Extracto
Una disminución en la tasa de mortalidad casi el cincuenta por ciento de cáncer oral se necesita con urgencia . Las mejoras en el diagnóstico precoz y tratamientos preventivos más eficaces podrían afectar a tal disminución. Con este fin, se realizó por primera vez un estudio de la proteómica en profundidad de masas basado en la espectrometría de escopeta cuantitativa de forma no invasiva recogidos biopsias cepillo orales. Se compararon las proteínas aisladas de biopsias de pincel a partir de tejido normal y sano, tejido lesión premaligna orales (OPMLs), el carcinoma oral de células escamosas (COCE) y el tejido de control emparejado. En los conjuntos de datos proteómicos replicados, la proteína secretora inhibidor de la proteasa de leucocitos (SLPI) se destacó en función de su disminución en la abundancia en ambos tejidos y OPML lesión CCCA en comparación con el tejido normal sano. Western Blot en muestras de biopsia de peinado adicionales confirmó una tendencia gradual de la disminución de la abundancia SLPI entre el tejido normal y saludable OPML, con una disminución mayor en tejido de la lesión OSCC. Se observó una disminución similar SLPI
in vitro
comparando modelo OPML y líneas celulares CCCA. Además, las células exfoliadas orales en toda la saliva de los pacientes mostraron una pérdida de SLPI correlacionado con la progresión del cáncer oral. Estos resultados, combinados con los datos de la proteómica que indica una disminución en SLPI en emparejado tejido de control sano de pacientes CCCA comparación con el tejido a partir de tejido normal y saludable, sugirió una disminución sistémica de SLPI en células orales correlacionadas con el desarrollo del cáncer oral. Por último,
in vitro
experimentos mostraron que el tratamiento con SLPI disminuye significativamente la actividad de NF-kB en una línea celular OPML. Los resultados indican una actividad anti-inflamatoria en OPML, el apoyo a una función mecánica de SLPI en la progresión del CCCA y sugiriendo su potencial para el tratamiento preventivo de las lesiones orales en situación de riesgo. En conjunto, nuestros resultados muestran por primera vez el potencial de SLPI como un biomarcador basado en el mecanismo, no invasivo de la progresión del cáncer oral con potencial en el tratamiento preventivo
Visto:. Yang Y, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz BRK, Chen X, Zhu Y, et al. (2014) Análisis Cuantitativo proteómico de Cepillo Oral biopsias Identifica secretora de leucocitos inhibidor de la proteasa como un prometedor biomarcador del cáncer oral Mecanismo-base. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10.1371 /journal.pone.0095389
Editor: John M. Koomen, Moffitt Cancer Center de los Estados Unidos de América
Recibido: 3 Enero, 2014; Aceptado: March 25, 2014; Publicado: 18 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1R01DE017734 de los Institutos nacionales de Salud (EUA) al TJG y becas de investigación 81000439 y 81271134 de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China a Y.Y. y Y.Z. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
por desgracia, la tasa de supervivencia para las personas diagnosticadas con cáncer oral, predominantemente en forma de carcinoma oral de células escamosas (COCE), es sólo ligeramente mejor que el 50% [1]. OSCC es precedida por la aparición de una lesión premaligna oral, comúnmente leucoplasia, que transforma a cáncer invasivo en 5% a 17% de los casos [2], [3]. Si se diagnostica a tiempo, los tratamientos preventivos son más eficaces, lo que aumenta la tasa de supervivencia de 80% o mejor [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejores formas de diagnosticar y tratar OPML en situación de riesgo y /o en fase inicial CCCA lesiones orales [2].
biopsia por incisión invasiva seguido por histopatología es el actual estándar de oro para la administración oral diagnóstico de cáncer [5]. Desafortunadamente, tiene numerosas limitaciones. La naturaleza invasiva y costosa conduce a pruebas de menos frecuentes de lesiones sospechosas, y, en consecuencia, un retraso en el diagnóstico de CCCA [6], [7]. Un estudio retrospectivo encontró sólo una tasa de seguimiento del 14% de las biopsias de bisturí en un plazo [2] 3 años. Además, la biopsia bisturí es propenso a la sub-muestreo de las lesiones [8], [9], lo que conduce a errores en el diagnóstico
.
