Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) son responsables de la progresión del cáncer, metástasis y recurrencia. Hasta la fecha, los marcadores específicos de células madre cancerosas permanecen sin descubrir. El objetivo de este estudio fue identificar nuevos biomarcadores de células madre cancerosas gástricas para el diagnóstico clínico utilizando la tecnología proteómica. células CSC-como SP, células OCUM-12 /SP, células OCUM-2MD3 /SP, y sus 12-OCUM células parentales y células OCUM-2MD3 se utilizaron en este estudio. Proteína lisados de cada línea celular se analizaron mediante cromatografía líquida de QSTAR Elite con espectrometría de masas en tándem, junto con las etiquetas isobáricas para la tecnología de la cuantificación relativa y absoluta. proteínas candidatas detectadas por la tecnología proteómica fueron validados por análisis inmunohistoquímico de 300 cánceres gástricos. Sobre la base de los resultados de LC-MS /MS, ocho proteínas, incluyendo RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA, y KRT18, fueron reguladas en ambos-12 OCUM células /SP y OCUM-2MD3 /SP las células en comparación con sus células originales correspondientes. RT-PCR análisis indicó que el nivel de expresión de
RBBP6, hspa4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1
, y
CK18
fue alta en OCUM-12 /SP y OCUM-2MD3 /SP, en comparación con el control de los padres OCUM-12 y OCUM-2MD3. Estas proteínas se asociaron significativamente con la profundidad avanzada invasión, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis a distancia, o la enfermedad avanzada. RBBP6 expresión, DCTPP1, hspa4, y ALDOA en particular, se asociaron significativamente con un mal pronóstico en los 300 pacientes con cáncer gástrico. RBBP6 se determinó que era un factor pronóstico independiente. La capacidad de la motilidad estimulante de células OCUM-12 /SP y células /SP-OCUM 2MD3 fue inhibida por
RBBP6
siRNA. Estos resultados podrían sugerir que los ocho proteínas, RBBP6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, hspa4, ALDOA, y KRT18, utilizando el análisis de proteómica comparativa, se percibieron como posibles marcadores de CSC de cáncer gástrico. De los ocho candidatos proteínas, RBBP6 se sugirió a ser un biomarcador pronóstico prometedor y una diana terapéutica para el cáncer gástrico
Visto:. Morisaki T, M Yashiro, Kakehashi A, Inagaki A, H Kinoshita, Fukuoka T, et Alabama. (2014) Análisis Comparativo de Proteómica de células madre del cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10.1371 /journal.pone.0110736
Editor: Anita B. Hjelmeland, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2014; Aceptado: September 16, 2014; Publicado: 7 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Morisaki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. números de acceso a datos de proteínas se incluyen como UniProt /Swiss-Prot en la Tabla 2.
Financiación: Este estudio está financiado en parte por KAKENHI (subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica, los números 22390262, 23390329, 26293307 y. ), por el Fondo Nacional del cáncer Centro de Investigación y Desarrollo (23-A-9), y por el Fondo de Investigación de la Universidad de prioridad de la ciudad de Osaka. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células madre del cáncer (CSC) se definen como una subpoblación única en tumores que poseen la capacidad de iniciar y sostener el crecimiento del tumor auto-renovación [1]. Se ha propuesto que pueden causar el linaje heterogénea de células cancerosas que constituyen el tumor, así como desempeñar un papel importante en la progresión maligna de carcinoma, tales como metástasis a distancia, la periodicidad y la quimiorresistencia [2] - [4]. CSC se identificaron inicialmente en la leucemia mieloide aguda [5], pero recientemente se ha informado de existir en una amplia variedad de cánceres, incluyendo cáncer gástrico [6]. La identificación de marcadores de CSC puede abrir una nueva perspectiva terapéutica sobre la base de la orientación selectivamente esta pequeña población de células [7], [8]. Recientemente, se ha informado de que los CAC hacer posiblemente expresar sus propios marcadores únicos, tales como aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], y CD133 [12]. Sin embargo, muchos de los marcadores publicados no son exclusivos de los CAC. Cuantitativa de perfiles de expresión de proteína permite la identificación eficiente de los valores de expresión diferencial precisas y reproducibles de las proteínas [13]. etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) en combinación con cromatografía líquida multidimensional (LC) y espectrometría de masas (LC-MS /MS) análisis está emergiendo como una metodología de gran alcance en la búsqueda de biomarcadores tumorales [14]. Hemos informado anteriormente de que las células de la población lateral (SP) son capaces de auto-renovación y producen células no-SP, y que las células cancerosas en fracciones SP poseen un alto potencial de tumorigenicidad, metástasis a distancia [3], y la quimio-resistencia [2]. Esto sugiere que las células de cáncer gástrico SP poseen propiedades similares a las células madre del cáncer. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue detectar una novela CSC marcador (s) de cáncer gástrico mediante la comparación de los proteomas entre células madre y células madre SP similares a células que han sido conocidos por poseer una rica población CSC [15].
