Extracto
El cromosoma 8q24 es la región con más frecuencia amplificada a través de múltiples tipos de cáncer, y la duración típica de la amplificación sugiere que puede apuntar a los genes adicionales a
MYC
. Para explorar las funciones de los genes más frecuentemente incluidos en 8q24 amplificaciones, se analizó la relación entre las alteraciones del número de copias y la expresión génica en tres conjuntos de cáncer de endometrio (N = 252); y en el glioblastoma, de ovario, de mama y cánceres perfilados por TCGA. Entre los genes vecinos
MYC
, la expresión del gen que contiene bromodomain-
ATAD2
fue el más asociado con la amplificación. Bromodomain que contienen los genes han sido implicados como mediadores de la función MYC transcripcional, y de hecho
ATAD2
expresión era más estrechamente asociada con la expresión de los genes que se sabe están upregulated de MYC que era
MYC
sí. Las amplificaciones de 8q24, la expresión de los genes aguas abajo de MYC, y la sobreexpresión de
ATAD2
predijo un mal resultado y el aumento de la primaria a lesiones metastásicas. Desmontables de
ATAD2
y
MYC Hoteles en siete de endometrio y 21 líneas celulares de cáncer de mama demostraron que las líneas celulares que eran dependientes de MYC también dependían de ATAD2. Estas mismas líneas celulares también fueron las más sensibles a la histona desacetilasa (HDAC) inhibidor de tricostatina-A, de acuerdo con estudios previos que identifican proteínas que contienen bromodomain-como objetivos de la inhibición por inhibidores de HDAC. Nuestros datos indican una expresión de alto ATAD2 es un marcador de cáncer de endometrio agresivos, y sugerir inhibidores específicos de ATAD2 pueden tener utilidad terapéutica en estos y otros cánceres dependientes de MYC
Visto:. Raeder MB, Birkeland E, J Trovik, Kråkstad C, Shehata S, Schumacher S, et al. (2013) Análisis Genómica Integrada de la amplificación 8q24 en los cánceres endometriales Identifica
ATAD2
como esencial para
Myc cánceres dependientes
. PLoS ONE 8 (2): e54873. doi: 10.1371 /journal.pone.0054873
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 28 Septiembre, 2012; Aceptado: 17 de diciembre de 2012; Publicado: 5 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Raeder y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero : Helse Chaleco Subvenciones 990172 (MBR), 911351, 911624, 911626 y (BA); la Universidad de Bergen; la Sociedad de Cáncer de Noruega; el Consejo de Investigación de Noruega Subvenciones 205404 y 193373 (BA); el Instituto Nacional del Cáncer (K08CA122833 y U54CA143798); y una beca de la Fundación V (RB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de endometrio es la neoplasia ginecológica más común de la pelvis, con un riesgo de por vida entre las mujeres de 2-3% [1]. Aproximadamente el 75% de los tumores se limita al cuerpo uterino momento del diagnóstico y se resecó. Sin embargo, 15% -20% de estos tumores recaída. Estos tumores y los tumores que son metastásicos en la presentación, no responden bien a la quimioterapia o la radiación y son generalmente fatal [1], [2].
Hay una necesidad de nuevos marcadores para identificar a los pacientes con alto riesgo de recaída y para desarrollar nuevas terapias para pacientes con enfermedad metastásica [3], [4]. Por desgracia, la investigación hacia estas metas está muy poco representada en el cáncer de endometrio en comparación con otros tipos de cáncer como el de mama y de ovario. Un enfoque consiste en identificar los genes que, cuando se altera por eventos genéticos somáticos, impulsan la progresión tumoral. Estas alteraciones pueden servir como marcadores de cánceres agresivos y los genes pueden servir como potenciales dianas terapéuticas.