Teniendo en cuenta estas limitaciones de la biopsia bisturí, se ha prestado mucha atención a la identificación de biomarcadores moleculares indicativa de la enfermedad en muestras de pacientes no invasiva recogidos [10]. Un método de muestreo no invasivo prometedor es el uso de biopsias de cepillo [11], [12]. Aquí, un cepillo relativamente rígido se utiliza para recoger suavemente una muestra de células trans-epiteliales directamente de la lesión oral, o coincide mucosa oral. Esta colección es simple y barato, con las mínimas molestias para el paciente. Lo más importante es que ofrece una muestra potencialmente rico en información de las células directamente de la lesión que puede ser analizada más [11], [12].
Para desarrollar biomarcadores moleculares de forma no invasiva recogidos a partir de biopsias de pincel, con la promesa moléculas candidatas dentro de estas muestras primero se debe identificar. tecnologías a gran escala de perfiles moleculares (por ejemplo, genómica, la proteómica) pueden identificar tales candidatos. En particular, el uso de análisis de proteómica basada en la espectrometría de masas podrían proporcionar no sólo conduce sobre los biomarcadores de proteínas viables de estas muestras, sino que también subyace el conocimiento de los mecanismos de progresión del cáncer y las posibles dianas para el tratamiento. Sin embargo, el análisis proteómico de biopsias orales cepillo a través de la proteómica basadas en MS ha visto una atención limitada [13], [14], especialmente el uso de las tecnologías más actuales en el campo. Hasta la fecha, nadie ha aplicado la proteómica cuantitativa basados en MS escopeta, sin duda el más versátil y método en profundidad para que caracterizan proteomas [15], para el análisis de biopsia por cepillado bucal.
En este estudio, se han aplicado cuantitativa proteómica escopeta MS-basa en el análisis de biopsias de cepillo recogidos de los tejidos sanos normales, OPML y OSCC. Entre una serie de proteínas replicados que muestran diferencias de abundancia, la proteína secretora inhibidor de proteasa de leucocitos (SLPI) mostró dramática disminución relativa a los tejidos normales correlacionados con las etapas de la progresión del cáncer oral. Esta disminución de la abundancia de SLPI se verificó a través de Western Blot en muestras de biopsia de cepillo, y también se observó en células exfoliadas en toda la saliva de pacientes OPML y CCCA. En consonancia con los resultados del paciente, las líneas celulares de modelo y OPML CCCA también mostraron una disminución en SLPI. Además, el tratamiento de una línea celular OPML modelo con SLPI mostró una inhibición de la actividad de NF-kB, un factor de transcripción conocido por desempeñar un papel en los mecanismos inflamatorios de desarrollo cáncer oral subyacente. En conjunto, nuestros resultados muestran por primera vez una pérdida progresiva de SLPI abundancia en la transición de la OPML a OSCC, y sugieren un nuevo papel para SLPI como un biomarcador mecanismo ligado, no invasivo de cáncer oral, con un potencial como un tratamiento OPML agente.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
el estudio se realizó con el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de muestras utilizando un protocolo sujeto humano aprobado por la Junta de Revisión Institucional la Universidad de Minnesota (IRB estudio número 0001M34501). Todas las colecciones de saliva se realizaron sin estimulación a través de babeo pasiva, durante el día entre las horas de 9:00 am y 5:00 pm. Toda la saliva y el cepillo biopsias se obtuvieron de 11 pacientes diagnosticados con un OPML displásicas y 11 pacientes con COCE en la Universidad de Minnesota clínica de otorrinolaringología. Para cada paciente, se recogieron muestras de saliva primera, seguida de la recogida de las biopsias de cepillo de la lesión y la mucosa sana de la correspondiente zona contralateral, utilizando cepillos Rovers Orcellex (Rovers Medical Devices B.V., Países Bajos). biopsias de cepillo de la mucosa oral, y toda la saliva también se recogieron a partir de 10 voluntarios sanos. Los voluntarios sanos no tenían factores de riesgo importantes para la CCCA (los no fumadores, uso moderado a bajo contenido de alcohol) y estaban libres de lesiones orales. Inmediatamente después de la recolección, las muestras se almacenaron a -20 ° C, y después se transfirieron a -70 ° C hasta su uso. Por otra parte, se recogió información sobre el tabaco y el alcohol de los pacientes. Las características de la población de estudio se resumen en la Tabla S1.