Materiales y Métodos
Cultivos celulares
Dos líneas celulares de cáncer gástrico, OCUM-2MD3 [16] y OCUM-12 [17], se utilizaron en este estudio. Estas líneas celulares se derivan de cáncer gástrico de tipo difuso. La condición de cultivo se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Nikken, Kyoto, Japón) con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penicilina y estreptomicina y piruvato de sodio 0,5 mM, y se incubaron a 37 ° C. líneas celulares /SP OCUM-12 /SP y OCUM-2MD3 eran células SP que fueron evaluados por un análisis de citometría de flujo utilizando Hoechst 33342 de sus líneas de células matrices, OCUM-2MD3 y OCUM-12, respectivamente. Ordenando se realizó tres veces para establecer una población estable de células SP-enriquecido. Después de un período de tres meses de incubación después de la clasificación, OCUM-12 /SP células (6,5%) y las células /SP OCUM-2MD3 (12,2%) seguían representando un alto porcentaje de la fracción SP, en comparación con los padres OCUM-12 (3,2% células) y OCUM-2MD3 (6,3%) (Figura S1). Posteriormente, estas células SP-enriquecida con una población estable eran las líneas celulares utilizadas para el análisis, como se informó anteriormente [18].
muestras de tejido humano y de información del paciente
Las muestras de tejido se obtuvieron a partir 300 pacientes diagnosticados con cáncer gástrico operaciones permitidas en la Universidad de la ciudad de Osaka. La Tabla 1 muestra las características clínico-patológicas de los 300 pacientes con cáncer gástrico. Había 208 hombres y 92 pacientes de sexo femenino, con una edad mediana de 64 años (rango, 28-85 años) en el momento de la operación. Los diagnósticos fueron confirmados por al menos dos personas. En escena se determina de acuerdo con la clasificación japonesa de carcinoma gástrico (14
ª edición) [19]. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de la ciudad de Osaka (Osaka, Japón). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del donante para el uso de esta muestra en la investigación.
Identificación y cuantificación de proteínas por QSTAR Elite LC-MS /MS
Las células cancerosas (60 mg cada una ) se homogeneizaron y después se lisaron usando 100 l de tampón de T-PER de lisis (Thermo Scientific) o 500 l de urea 9 M, y tampón de lisis CHAPS 2% con un inhibidor de la proteasa. Posteriormente, el lisado de células se trató entonces por ultrasonidos. Después de precipitación con acetona, concentraciones de proteína se midieron mediante ensayo de proteína BCA (Pierce, IL, EE.UU.). Reducción, la alquilación, la digestión, y la posterior etiquetado péptido de 50 g de proteína para cada muestra se realizaron utilizando el Kit AB Sciex iTRAQ Reactivo Multi-Plex (AB Sciex, Concord, ON, Canadá) [20]. Las muestras marcadas con iTRAQ se cargaron en un cartucho de intercambio catiónico ICAT (AB Sciex). Los péptidos se eluyeron como seis fracciones (1 ml de solución de KCL de 10, 50, 70, 100, 200, y 350 mM), y el sobrenadante de cada se evaporó en una centrífuga de vacío. Las muestras fueron luego desalada y se concentraron usando cartuchos Sep-Pak Light C18 (Waters Corporation, Milford, MA), se evaporó en una centrífuga de vacío, se resuspendió en 20 l de 0,1% (v /v) de ácido fórmico, y, posteriormente, aplicar sobre QSTAR Elite LC -MS /MS. Cada muestra se realizó durante 150 minutos. los datos de MS /MS se registraron en contra de la base de datos Swiss Protein (humano) usando el software ProteinPilot (versión 2.0, AB Sciex) con tripsina establecer como la enzima digestión y methanethiosulfinate metilo como la modificación de cisteína. Con el fin de eliminar los accesos redundantes