La amplificación focal más frecuente en el cáncer de endometrio está en 8q24 [5]. De hecho, 8q24 es la región más comúnmente amplificado a través de múltiples tipos de cáncer [6], y esta amplificación es un marcador de pronóstico negativo en varios tipos de cáncer [7]. Aunque
MYC
es un objetivo probable [6], nunca se han diseccionado los efectos de esta amplificación en el cáncer de endometrio. De hecho, es posible que se dirige a múltiples genes, como se ha demostrado para amplificaciones en el genoma del cáncer [8] en otro lugar. Por ejemplo, un gen vecino,
ATAD2
, se ha encontrado que es un co-regulador de
MYC
y la sobreexpresión de
ATAD2
se ha asociado con un mal pronóstico en cáncer de mama , de pulmón y de próstata [9], [10], [11].
exploramos el papel de la amplificación de 8q24 en el cáncer de endometrio a través de análisis genómicos de integración de los cánceres endometriales primarios y metastásicos con datos clínicos completos, e identificar
ATAD2
como un objetivo adicional de la amplificación de 8q24 en estos tipos de cáncer. Identificamos copia aumento de número de
ATAD2
como regulador de
ATAD2
expresión, presentan los primeros datos que une
ATAD2
sobreexpresión de
MYC
activación y proporcionar datos funcionales sugieren ATAD2 como diana terapéutica en el cáncer MYC-dependiente.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La colección de primarios y metástasis de carcinoma de endometrio para este estudio fue aprobado por el noruego Inspección de datos (961478-2), Ciencias Sociales Servicios de datos de Noruega (15501) y la "Ética de la Investigación regional.
Comité de Medicina, Noruega occidental" (referencia a 052,01). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
Serie Paciente
primarias carcinoma endometrial y las metástasis se obtuvieron de los pacientes tratados en el Hospital Universitario de Haukeland, Noruega, como se describe anteriormente [5]. Los tumores recogidos para la investigación primaria y la serie de validación qPCR se congelaron inmediatamente después de la resección; tumores recogidos para peces fueron fijados con formol y embebidos en parafina. Los pacientes fueron seguidos de una cirugía primaria hasta octubre de 2010 o la muerte. Los perfiles del número de copias de la serie de investigación primaria, y los perfiles de expresión (Agilent 21 K y 22 K oligoarrays) de un subconjunto de 57 tumores, se han publicado anteriormente [5].
Análisis de ARN
ARN fue extraído y se hibridó a arrays Agilent 44K (art G4112F) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se describe anteriormente [5]. intensidad de la señal se evaluaron utilizando BRB-ArrayTools (Instituto Nacional del Cáncer, EE.UU.). Los arreglos fueron lotes mediana normalizada
.-PCR cuantitativa en tiempo real
cDNA fue sintetizado a partir de ARN usando 1 mg de ARN de alta capacidad de kits de ADNc (Applied Biosystems). La expresión de
ATAD2
y
MYC
se determinó usando genes de expresión TaqMan ensayos Hs00204205 y Hs00905030 respectivamente (Applied Biosystems) y todas las muestras se realizaron en las tarjetas de microfluidos por instructuions del fabricante, utilizando GAPDH-Hs99999905_m1 como endógenas controlar. Las muestras se analizaron por triplicado y se analizaron en el administrador de RQ (Applied Biosystems).
Se prepararon
Fish &
microarrays de tejidos (TMA) que representan las zonas de más alto grado en cada tumor como se informó anteriormente [12] y se trató a 56C ° durante la noche antes de la hibridación. FISH se realizó utilizando el kit de sondas y enumeración de cromosomas sonda MYC Spectrum Naranja FISH 8 (CEP8) (Vysis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se informó anteriormente [13]. Contando se llevó a cabo en las zonas de la digestión del tejido óptima y no hay superposición de núcleos. señales de la sonda de control y se contaron en 40-60 células dentro de las áreas de la digestión del tejido óptima y no hay superposición de núcleos. Las amplificaciones se obtuvieron cuando la relación MYC /CEP8 era & gt;. 1.0
TCGA Validación del conjunto de datos
acceder a los niveles 3 datos del portal de datos TCGA en noviembre y diciembre de 2010. Para el cáncer de mama se obtuvieron los datos de expresión génica de los tumores de 279 y 24 controles normales (Agilent 244K arrays de expresión), y el número de copias de 176 tumores (6,0 Affymetrix SNP arrays). Para el cáncer de ovario se obtuvo la expresión génica (Agilent 244K arrays de expresión) y el número de copias (Agilent arrays 1M) a partir de datos 514 y 489 tumores, respectivamente. Para el glioblastoma se obtuvieron datos de expresión génica de los tumores de 385 y 10 controles normales (arrays Affymetrix U133A) y los datos de número de copias de 261 tumores (Agilent 244K arrays).