Líneas Celulares
células MSK Leuk1 [16], que se cultiva a partir de la mucosa bucal adyacentes a las lesiones de leucoplasia oral, fueron un regalo del Dr. Peter Sacks, Universidad de Nueva York. células MSK Leuk1 se cultivaron en KGM-2 Medio (Lonza Walkersville, MD) suplementado con extracto de pituitaria bovina, factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, insulina humana recombinante, hidrocortisona, epinefrina, y transferrina a 37 ° C en 5% de CO
2
.
Transformado queratinocitos epidérmicos humanos (Rhek) inmortalizadas por el virus Ad-12 de SV40 [17] se obtuvieron del Dr. S. Rhim Jhong en el Instituto Nacional del cáncer, (Frederick, MD). La línea celular CCCA CA-9-22 [18], fue un regalo de Toshio Kuroki, MD. Las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% de suero fetal bovino, L-glutamina (5,8 mg /ml), y penicilina /estreptomicina (50 mg /ml) a 37 ° C en 5% de CO
2 como adherente cultivos en monocapa.
cepillado Preparación de muestras de biopsia
Para los estudios de descubrimiento proteómicos basados en MS y estudios de validación de transferencia Western, las muestras de biopsia de cepillo de la caída de los sujetos en los dos grupos se prepararon de forma idéntica. Con el fin de maximizar la recuperación de los péptidos y reducir al mínimo los pasos de manipulación de muestras, se utilizó un método de digestión "on-cepillo" para producir una solución de péptidos para el análisis de proteómica basada en MS (véase la figura 1A en la sección Resultados). La cabeza del cepillo se sumergió y se lisaron en 50 mM de Tris pH 8.0 con 2% de SDS a 95 ° C durante 10 min con agitación intermitente. Los restos celulares se eliminó por centrifugación a 16 100 x g y recuperar el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio. recuperación de proteína se midió usando el ensayo BCA (Thermo Scientific). Las proteínas recuperadas fueron digeridos y procesados para el análisis de espectrometría de masas posterior o utilizarse para la validación de transferencia de western.
A. Colección del cepillo de la biopsia y el protocolo de preparación de la muestra. B. diseño experimental para experimentos cuantitativos proteómica basadas en MS. En un experimento se utilizó el tejido emparejado de pacientes OPML, mientras que el segundo experimento utilizó igualada tejidos de pacientes con COCE.
isobárica Péptido Etiquetado y preparación de muestras de
Las proteínas de las células peinado se redujeron en la TDT para 1 h a 55 ° C y tripsina digerido usando un protocolo modificado FASP [19]. Yodoacetamida se utilizó como reactivo de cisteína alquilante. Los péptidos resultantes se desalaron usando cartuchos de extracción en fase sólida (TC18 Sep-Pak, Waters). Los péptidos se disolvieron en el tampón suministrado por el fabricante y se marcaron con iTRAQ reactivo (Applied Biosystems) a temperatura ambiente durante 1 h y se desalaron con cartuchos Sep-Pak.