y cuantificación comparativa, los resultados de búsqueda obtenidos fueron procesados adicionalmente por software ProteinPilot usando el algoritmo Paragon. Esto dio como resultado el conjunto mínimo de proteínas identificadas justificables. Todos los datos reportados se utilizó con un límite de corte de 95% de confianza. Cuantificación relativa de los péptidos se calcula como una relación dividiendo la intensidad reportero iTRAQ. Las proporciones de los péptidos que apoyan la existencia de una proteína se promediaron para la cuantificación relativa de proteínas. A partir de entonces, se realizó el análisis y análisis ProteinPilot vía Ingenio (IPA) (Sistema de Ingenuity, Mountain View, CA). Después de realizar una prueba t simple en una de las proporciones de proteínas promediados calculados contra 1 para evaluar la validez de los cambios de expresión de proteínas, se reportó un valor de p. proporciones de proteínas con un valor de p inferior a 0,05 se consideraron fiables. Es necesario saber que en el 90% de las corridas experimentales iTRAQ hecho anteriormente, las desviaciones estándar de las proporciones de proteínas, que se derivan de las variaciones técnicas, se informó a ser inferior a 0,3. Por lo tanto, la expresión cambia superior a 1,2 veces o menos de 0,8 veces de los niveles de expresión normalizados fueron consideradas para estar fuera del rango de variabilidad técnica. También se realizó un análisis no marcado, y se detecta la presencia de proteínas sólo dentro OCUM-12 células /SP y células /SP-OCUM 2MD3, pero no dentro de las células de los padres [21]. Cada muestra se ejecuta dos veces. El aplicada LC-MS /MS examen junto con la tecnología iTRAQ se han reportado como un método cuantitativo fiable para la expresión de proteínas, siendo aún más sensible que la transferencia de western que depende del tipo de anticuerpos aplicadas [22].
IPA y selección de candidatos proteínas
la base de datos IPA se utiliza principalmente en el campo de la ontología de propiedad, que contiene hasta 300.000 artículos biológicos, incluidos los genes, las proteínas moleculares y procesos celulares. Por lo tanto, IPA se empleó para el análisis de proteína molecular funciones, localización. Además, se obtuvo información detallada con respecto a las funciones y localizaciones celulares de las proteínas identificadas. Basado en los resultados de LC MS /MS y análisis de IPA, proteínas que se observaron a ser sobre-expresado en SP líneas celulares, en comparación con su correspondiente frecuencia de expresión de los padres líneas celulares, fueron seleccionados como candidatos a biomarcadores de células SP de cáncer gástrico. La identificación de las redes de interacción de proteínas, así como grupos funcionales y las vías se generó por el IPA, y el análisis depende de las asociaciones previamente caracterizados.
Cuantitativo en tiempo real de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR ) guía
células de cáncer gástrico fueron cultivadas. Y el ARN celular total se extrajo utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). El ADNc se preparó a partir de 2 g de ARN usando cebadores aleatorios (Invitrogen). Para determinar los cambios veces en cada gen, RT-PCR se realizó en el ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), con ensayos de expresión de genes disponibles comercialmente (Applied Biosystems) para
RBBP6
(
la unión de proteínas de retinoblastoma 6
; Hs00544663),
hspa4 gratis (
proteína de choque térmico 70 kDa 4
; Hs00382884),
HSPA9 gratis (
de choque térmico 70 kDa 9
; Hs00269818),
GLG1 gratis (1 glicoproteína de Golgi; Hs00939452),
DCTPP1 gratis (
dCTP pirofosfatasa 1