Viabilidad de las células
Los vectores lentivirales codificación shRNAs específico para
ATAD2
,
MYC
, y los controles
GFP
,
LACZ1
, y
LACZ2 gratis (Tabla S1) se obtuvieron de la RNAi Consortium. Lentivirus fue producido por la transfección de células 293T con vectores que codifican cada shRNA (5 g) con plásmidos de encapsidación que codifican PSPAX2 y PDM2.G utilizando Fugene HD (Roche). Lentivirus que contiene sobrenadante se recogió 48 y 72 h después de la transfección, se juntaron, y se almacenó a -80 ° C. Se infectaron las células en medios que contienen polibreno, se centrifugó a 1000 g durante 30 min, y seleccionados de puromicina (2,5 mg ml
-1) a partir 24 h después de la infección.
líneas celulares de cáncer se obtuvieron de ATCC , DSMZ, ECACC y HSRRB, y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Tabla S2). La viabilidad celular después de RNAi se midió en placas de 96 pocillos. Ocho pocillos sembrados con células fueron infectadas con diluciones 1:30 de virus que contiene cada shRNA. La mitad de los pozos se sometió a selección puromicina, y la viabilidad celular se midió utilizando la célula-Titulación Glo (Promega) una semana más tarde. Los valores de cada uno por cuadruplicado se promediaron; Se excluyó a los "atípicos" pozos si los pocillos replicados tenían SD /media & gt; 0,2 y excluyendo el pozo mejorado la varianza. Los valores medios ATAD2- y Myc horquilla se normalizaron con los valores medios de control GFP.
Para determinar tricostatina-A de sensibilidad, tricostatina A (Sigma) (0,040 a 10 M) y el vehículo (DMSO) el control se añade a cada uno de tres pocillos que contienen cada línea celular en placas de 96 pocillos. La viabilidad celular se determinó después de 72 horas usando la célula-Titulación Glo (Promega).
inmunotransferencia
Las células se lavaron con PBS, se recogieron, se lisaron usando tampón de lisis RIPA con inhibidores de la proteasa y de fosfatasa, y se centrifuga a 16.000 x g. El sobrenadante se mezcló con tampón de muestra SDS 4X, se hirvieron durante 7 minutos, y se sometió a SDS-PAGE en geles de gradiente al 4-12%. Las transferencias se sondearon con anticuerpos contra ATAD2 (HPA029424, Sigma), MYC (sc-764, Santa Cruz) y actina (sc-1615, Santa Cruz).
Estadísticas
Los datos moleculares se relacionó al fenotipo clínico utilizando χ de Pearson
t de Student 2 o dos caras, según proceda. Se utilizó el análisis de regresión lineal multivariante para la predicción de
ATAD2
niveles de expresión. la supervivencia univariante y multivariante se realizaron análisis mediante el procedimiento de rango de registro y de Mantel-Cox, respectivamente. "MYC señalización fuerza" y los niveles de expresión de genes se presentaron como puntuaciones z.
Resultados
Evaluación de
MYC
como un objetivo de la amplificación 8q24
Amplio soporte de datos biológicos
MYC
como un oncogén [14], y 8q24, que alberga
MYC
, es la región amplificada más común en varios tipos de cáncer [6]. Sin embargo, la importancia de la activación de Myc en el cáncer de endometrio es esencialmente desconocida.
Se realizó un análisis integrado de número de copias y la expresión de datos para buscar evidencia que
MYC
es un objetivo de amplificación de 8q24 en el cáncer de endometrio. Se evaluaron los datos de expresión de una serie de 82 cánceres endometriales obtenidas en un solo condado en Noruega, con los correspondientes datos de número de copias en todo el genoma de 70 tumores (la "Serie investigación primaria"). Dieciséis de estos tumores (23%) tenían 8q24 amplificación. La mayoría de estas amplificaciones fueron de bajo nivel, que van hasta un número de copias de 4,7. Hemos validado los resultados en cuatro conjuntos de datos adicionales. Dos de ellos representan muestras con perfiles de expresión de todo el genoma: una "serie de validación interna" para los que generamos datos de 40 primarias y 19 cánceres de endometrio metastásico reclutados en la misma región en Noruega, y una "serie de validación externa" que representa la expresión publicado anteriormente perfiles de 111 tumores [5]. Los otros dos conjuntos de validación representan muestras analizadas con ensayos enfocados: una "serie qPCR" de 162 muestras y una "serie FISH" de 399 muestras. Características de los pacientes y las variables histopatológicas de todos nuestros conjuntos de datos internos se muestran en la Tabla S3.