Las muestras fueron los siguientes fraccionado por fuera de línea HPLC semipreparativa. Los péptidos marcados, iTRAQ-combinados se resuspendieron en tampón A (10 mM de formiato de amonio pH 10 en 98:2 agua: acetonitrilo) y fuera de línea fraccionada por alto pH C18 de fase inversa (RP) cromatografía [20]. Un MAGIC 2002 HPLC (Michrom Biorecursos, Inc., Auburn, CA) se utiliza con una columna C18 Gemini-NX, 150 mm x 2 mm de diámetro interior, 5 um de partículas, 110 tamaño de un poro (Phenomenex, Torrence, CA). Tampón A era formiato de amonio 10 mM, pH 10 en 98:2 agua: acetonitrilo y tampón B era formiato de amonio 10 mM, pH 10 en 10:90 de agua: acetonitrilo. El caudal fue de 150 l /min. con un gradiente de 0 a 35% de tampón B durante 60 min., seguido de 35 a 60% durante 5 min. Las fracciones se recogieron cada 2 minutos y la absorbancia UV se monitorizó a 215 nm y 280 nm. Las fracciones que contienen péptidos se dividieron en dos grupos iguales numerados, "temprano" y "tarde". La primera fracción "temprana" se concatena con la primera fracción "tarde", y así sucesivamente. concatenados muestras se secaron a vacío, se volvieron a suspender en el disolvente de carga (98:2:0.01, agua: acetonitrilo: ácido fórmico). antes del análisis de espectrometría de masas
Análisis de espectrometría de masas
Una trampa de iones lineal se utilizó -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) instrumento Velos (Thermo Fisher Scientific) [21] para la espectrometría de masas. El instrumento se hizo funcionar en un modo dependiente de los diez primeros datos empleando escaneos de la encuesta a 30.000 resolución 300-1800 m /z. exploraciones Tandem MS (MS /MS) se adquirieron con una anchura de aislamiento de m z y el modo de fragmentación 2 /mayor energía de disociación colisional (HCD). 40% energía de colisión normalizada se utilizó con una duración de 20 milisegundos. Los ajustes automáticos de control de ganancia eran 3 × 10
5 iones en la trampa de iones, y 1 × 10
6 en la Orbitrap. dinámica de exclusión se utilizó con una duración de 15 segundos y un número de repetición de 1.
Identificación y cuantificación de proteínas
Los archivos binarios se convirtieron a mzXML usando msconvert (distribuido como parte de ProteoWizard 06/01/1260) . MS /MS espectros se registraron en contra de la base de datos humana Uniprot incluyendo secuencias revueltos y proteínas contaminantes comunes (un total de 136,002 entradas) utilizando Sequest v27.0. parámetros de búsqueda incluyeron un (unidades de masa atómica) precursor de 1,6 amu y 0,8 amu fragmento de tolerancia de masa, 2 perdidas divisiones, especificidad tripsina parcial, modificaciones fijos de cisteína carbamidometilado, modificación iTRAQ reactivo a lisinas y N-terminales, y la variable modificación de la oxidación de la metionina. Resultados de la búsqueda se filtraron a 99% de probabilidad de proteínas y 95% de probabilidad péptido en Andamios (v3.3.1, Proteoma Software), produciendo una tasa de falso descubrimiento de 1%. Las proteínas se cuantificaron utilizando software personalizado desarrollado internamente [22]. Sólo las proteínas identificadas a partir de dos o más espectros MS /MS adaptado a péptidos se consideraron para el análisis cuantitativo. Los valores de P fueron asignados a cada proteína cuantificada por tres o más espectros MS /MS, como se describe [22]. Tabla S2 muestra toda la información para las proteínas identificadas y cuantificadas en estos experimentos.
Western Blot experimentos
Para los experimentos de Western Blot, se utilizó un conjunto independiente de muestras debido a la falta de material de muestra del primer conjunto de muestras utilizadas en los experimentos proteómicos basados en MS. Treinta microgramos (ug) de proteína cepillo biopsia de cada sujeto individual analizada en experimentos de validación, o cincuenta ug de proteína de lisados de células de líneas de células, a lo largo de treinta ug de proteína de control positivo, se separaron por 12% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore), y se sondaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-SLPI (1:250; Abcam ab46763). Las transferencias se marcaron con rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (1:10,000) y se visualizaron con un sistema de detección ECL (Thermo Scientific)
.
En el caso de toda la saliva, las muestras no fueron recogidos de un conjunto independiente de sujetos (4 voluntarios sanos, pacientes con OPML 5 y 5 casos de CEI primaria). Toda la saliva se centrifugó a 3000 × g a 4 ° C, se recogió el sobrenadante que contiene la fracción soluble de proteínas de la saliva, y los sedimentos de células se lavó con PBS y se lisaron para obtener proteínas celulares. La proteína total se cuantificó usando el ensayo BCA (Pierce Thermo).
