparación con NOSE007 y OVCA420 las células (Figura 1D). Todas las líneas celulares, excepto OVCA420 células respondieron a FCCP aumentando su OCR a la máxima tasas (Figura 1E). Por lo tanto, OVCA420 células no tienen una capacidad de reserva respiratoria apreciable, la diferencia entre la máxima y la respiración basal (Figura 1F). Alta capacidad de reserva respiratoria también está vinculada a la alta fidelidad mitocondrial. Cálculos del Estado respiratoria
aparente mostraron que las células epiteliales de ovario normales NOSE007 están funcionando a la capacidad respiratoria submáxima en comparación con las líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 1G). Verdadero estado 4 respiración se caracteriza por la falta de generación de ATP mitocondrial, como en el caso de agotamiento de ADP, y imitado en nuestro ensayo por oligomicina Una adición. mitocondrias Estado 3 aislados se caracterizan por la actividad máxima en presencia de sustrato ilimitado y ADP [20]. Mientras que estos parámetros no se consiguen completamente en el contexto de una célula (celular Estado
aparente tanto, se considera para ser 3,5), se observó que las células de cáncer, excepto OVCA420s, muestran un estado aparente por debajo de 3,5, mientras que el Estado
valores aparentes de células NOSE007 acercaron estado 4 (Figura 1G). Ningún Estado
aparente puede obtenerse por OVCA420 células debido a la falta de respuesta a FCCP.
A. las mediciones de consumo de oxígeno Rate (OCR) se obtuvieron a lo largo del tiempo (min) usando un analizador de flujo extracelular (Seahorse Bioscience). Se utilizó la prueba de esfuerzo mitocondrial para obtener parámetros bioenergética, mediante la adición del inhibidor de la ATP sintasa oligomicina A (O, 1 M), para derivar vinculado-ATP OCR, FCCP (F, 750 nM) para desacoplar la mitocondria para máxima OCR, y antimicina A (A, 1 M). B. basal mitocondrial OCR de líneas celulares de cáncer de ovario se obtiene restando no mitocondrial OCR (OCR restante después de antimicina A adición). vinculado-ATP C. OCR se derivó como la diferencia entre basal y antimicina A inhibe OCR. D. OCR atribuye a la fuga de protones se calculó como la diferencia entre OCR siguiente oligomicina Una inhibición y OCR siguiente antimicina A inhibición. E. Máxima OCR fue estimulada por la adición de FCCP. F. La capacidad de reserva respiratoria se calculó como la diferencia entre el máximo y OCR basal. Los gráficos BF representan los datos de un experimento replicado (n = 5, ANOVA, Tukey post test * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, **** p & lt; 0,0001 estadísticamente significativa en comparación con NOSE007;#p & lt; 0,05, ## p & lt; 0,01, ### p & lt; 0,001, #### p & lt; 0,0001 estadísticamente significativa en comparación con OVCA420). líneas celulares OCCC se resaltan en negro y una línea de células epiteliales normales en blanco. G. El promedio del estado respiratorio
aparente se calcula a partir de 3-4 experimentos replicativos utilizando:. 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) guía empresas
Mientras que todas las células cancerosas claramente tenía alta la respiración mitocondrial en comparación con las células NOSE007 no se observó una diferencia significativa en los parámetros respiratorios entre las células de la OCCC y otras líneas celulares de cáncer de ovario, lo que sugiere que el perfil de consumo de oxígeno mitocondrial no diferencia subtipos histológicos de cáncer de ovario. Sin embargo, el uso de este enfoque hemos sido capaces de identificar OVCA420 células que tienen la función mitocondrial defectuoso, indicada por una baja OCR basal y la falta de respuesta a FCCP.
OCCC células tienen una alta tasa de acidificación extracelular
simultánea a la medición de OCR, el análisis de flujo extracelular permite la evaluación de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de medios de cultivo. Esto se considera un análisis indirecto de la tasa glucolítica de las células [19]. OCCC líneas de células ES-2 y TOV-21-G indicada ECAR alta basales, mientras que otra línea celular tenía ECAR inferior, similar a NOSE007 (Figura 2A). Oligomicina A se usa para estimular la ECAR máxima, que se apaga OCR dependiente de ATP, cambiando efectivamente el metabolismo de la fosforilación oxidativa para la glucólisis (Figura 2B). La diferencia entre el máximo y el CERA basal se considera la capacidad de reserva glucolítica de las células (Figura 2C). OVCA420 células, que muestran la respiración mitocondrial defectuoso (Figura 1), también tenían baja capacidad de reserva glicolítica, lo que indica que estas células están operando cerca de su tasa máxima glicolítica como una compensación por la pérdida de OCR. Esto sugiere una dependencia de la glucólisis por OVCA420 células. La línea de células epiteliales normales NOSE007 muestra la reserva glicolítica más bajo, lo que sugiere que su capacidad para la glucólisis es menor que la de las otras líneas celulares de cáncer.