Se encontró que tanto
MYC
y los genes regulados positivamente por MYC se sobreexpresa en los cánceres de endometrio con 8q24 amplificación relativa al endometrio cánceres sin ella (p = 0,047 y p = 0,0078, respectivamente) (figuras 1a-b). Se utilizó una lista publicada previamente de 68 genes que se upregulated de MYC en varios contextos y ensayos (Tabla S4; www.myccancergene.org) [15] y anotaron su sobreexpresión ( "señalización MYC fuerza") utilizando GSEA [16]. También probamos cinco firmas de activación MYC adicionales obtenidos del "conjunto de genes de enriquecimiento de base de datos", lo que refleja la activación de MYC en diferentes contextos. Cuatro de ellos se expresaron en niveles más altos en los cánceres de endometrio con 8q24 amplificación (Figura S1a).
(a)
MYC
expresión y (b) la señalización MYC se incrementó tanto entre los cánceres endometriales con 8q24 amplificación. (C) Las variaciones en
MYC
expresión sólo explican una pequeña proporción de la variación en la señalización MYC. ajustes lineales se muestran en la serie de validación rojo, amarillo, y verde para la serie de investigación primaria, la serie de validación interna y externa, respectivamente. (D) Las longitudes de las amplificaciones que contienen
MYC ¿Cuáles son significativamente mayores de lo esperado en comparación con amplificaciones observadas en otras partes de estos tipos de cáncer. (E) De los 26 genes en el pico 8q24 con los datos de expresión, expresión de
ATAD2
está más fuerte y significativamente asociado con la amplificación correspondiente. Las barras azules muestran el porcentaje de incremento en la expresión de genes y barras rojas muestran los valores de p. El umbral de significación es Bonferroni corregido para múltiples hipótesis. (F) La expresión de
ATAD2
está altamente correlacionado con la fuerza MYC señalización. ajustes lineales se muestran como en el panel c.
Sin embargo, las variaciones en
MYC
expresión en sí sólo se explica una pequeña proporción de las variaciones en la fuerza de señalización MYC (R2 = 0,11, p = 0,002 ) (Figura S1b). Se obtuvieron resultados igualmente débiles en los conjuntos de datos de validación internos y externos (R2 = 0,00, p = 0,34 y R2 = 0,06, p = 0,012, respectivamente; Figura S1b). En los tres conjuntos de datos, las variaciones en la expresión de MYC sólo representan el 5% de las variaciones en la fuerza de señalización MYC (R2 = 0,05, Figura 1c).
Por otra parte, 8q24 amplificaciones son más largas que la típica distribución de tamaños de amplificación en el endometrio cáncer (p = 0,0021) (Figura 1c), y por lo general implican múltiples genes. Por lo tanto, la hipótesis de que 8q24 amplificaciones se pueden orientar a los genes adicionales, algunos de los cuales pueden funcionar mediante el aumento de la señalización MYC. Para identificar estos, se evaluaron los 26 genes en la región de pico de la amplificación en 8q24 para los que teníamos datos de expresión, para identificar los genes cuya expresión correlaciona más fuertemente con la amplificación.
Expresión de
ATAD2
correlaciona fuertemente con 8q24 la amplificación y MYC Señalización
la expresión de
ATAD2
fue más fuertemente asociado con la amplificación de 8q24 que era expresión de cualquier otro gen en la región de pico de la amplificación (p-valor = 2.77E-06) (Figura 1d). otros cuatro genes,
NDUFB9
,
DERL1
,
FAM91A1
, y
WDR67, España se upregulated significativamente por la amplificación 8q24, aunque con menor intensidad que
ATAD2
expresión de
ATAD2
también se correlacionó con MYC fuerza de señalización con más fuerza que lo hizo la expresión de cualquier otro gen en la región 8q24 pico (R2 = 0,48, p & lt;. 0.001; Figura 1e, la Figura S1b). De hecho, la asociación entre el
se observó ATAD2
MYC expresión y la fuerza de señalización incluso entre muestras sin amplificación 8q24 (R2 = 0,48, p & lt; 0,001). La correlación entre el
ATAD2
fuerza MYC expresión y señalización era más de dos veces tan fuerte como la próxima gen que más se asocia significativamente (
NDUFB9
) y más fuerte que para
MYC
sí mismo ( R2 = 0,05; Figura 1c).