gen reportero ensayos
Las líneas celulares se cultivaron en placas a 50.000 células /pocillo en placas de 12 pocillos y transitoriamente cotransfectadas a través de transporte expreso Reactivo (MirusBio, Madison, WI) con un pIgκB-Luc reportero plásmido del gen 24 horas más tarde junto con un reportero pCMV Lac-Z que contiene el promotor CMV y el gen Lac-Z en pcDNA3 para ajustar la eficiencia de transfección. La construcción de reporte pIgκB-Luc contiene tres cadena de inmunoglobulina G-κ NF-kB sitios que impulsan el gen de la luciferasa de unión y fue proporcionado amablemente a nosotros por el Dr. K. Brown (NIAID, NIH). Después de la transfección durante la noche, las células fueron tratadas con SLPI recombinante humana (amp I +; D systems, Minneapolis, MN). Los lisados celulares se analizaron a través de Tropix Dual Luz gen reportero de ensayo (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) en un luminómetro inyección dual flash de Tristar (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Nueve réplicas se midieron por punto de datos.
Resultados
Perfilado Oral progresión del cáncer asociado a la dinámica de proteínas a través de la proteómica cuantitativa basados en MS
Dos rondas de proteómica cuantitativa basados en MS eran empleada (Figura 1B), usando etiquetado péptido isobárico con el reactivo iTRAQ [23] para analizar proteínas solubles aislados de lisados de células enteras a partir de muestras de biopsia de cepillo orales. Las primeras mezclas de proteínas separadas en comparación agrupados de dos tejidos OPML, dos tejidos de control OPML emparejados, dos tejidos CCCA y dos tejidos normales sanos. La segunda mezclas de proteínas separadas en comparación agruparon de cuatro tejidos OPML, cuatro tejidos CCCA, cuatro tejidos de control CCCA emparejados y cuatro tejidos normales sanos. El diseño de la muestra fue determinada principalmente por la disponibilidad de muestras clínicas, la cantidad de proteína disponible de cada biopsia por cepillado y nuestro objetivo de comparar todos los diferentes tipos de tejidos disponibles. Se identificaron un total de 643 y 1164 proteínas y cuantificado, para el primer y segundo análisis y iTRAQ respectivamente. El mayor número de proteínas identificadas en el segundo análisis era más probable debido al aumento de la proteína total debido a la puesta en común de muestras de pacientes más en comparación con el primer análisis. Tabla S2 muestra la información sobre todas las proteínas identificadas y cuantificadas en estos experimentos.
Para dar prioridad a las proteínas de validación de los experimentos posteriores, nos fijamos en los cambios de abundancia de tejidos OPML o CCCA en comparación con los tejidos normales de control sanos en cada experimento iTRAQ. Hemos limitado aún más estos resultados mediante la búsqueda de sólo aquellas proteínas que mostraron diferencias de abundancia relativa constantes en ambos experimentos iTRAQ. Un total de 21 y 15 proteínas cumplen estos criterios para OPML y OSCC tejidos, respectivamente (Tabla 1). A pesar de los fenómenos reconocidos de compresión razón de abundancia debido a la interferencia de precursores en los estudios basados en péptidos de marcaje isobárico [24], [25], se observó una serie de grandes cambios en lugar de abundancia relativa (& gt; 2 veces) en nuestro estudio. Curiosamente, sólo tres de estas proteínas mostraron cambios de abundancia en ambos tipos de tejidos (OPML y CCCA) en comparación con los sanos (texto en negrita en la Tabla 1) normal.
De esas proteínas que se muestran en la Tabla 1, el secretora leucocitos inhibidor de la proteasa (SLPI), se destacó en base a su gran disminución en ambos tejidos y OPML CCCA, en comparación con los normales sanos (19,5 y 12,4 descenso medio abundancia de tejidos y OPML CCCA, respectivamente). Sobre la base de estos hallazgos, y el papel del SLPI conocido como un inhibidor de la proteasa con conexiones con el cáncer oral [26], hemos elegido para validar e investigar esta proteína. Con este fin se interrogaba primera aún más los datos cuantitativos proteómica en SLPI. Destacan los resultados del segundo experimento iTRAQ que incluía la CCCA tejido de control sanos de la misma. Los resultados mostraron que no sólo era SLPI disminuyó en el tejido de la lesión OSCC en comparación con las normales sanas, sino que también se redujo en el tejido sano emparejado en comparación con los tejidos normales sanos (Figura 2). Una disminución relativamente pequeña también se observó en el primer experimento iTRAQ entre el tejido emparejado de pacientes OPML y tejidos normales sanos (Tabla S2).