A. niveles basales ECAR se midieron usando un analizador de flujo extracelular (Seahorse Bioscience). B. La máxima ECAR fue estimulada por adición de 1 M oligomicina A. C. Reserva glicolítica la capacidad se calculó como la diferencia entre el máximo y el OCR basal. Se muestra datos de un experimento replicativa (n = 5, ANOVA, Tukey post test * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, **** p & lt; 0,0001 estadísticamente significativa en comparación con NOSE007;#p & lt ; 0,05, ## p & lt; 0,01, ### p. & lt; 0,001 estadísticamente significativa en comparación con OVCA420) guía empresas
Bioenergética perfil |
para obtener una mejor visión de conjunto del perfil de la bioenergética las líneas celulares de cáncer de ovario estudiados nos trazan el CERA basales contra mitocondrial OCR (Figura 3A). Esto demuestra claramente cómo las diferentes líneas celulares se dividen en varias categorías bioenergética. Hemos encontrado 3 grupos distintos de perfiles bioenergética celular. OCCC células TOV-21-G y ES-2 representan claramente las células de alta energía con alta respiración y la glucólisis. Del mismo modo las células OVCAR3 muestran este patrón. OVCA433, OVCA429 y DSV-13 tenían un fenotipo más aeróbico, mientras que NOSE007 y OVCA420 células eran menos las células energéticas, tanto con baja OCR y el CERA. Cabe señalar que a diferencia de OCR, las mediciones ECAR fueron más variables entre los días experimentales, lo que era particularmente evidente para OVCAR3 y DOV-13 líneas celulares (Figura 3A). Curiosamente, las células aeróbicas más OVCA433, OVCA429 y DSV-13 tenían un nivel relativamente alto de reservas glicolítica, lo que sugiere que estas células son capaces de rampa encima de su actividad glicolítica cuando sea necesario, como puede ser el caso en condiciones de hipoxia (Figura 3B). ES-2 células muestran las capacidades de reserva más bajas, lo que indica que esta línea celular puede estar operando cerca de su máxima respiratoria y la capacidad glucolítica en condiciones normales de cultivo (Figura 3B). Al considerar los dos parámetros de OCR y ECAR, nuestros datos sugieren que las células OCCC son altamente energético, basándose tanto en la fosforilación oxidativa y la glucólisis para satisfacer sus necesidades energéticas. Sin embargo, los perfiles respiratorios y glucolíticas pueden no ser suficientes para diferenciar células OCCC de otros subtipos histológicos, como células OVCAR3 comparten características similares bioenergética.
A. Trazado de los niveles basales ECAR y OCR proporciona una instantánea de los perfiles bioenergética de las líneas celulares de cáncer de ovario estudiados. OCCC líneas de células ES-2 y TOV-21-G, así como células OVCAR3 pantalla de alta glicolisis y la fosforilación oxidativa y por lo tanto se clasifican como células altamente energéticas. B. glicolítica Reserva conspirar contra la reserva respiratoria indica que algunas células parecen estar operando cerca de su velocidad máxima, tal como células ES-2, mientras que otros tienen alta reserva respiratoria (NOSE007) o alta glucolítica de Reserva (DSV-13, OVCA429). líneas celulares OCCC se etiquetan como triángulos negros, otras líneas celulares EOC como círculos grises (OVCA420 como círculo con X), y las líneas de células epiteliales normales NOSE007 como un cuadrado blanco. Los datos de A y C representa el promedio de medias lecturas de OCR y ECAR 3-4 experimental replica formación C. esferoide se correlaciona con la firma bioenergético de las células de cáncer de ovario. Las células se sembraron en placas de ULA y tamaño (área de agregado esferoidal en píxeles) trazan (n = 6).
La capacidad de sobrevivir como agregado esferoidal anclaje independiente juega un papel importante en la ruta transcelómica de la metástasis del cáncer de ovario a través de la cavidad IP. Por lo tanto, se evaluó si un alto perfil bioenergética proporciona una ventaja en la formación de esferoides y la supervivencia. Curiosamente, las células altamente energéticas, ES-2, TOV-21-G y OVCAR3 fueron capaces de formar y mantener grandes agregados esferoidales cuando se sembraron en superficies de fijación ultra-bajas (Figura 3C). Mientras esferoides OCCC continuaron aumentando en tamaño, agregados OVCAR3 comenzaron a desagregar en el Día 9. Las células con un fenotipo más aeróbico o no podían formar esferoides (DSV-13) o para mantener los agregados bajo condiciones de crecimiento independiente de anclaje más allá de día 4 (OVCA429 & amp; OVCA433). NOSE007 y OVCA420 fueron capaces de formar agregados esferoidales muy pequeñas, que no aumentan de tamaño y comenzaron a desintegrarse tras día 4 y el día 9, respectivamente. Estos datos indican que una firma de alta bioenergética (alta OCR y ECAR) puede estar asociada con la capacidad de formar esferoides, potencialmente ayudar anoikis resistencia y la proliferación celular independiente de anclaje.