ATAD2
no es uno de los 68 genes en la firma de activación MYC, y para nuestro conocimiento
MYC
no se ha encontrado para modular la expresión de
ATAD2
[15]. Sin embargo, ATAD2 se había encontrado que se unen a MYC y para la región de caja E de varios genes diana MYC, y no se encontraron niveles ATAD2 ser limitante para la transcripción dependiente de MYC [9].
Tanto amplia del genoma serie de validación también exhibió la correlación entre la señalización MYC y
ATAD2
expresión (R2 = 0,54, p & lt; 0,001 y R2 = 0,45, p & lt; 0,001 en la serie de validación interna y externa, respectivamente) y la relativa falta de correlación con
MYC
expresión (R2 = 0,00, p = 0,33 y R2 = 0,06, p = 0,012; Figuras 1F y S1b). Expresión de
ATAD2
también se correlacionó con cuatro de los cinco firmas adicionales de la activación de MYC, y se correlacionó más fuertemente con estas firmas que lo hizo expresión de
MYC
sí (Tabla 1). La última firma no mostró asociación con
ATAD2
o
MYC
expresión.
La amplificación de 8q24 y expresión de
ATAD2
, pero no MYC , se asocian con progresión de la enfermedad
Entre los 70 tipos de cáncer de endometrio para la que habíamos SNP serie de datos de todo el genoma, 8q24 amplificación se asoció con una reducción de la supervivencia libre de progresión (p = 0,024) y un mayor riesgo de enfermedades específicas la muerte (p = 0,043). La amplificación de 8q24 fue más frecuente en (p = 2.98E-05) y los tumores de alto grado no endometrioide (p = 2.90E-08) (cuadro S5), también otras asociadas con cánceres agresivos [17].
8q24 confirmó la amplificación se asocia con un mal pronóstico mediante FISH en una serie independiente de 399 tipos de cáncer de endometrio. Veinte cánceres (5%) exhiben una mayor 8q24 copia-números relativos al cromosoma 8 centrómero (Figura 2a). Estos se asociaron con un 64% de supervivencia a los 5 años, frente al 85% de los cánceres sin 8q24 amplificación (p & lt; 0,001) (Figura 2b). Un patrón similar se observó para la supervivencia libre de recidiva (p = 0,001). La amplificación de 8q24 también se asoció con la etapa de alta FIGO (p = 0,003), subtipo histológico no endometrioide (p & lt; 0,001) y grado alto (p & lt; 0,001). (Tabla S5)
sondas FISH contra 8q24 (rojo) y el cromosoma 8 centrómero (verde) en un tumor primario y la metástasis muestran la amplificación emparejado sólo en el último (a) (b) Entre 399 pacientes evaluados por FISH, los que tienen 8q24 amplificaciones tienen un peor resultado. En la serie de investigación primaria, los tumores entre los cuartiles más altos de (c)
ATAD2
expresión y (d) MYC fuerza de señalización también ha aumentado el riesgo de muerte específica de la enfermedad. (E) Receptor de estrógeno negativo (ER) con tumores
ATAD2
expresión en el cuartil superior también se asociaron con un riesgo elevado de muerte específica de la enfermedad; el riesgo era mucho menor entre los receptores de estrógeno positivo (ER +) tumores con
ATAD2
expresión en el cuartil inferior. (F)
ATAD2
expresión y (g) de señalización MYC son a la vez mayor entre metástasis que los tumores primarios en la serie de validación interna.
alta expresión de
ATAD2
y la señalización MYC también se asociaron con un mayor riesgo de progresión del cáncer (p = 0,003 yp = 0,015, respectivamente), la muerte específica del cáncer (p = 0,004 y p = 0,001) (Figuras 2c-d), y otras características de mal pronóstico .