Validando la progresión del cáncer dependientes de la dinámica de la abundancia de SLPI en muestras independientes
con el fin de validar la disminución de la abundancia observada de SLPI en tanto OPML y tejidos CCCA, primero perseguidos Western Blot experimentos semi-cuantitativos en muestras de biopsia de cepillo adicionales. Como se muestra en la Figura 3A, las transferencias de Western confirmaron los resultados basados en MS, tal como SLPI abundancia mostró una disminución gradual entre el tejido normal y el tejido sano OPML, con una disminución más dramática en los tejidos CCCA. Figura S1 muestra los resultados de control de carga a través de la tinción de la proteína total de las membranas utilizadas para los resultados que se muestran en la Figura 3. Además, se recogieron muestras de saliva entera estimulada-un de los mismos pacientes que dieron su consentimiento para cepillar las biopsias. Se aislaron las células exfoliadas en estas muestras a través de centrifugación y se sondearon las proteínas aisladas de SLPI después de la lisis celular. Los resultados mostraron una tendencia similar en la disminución de la abundancia SLPI entre los tejidos normales y saludables tanto OPML y tejidos CCCA (Figura 3B). Análisis de las proteínas solubles contenidas en sobrenadantes de saliva mostró una tendencia menos consistente (datos no mostrados).
A. Verificación de SLPI disminuye en los tejidos recogidos por biopsia por cepillado. los niveles de abundancia B. SLPI medidos en células de descamación de toda la saliva. los niveles de abundancia C. SLPI miden en líneas celulares modelo. control positivo es una muestra de saliva humana normal y saludable; Rhek células son de una línea de células epiteliales normales, MSK es un modelo de línea celular OPML (MSK-Leuk1) y CA9-22 es una línea de células modelo COCE.
también la abundancia de la prueba de la proteína SLPI en OPML modelo y las líneas celulares CCCA (Figura 3C). A continuación, se optó por comparar las proteínas solubles aislados a partir de lisados de células enteras de células RHEK de control, las células MSK-leuk1 (una línea celular modelo de OPML [27]) y células Ca9-22 (una línea celular modelo de CCCA [28]). Similar a los resultados de las biopsias cepillo paciente, se observó una disminución dramática en el SLPI en las líneas celulares Ca9-22 MSK-leuk1 y en comparación con las células control sanas.
Una prueba de potenciales efectos anti-inflamatorios de Tratamiento de SLPI OPMLs
el papel de la activación y regulación de los factores pro-inflamatorios en el mecanismo de transición de la OPML al CCCA que subyace a NF-kB es bien conocido [29], [30], [31]. La evidencia que demuestra que existe SLPI inhibe NF-kappa B [32], [33], aunque esto no se ha demostrado en modelos de cáncer oral. Ante esta evidencia, hemos tratado de investigar si o no SLPI disminuye la actividad de NF-kB en las células MSK-Leuk1, usando un ensayo indicador de luciferasa basado en [34]. Se han tratado las células MSK Leuk1 transfectadas con dos concentraciones diferentes de péptido SLPI puro (20 ug /mL y 40 ug /ml), y se midió NF-kappa B en diferentes momentos después del tratamiento (Figura 4). Resultados para ambos tratamientos fueron comparables, con ambos mostrando aproximadamente una caída de 40% en NF-kappa B después de 24 horas de tratamiento SLPI. El tratamiento con una menor cantidad de SLPI (10 ug /ml) mostraron una disminución más pequeña y menos fiable en la actividad de NF-kB (datos no mostrados).
veces el cambio de un NF-kB del gen reportero de ensayo en relación con control del vehículo se representa en diferentes puntos de tiempo después del tratamiento.