Relación de la bioenergética de quimiosensibilidad perfiles
Teniendo en cuenta la identificación de las diferentes firmas bioenergéticas en nuestro conjunto de líneas celulares de cáncer de ovario, que queríamos explorar si esto es predictivo de la respuesta celular a la línea de productos quimioterapéuticos. Cisplatino y paclitaxel son agentes utilizados comúnmente en el tratamiento de cáncer de ovario. El desarrollo de resistencia a cisplatino es una característica común de cáncer de ovario y OCCC se ha caracterizado como un subtipo histológico altamente resistentes al cisplatino. Por lo tanto, era sorprendente ver una fuerte disminución de la viabilidad celular en células ES-2 y TOV-21-G en respuesta a este compuesto (figura 4A). OVCA429 y OVCA433 células tenían la mayor respuesta al paclitaxel, seguido por las células TOV-21G (Figura 4B) ES-2 y. Sin embargo, no hubo un patrón claro asociado con cisplatino y paclitaxel sensibilidad y la bioenergética fenotipo.
Las células fueron tratadas con dosis indicadas para 72A. El cisplatino, B. Paclitaxel, C. 2-desoxiglucosa (2-DG), D. Resveratrol, E. metformina, F. rotenona, y G. El tratamiento de combinación de dosis baja rotenona (R; 0,1 M) y 2-DG (2 mM). Se muestra datos de un experimento replicativa (n = 5-6, A-F: ANOVA, Tukey post test * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, **** p & lt; 0,0001 significativamente menor la viabilidad celular en comparación con NOSE007 en la misma concentración de tratamiento; G: T de Student, estadísticamente significativa en comparación con cada tratamiento línea celular con rotenona solas [* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, *** * p & lt; 0,0001], o 2-DG solo [# p & lt; 0,05, ## p & lt; 0,01, ### p & lt; 0,001, #### p & lt; 0,0001]). Los asteriscos resaltan OVCA420 células, que tienen la respiración mitocondrial defectuosa. H. La expresión de GLUT-1 y el mensaje HNF-1β en las células de cáncer de ovario, según lo evaluado por el tiempo semi-cuantitativa real de RT-PCR. La expresión se correlaciona con los niveles en las células NOSE007 (n = 3; ND = no detectado señal medible).
Dado el alto nivel de ECAR observada en las células de la OCCC, no fue sorprendente que la EE-2 y células TOV-21-G mostraron mayor respuesta a la glicolítica inhibidor de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG; Figura 4C). células OVCAR3 eran más resistentes a la 2-DG, que puede ser apoyado por su alta variabilidad en las lecturas ECAR (Figura 3A). OVCAR3 células también mostraron ligeramente mayor reserva respiratoria que las líneas celulares OCCC (Figura 1I), lo que puede indicar que estas células son capaces de rampa encima de su fosforilación oxidativa en respuesta a la glucólisis parada de la manera más eficiente. manipuladores alternativas de la glucólisis, incluyendo el resveratrol y metformina dio lugar a perfiles de viabilidad celular similares a los obtenidos por la DG-2 (Figura 4D & amp; E). células OVCAR3 NOSE007, DSV-13 y fueron en general más resistentes a estos compuestos. Como era de esperar, OVCA420 células eran susceptibles a la inhibición por la glucólisis 2-DG, el resveratrol y metformina, pero esto no fue marcadamente diferente de OVCA429 o OVCA433 células.
En comparación con las células NOSE007, OVCA429, OVCA433, y la célula OCCC líneas ES-2 y células TOV-21-G tuvieron una reducción significativa en la viabilidad celular en respuesta al inhibidor mitocondrial rotenona (Figura 4F). Esto puede estar asociado con su alta dependencia de la respiración mitocondrial, lo que es particularmente evidente para OVCA429 y OVCA433 células. NOSE007 y células DOV13, que tenía un perfil general OCR inferior eran menos sensibles a la inhibición mitocondrial por rotenona a una dosis de 1 mM. Curiosamente, este patrón de sensibilidad rotenona paralela a la de paclitaxel (Figura 4B), lo que sugiere que el paclitaxel puede tener actividad más fuerte en las células con la respiración mitocondrial mejorada. Además de mediación de los efectos de los microtúbulos dependiente, paclitaxel ha mostrado inducir sus efectos apoptóticos
a través de
la mitocondria [25] - [27]. La necesidad de mitocondrias funcionales en la toxicidad de paclitaxel también se puso de relieve por la falta de OVCA420 respuesta a este compuesto. Las células con mayor sensibilidad a la 2-DG, fueron atacados con mayor eficacia mediante un tratamiento combinado de baja dosis de 2-DG (2 mM) y rotenona (100 nm), con mayor matanza observa en en OVCA420, OVCA429, OVCA433 y las dos líneas celulares OCCC ES-2 y TOV-21-G (Figura 4G).