ATAD2
expresión fue mayor en no endometrioide, de alto grado y tumores ER negativos (p & lt; 0,001, p & lt; 0,001 y p = 0,02, respectivamente; Tabla S6); señalización de alta MYC se asoció con poco diferenciado (p = 0,0016) y no endometrioide (p & lt; 0,001) tipos de cáncer. La expresión de
ATAD2
también se asoció negativamente con la expresión de
ESR1 gratis (R2 = 0,10, p = 0,005). Del mismo modo, estudios previos han encontrado que
ATAD2
expresión es mayor en los tumores de cáncer de mama triple negativo [18] y está regulada negativamente por los estrógenos en cultivo celular [19].
De hecho,
ATAD2
expresión era un predictor independiente de mortalidad específica de la enfermedad (HR = 1,83, p = 0,027) y la progresión de la enfermedad (HR = 1,62, p = 0,011) después de ajustar por la condición de ER. tumores ER-negativos con cuartil superior
ATAD2
expresión eran particularmente letal. (HR = 4,1, p = 0,002; Figura 2e)
Nos confirmaron estos resultados mediante la evaluación de
ATAD2
expresión por PCR cuantitativa y la condición de ER por inmunohistoquímica en nuestra serie de validación qPCR de 162 tumores adicionales. Entre estos, los tumores ER-negativos con cuartil superior
ATAD2
expresión se asociaron con peores resultados que los de la serie primaria (HR = 6,8, p & lt; 0,001) (Figura S1c). Alto
ATAD2
expresión también se mantuvo asociado con un mayor riesgo de muerte específica de la enfermedad (p = 0,0043) y más corto de supervivencia libre de progresión (p = 0,016). Después de ajustar por la condición de ER,
ATAD2
continua expresión de predecir la muerte específica de la enfermedad (HR = 1,86, p = 0,018), pero sólo una tendencia hacia una asociación con la progresión de la enfermedad (HR = 1,31, p = 0,11). La expresión de
ATAD2
fue también mayor en alto grado (p & lt; 0,001)., No endometrioide (p = 0,005), y ER-negativo tumores (p = 0,02) (Tabla S6)
en contraste,
MYC
expresión no se asoció con la progresión o el riesgo de muerte específica de la enfermedad, ya sea en nuestra serie investigación primaria (p = 0,07 y p = 0,68, respectivamente) o la serie de validación qPCR (p = 0,53 y p = 0,28, respectivamente). Alta expresión de
MYC
se asoció con alto grado tanto en serie (p & lt; 0,001 y p = 0,02, respectivamente), y con histología no endometrioide en la serie de investigación primaria (p = 0,03) (Tabla S6) .
Las metástasis presentan también más 8q24 amplificación,
ATAD2
expresión, y
MYC
señalización de la fuerza que los tumores primarios. En relación con los tumores primarios, metástasis mostraron tasas de 2,4 × más altos de amplificación 8q24 focal por FISH (14,3%; p & lt; 0,007). Entre los 399 pacientes de la serie FISH, 49 habían apareado tumores primarios y metastásicos. Cinco de estas muestras (10%) no mostraron amplificación 8q24 en el primario pero adquirió en la metástasis. Sólo una muestra (2%) mostraron el patrón opuesto. Para examinar
ATAD2
MYC expresión y de señalización, que también comparó los 42 tumores primarios con los 19 metástasis en nuestra serie de validación interna. Tanto
ATAD2
expresión y la fuerza de señalización myc fueron mayores en las metástasis (p = 0,002 y 0,004, respectivamente; Figura 2f-g), incluyendo entre los 8 pacientes con tumores primarios y metástasis emparejados (p = 0,01 y 0,05, respectivamente) .
Extensión a otros tipos de cáncer y el tejido normal
también se investigó si la amplificación 8q24 se asocia con un aumento de
ATAD2
expresión en otros tipos de cáncer. En concreto, hemos utilizado los datos de 514 cánceres de ovario, 279 cánceres de mama, y 385 de los glioblastomas del Genoma del Cáncer Atlas [20], [21]. Estos incluyen los datos de expresión de tejido normal adyacente durante 24 cánceres de mama y 10 glioblastomas. Se observaron 8q24 amplificaciones en 72% (N = 126) de los cánceres de mama, 74% (N = 364) de los cánceres de ovario, y 10% (N = 27) de los glioblastomas.