Discusión
Hemos llevado a cabo una primera de su tipo, un análisis en profundidad de escopeta proteómica cuantitativa de forma no invasiva recolectaron muestras de biopsia de cepillo orales, buscando identificar los cambios de abundancia de proteínas asociadas con la progresión del cáncer oral. biopsias de pincel son bien conocidos por su valor como una muestra celular de forma no invasiva recogido para aplicaciones de diagnóstico de cáncer oral, [11], [12]. Sin embargo, los estudios proteómicos basados en MS que se aprovechan de estas muestras potencialmente ricas en información han sido limitadas. En particular, Driemel et al [13] utiliza desorción /ionización por láser mejorada en superficie (SELDI) MS al perfil cuantitativamente muestras de biopsia de cepillo e identificar potenciales biomarcadores de progresión. Remmerbach et al [14] utiliza más estándar MALDI-MS para analizar las proteínas aisladas de biopsias de cepillo. Aunque estos estudios tenido cierto éxito, el uso de un SELDI o métodos basados en MALDI en mezcla compleja se limita a un subconjunto de proteínas y /o péptidos relativamente pequeños en las muestras de interés.
Proteómica escopeta basado en MS
por otro lado ofrece una vista ampliada de proteomas cepillo de biopsia, dada su capacidad para identificar y cuantificar las proteínas de todas las clases de peso molecular [15]. Nuestro estudio proporciona la primera demostración de la proteómica escopeta aplicados a las muestras de biopsia de cepillo orales. Una pregunta al comienzo de este estudio era si las células recogidas a través de la biopsia por cepillado proporcionarían suficiente proteína total para un análisis proteómico a gran escala. Hemos encontrado que un método de lisis de las células en cepillo proporciona mejor rendimiento (al menos decenas de microgramos de proteína total) de intentar lavar células libres del cepillo antes de la lisis (datos no mostrados). Nuestros hallazgos deberían abrir el camino para la proteómica escopeta análisis adicionales de las biopsias de cepillo para la caracterización de las lesiones orales en diferentes contextos.
Nuestro análisis repetidos comparar el tejido normal saludable para OPML y COCE tejidos, así como controles de la misma, puesto de manifiesto una serie proteínas de interés que muestran los cambios en la abundancia. Aunque se identificaron otros candidatos dignos de una validación adicional, se optó por centrarse en SLPI, dada su gran disminución en la abundancia y reproducible en ambos tejidos y OPML CCCA, en comparación con el tejido normal sano. Los investigadores han reconocido tradicionalmente el papel de SLPI en la inhibición de proteasas de serina; Sin embargo, el conocimiento de las funciones que han seguido ampliando para incluir a los antimicrobianos, la inmunidad y las funciones anti-inflamación [35]. El papel de SLPI en la progresión del cáncer oral es menos conocido, sin embargo, recientes resultados en rodajas de tejido de biopsia demostraron una disminución de SLPI en los tejidos en comparación con CCCA saludable, así como un papel potencial en la inhibición de la invasividad [26].
Nuestra estudio ha revelado varios nuevos hallazgos sobre el posible papel de SLPI en el cáncer oral. Por un lado, nuestros resultados son los primeros en demostrar una caída significativa en SLPI en muestras de biopsia de cepillo orales recogidos de forma no invasiva, así como la fracción celular de toda la saliva. Estos resultados son consistentes con los resultados recientes que muestran una disminución de la abundancia SLPI en cortes de tejido CCCA recogidos a través de la biopsia bisturí tradicional [26]. Es importante destacar que nuestro estudio es el primero en examinar tanto OPML y tejidos CCCA, lo que demuestra una pérdida progresiva de SLPI en el estado pre-maligno, seguido de una disminución más dramática OSCC. Nuestros resultados sugieren un posible papel de SLPI como un biomarcador de diagnóstico o pronóstico de forma no invasiva recogido en cualquiera de los tejidos OPML o CCCA - un hallazgo significativo, dada la urgente necesidad de pruebas más sencillas y baratas para el cáncer oral que evitan los inconvenientes de la biopsia bisturí [8] , [9].
Nuestros resultados también sugieren un papel mecanicista de SLPI en la progresión del cáncer oral. Recientes hallazgos utilizando
in vitro
cultivo celular han sugerido que el SLPI inhibe la capacidad de invasión de las células cancerosas orales [26]. La extensión de estos hallazgos, nuestros resultados sugieren una disminución sistémica en SLPI, al menos en las células epiteliales orales, en pacientes susceptibles al desarrollo de cáncer oral. Esta afirmación fue apoyada por una disminución de 5 veces en SLPI en el tejido sano emparejado en comparación con los controles normales sanos, con una disminución concordante en su abundancia en las células exfoliadas en la saliva conjunto. La determinación de la base (por ejemplo, genética, epigenética, etc.) para esta pérdida global de SLPI abundancia en pacientes que desarrollan CCCA se necesitará más investigación.