ATAD2
fue co-amplificado al mismo nivel que
MYC Hoteles en casi todos los tumores (como lo fue entre nuestros cánceres de endometrio; Figura S1D-g) guía
La expresión de.
ATAD2
correlacionado con 8q24 amplificación entre los tres tipos de cáncer (R2 = 0,47, 0,11, y 0,36 para los cánceres de mama, glioblastomas, y los cánceres de ovario, respectivamente; p & lt; 0,001 en todos los casos; Tabla S7), y fue 2,6 × y 2,5 × mayor entre los tipos de cáncer en relación con el tejido normal en el cáncer de mama y de glioblastoma, respectivamente (p & lt; 0,001 en ambos casos).
MYC
expresión correlaciona con menos fuerza con 8q24 amplificación en los tres tipos de cáncer (R2 = 0,12, 0,07, y 0,10 para los cánceres de mama, glioblastomas, y los cánceres de ovario, respectivamente; p & lt; 0,001 en todos los casos).
MYC
expresión en cánceres de mama fue sorprendentemente media la del tejido normal (p & lt; 0,001); en glioblastoma fue mayor en un factor de 3,5 (p & lt; 0,001).
ATAD2
expresión también correlacionada con la señalización de MYC en los tres tipos de cáncer (R2 = 0,11, 0,21, y R2 = 0,31, respectivamente, para los cánceres de mama, glioblastomas, y los cánceres de ovario; p & lt; 0,001 en todos los casos), y fue más fuertemente correlacionada con la señalización de MYC fuerza de
MYC
expresión era (R2 = 0,10, p & lt; 0,001; R2 = 0,09, p & lt; 0,001;. y R2 = 0,02, p = 0,003 en los tres tipos de cáncer)
ATAD2
expresión se correlaciona con
E2F
Expresión génica y
ATAD2
número de copias de manera aditiva
también exploró las contribuciones relativas de E2F, el estrógeno y el número de copias en la expresión ATAD2. El
ATAD2
región del promotor contiene sitios de unión para varias proteínas E2F y datos funcionales anteriores han demostrado que aumenta E2F
ATAD2
expresión en cultivo celular [9], [22];
ATAD2
también ha sido inducida por los estrógenos [23]. En nuestros datos, la expresión de todos los
E2F
factor de transcripción se asoció con
ATAD2
expresión, pero sólo la inclusión de
E2F1
,
E2F2
y
E2F8
mejoró el ajuste global de un modelo de predicción de
ATAD2
expresión a partir de
ATAD2
número de copias y
ESR1
expresión. Los niveles de expresión de estos tres genes están altamente correlacionados, y nos centramos en
E2F1
.
Hemos encontrado que
ATAD2
número de copias,
ESR1
expresión y
E2F1
expresión explicó 77% de la variación en
ATAD2
expresión en el cáncer de endometrio, y cada una de las variables de predicción se mantuvo significativamente asociada con
ATAD2
expresión en el ajustada modelo (Figura 3a y Tabla S7). También se encontró que
ATAD2
número de copias y
E2F
expresión predijo de forma independiente
ATAD2
expresión en el cáncer de mama, cáncer de ovario y el glioblastoma (Figura 3b-d y la Tabla S7) .
ESR1
, que fue menos fuertemente asociada con
ATAD2
expresión, fue significativo en el modelo ajustado sólo en el cáncer de endometrio (p = 0,016) y el glioblastoma (p & lt; 0,001), no en los ovarios o cáncer de mama. Estos datos sugieren que el número de copias de
ATAD2
es un determinante importante de
ATAD2
expresión incluso en el contexto de otros mecanismos de regulación celular.
(a) Cáncer de endometrio , (b) cáncer de mama, (c) cáncer de ovario, y (d) glioblastoma. Los puntos amarillos representan las muestras y la placa azul es el predicho 3-D en forma. Las líneas verdes y rojas son la distancia entre las observaciones reales en forma y la predichos para las muestras por encima y por debajo de la placa de ajuste 3D, respectivamente.
La dependencia de
MYC
predice la dependencia de las
ATAD2
y respuesta a los inhibidores de HDAC en Endometrial- y cáncer de mama Las células
Los resultados anteriores nos llevaron a la hipótesis de que
ATAD2
expresión MYC promueve la señalización y que las células de cáncer de endometrio que dependen de
myc
también dependería de
ATAD2
. Se midió el efecto sobre la viabilidad de las caídas de shRNA
ATAD2
y
MYC Hoteles en siete líneas celulares de cáncer de endometrio. Se han utilizado dos shRNAs contra cada gen, seleccionando aquellas que exhibió la mayor reducción de la expresión de proteínas entre los seis y tres shRNAs criba frente a
ATAD2
y
MYC
respectivamente (Figura 4a, b).
Las transferencias Western para (a) ATAD2 y (b) MYC indican extensión de caída con seis shRNAs contra
ATAD2 Opiniones y tres shRNAs contra MYC, respectivamente. experimentos ATAD2 se realizaron en células KLE y los experimentos se realizaron MYC en células infectadas con TE9 control GFP y vectores myc. Experimentos posteriores utilizados
ATAD2
shRNAs A y E, y MYC shRNAs a y b. La reducción de la viabilidad celular entre siete líneas endometriales celulares de cáncer (c) y líneas celulares de cáncer de 21 mama (d) fueron altamente correlacionados después desmontables de ATAD2 o MYC y después de desmontables de MYC y el tratamiento con el inhibidor de HDAC tricostatina-A (1,25 M) ( e-f).
Desmontables de cualquiera de
ATAD2
o
MYC
dado como resultado una disminución en la viabilidad altamente correlacionados a través de las líneas celulares de cáncer de endometrio y siete (R2 = 0,70 , p = 0,020; figura 4c). En dos casos, se observó más de 75% de reducción en la viabilidad. No se encontró asociación entre la expresión de
ATAD2
o
MYC
o 8q24 número de copias y la sensibilidad a
ATAD2
o
MYC
caída.
Estos resultados sugieren que los cánceres MYC-dependiente de otros tipos también podrían ser dependientes de ATAD2. No hay disminución en la proliferación previamente había sido visto con
ATAD2
caída en las células-T o TIG3 U2OS [9]. Cuando probamos un panel más grande de líneas de cáncer de 21 mama, sin embargo, se confirmó la fuerte correlación entre la disminución de la viabilidad después de la caída de ATAD2 o MYC (R2 = 0,61, p & lt; 0,001; Figura 4d).
La asociación entre la dependencia de los
MYC
y
ATAD2
sugiere ATAD2 como diana terapéutica en el cáncer de
MYC
dependientes. Mientras que
MYC
ha sido durante mucho tiempo un oncogén conocido, los enfoques clínicos para bloquear la señalización de MYC aún no han tenido éxito. histona deacetilasa (HDAC) inhibidores, sin embargo, se ha demostrado que inhibe indirectamente proteínas que contiene bromodomain-como ATAD2 [24].
Se utilizó el Mapa de Conectividad [25] para identificar compuestos cuyas firmas anticorrelated con la señalización MYC firma. Entre las 1309 pequeñas moléculas representadas por el Mapa de Conectividad, la firma del inhibidor de HDAC tricostatina-A fue más anticorrelated con la firma de señalización MYC. (Valor de p & lt; 0,00001; Tabla S8). También generamos una firma de enfermedad agresiva de la serie de investigación primaria, utilizando los 50 genes más de sobre y sub-expresados en los pacientes con enfermedad metastásica en comparación con los pacientes sin enfermedad metastásica. Nos pareció que la tricostatina-Una firma fue también el más anticorrelated con esta firma de enfermedad agresiva, atado con firmas de otras cuatro moléculas (p & lt; 0,00001; Tabla S8).
Para confirmar funcionalmente la relación entre la tricostatina-A y la dependencia MYC, hemos probado todas las líneas celulares de cáncer de mama y de endometrio para cáncer de inhibición del crecimiento por tricostatina-a y compararon los resultados con
MYC
caída. Tricostatina-A inhibe el crecimiento en las mismas líneas celulares que eran dependientes de
MYC
tanto en el endometrio (R2 = 0,74, p = 0,013; figura 4e), y en las líneas celulares de cáncer de mama (R2 = 0,31,