Nuestros resultados demuestran que el SLPI inhibe la actividad transcripcional de NF-kB in vitro en células OPML además apoya su función mecánica en la progresión del cáncer oral. Aumento de la actividad transcripcional de NF-kB, activar la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, es un factor bien conocido en el desarrollo CCCA [29], [30], [31]. Una disminución en la abundancia SLPI puede, al menos en parte, ser un factor que contribuye al estado pro-inflamatorio que conduce a CCCA. Otros han demostrado un papel para SLPI como un inhibidor de la actividad de NF-kB, lo que demuestra que puede interrumpir la vía de señalización que conduce la activación de NF-kappa B [36] y /o posiblemente competir por la unión al ADN en los sitios de regulación de NF-kB [32 ]. Nuestro estudio es el primero en mostrar SLPI como un inhibidor de NF-kB en el contexto del cáncer oral, concretamente en una línea celular OPML modelo. La comprensión del mecanismo exacto de la inhibición se necesitará más investigación. Nuestra observación abre la posibilidad intrigante de SLPI como una opción de tratamiento para las lesiones OPML en situación de riesgo, ya que dichos tratamientos se necesitan con urgencia para prevenir el desarrollo de CCCA invasivo. SLPI ofrece posibles ventajas de esta aplicación, ya que es una proteína pequeña (aproximadamente 11 kDa), que se sabe libre de modificaciones post-traduccionales, y ha demostrado ser absorbidos por las células fácilmente [32].
nuestros resultados generan una serie de hipótesis intrigantes para las pruebas en el futuro. Por un lado, la posibilidad de SLPI como un biomarcador de diagnóstico o pronóstico de forma no invasiva recogida podría ser probado en cohortes más grandes de pacientes OPML y CCCA. Su papel como un inhibidor de NF-kB en OPML, con potencial para el tratamiento preventivo podría ser probado y investigó en formas numéricas. Los experimentos que examinan la naturaleza de la inhibición directa, como en los sitios de unión de NF-kappa B, y los efectos sobre expresión génica y proteica se iluminan. Probando versiones truncadas de SLPI también pueden mostrar un aumento de efectos inhibitorios sobre NF-B debido a una mejor absorción y /o de unión al ADN celular. En una nota final de interés, la evidencia reciente también sugiere un papel para SLPI en la inhibición de la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y el posterior desarrollo del cáncer de cabeza y cuello [37]. Investigación sobre efectos del tratamiento SLPI a las células de HPV + cáncer sería de gran interés. Los resultados que presentamos aquí proporcionan un punto de partida para las investigaciones futuras, lo que podría solidificar SLPI como una proteína de gran valor en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer oral.
Los datos proteómicos de espectrometría de masas se han depositado en el ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del diccionario socio PRIDE [38] con el PXD000807 identificador de conjunto de datos y el DOI 10.6019 /PXD000807.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Coomassie manchado imágenes de carga de proteína total (A) cepillado pacientes cellsfrom orales; (B) exfoliada cellsfrom pacientes salivafrom enteros; (C) primarios líneas de células, incluyendo queratinocitos, células RhEK leucoplasia oral MSK, y CA-9-22 células de cáncer oral. Estas membranas fueron utilizadas para los resultados de transferencia de Western mostrados en la Figura 3 de texto
doi:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s001
(DOC)
Tabla S1. .
Características de los pacientes
doi: 10.1371 /journal.pone.0095389.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
todas las proteínas identificadas y cuantificadas en los análisis proteómicos. Los resultados de los dos reactivos-bases proteómica análisis separados iTRAQ se muestran en las hojas de cálculo independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0095389.s003 gratis (XLSX)
Reconocimientos
los autores agradecen el Centro de Espectrometría de Masas de la Universidad de Minnesota, en particular, LeeAnn Higgins y Todd Markowski, para obtener ayuda con la preparación de muestras y análisis instrumental. Los autores también reconocen el Instituto de Supercomputación de Minnesota para su mantenimiento de software y hardware que se utiliza para el análisis de datos.