Extracto
La identificación de la línea germinal variantes que predisponen al cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) es crucial para el manejo clínico de los transportistas, pero varios probandos siguen siendo negativos para tales variantes o variantes oso de significado incierto (VUS). A continuación se describen los resultados de los análisis moleculares de integración en 132 pacientes con HNPCC proporcionan evidencias relativas a la prueba genética de HNPCC con los métodos tradicionales o de nueva generación. Los pacientes fueron seleccionados para: Expresión de la línea germinal específica de alelo (ASE), variantes de nucleótidos, reordenamientos y promotor de metilación de genes de reparación (MMR); germinal
EPCAM
reordenamientos; la inestabilidad de microsatélites del tumor (MSI) e inmunohistoquímica la expresión de proteínas (IHC) MMR. Probandos negativos para las variantes patógenas de genes MMR fueron seleccionados para la línea germinal
variantes APC
y
MUTYH
secuencia. La mayoría de los defectos de la línea germinal identificados fueron variantes de secuencia y reordenamientos de los genes MMR. Sorprendentemente, la línea germinal alterado ASE de genes MMR se detectó en 8/22 (36,5%) probandos analizadas, incluyendo 3 casos negativos en otras proyecciones. Por otra parte, la ASE proporciona evidencia del papel patogénico y guió la caracterización de un VUS compartida por 2 probandos adicionales. No se observó ninguna línea germinal de genes MMR metilación del promotor y sólo un
se detectó EPCAM
reordenamiento. En varios casos, el tumor IHC y MSI divergieron de los resultados del cribado de la línea germinal. En particular,
APC
o bialélico
MUTYH
defectos de la línea germinal se identificaron en 2/19 probandos negativos para las variantes patógenas de genes MMR. Nuestros resultados muestran que ASE complementa los análisis basados en gDNA en la identificación de defectos MMR y en la caracterización de la expresión de genes que afectan a VUS, aumentando el número de alteraciones de la línea germinal detectados. Una fracción apreciable de los probandos negativas para el gen MMR variantes puertos
APC
o
MUTYH
variantes. Estos resultados indican que la línea germinal análisis de ASE y la detección de
APC
y
MUTYH
defectos deben ser incluidos en los algoritmos de diagnóstico de HNPCC
Visto:. De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano T, Mammarella S, Veschi S, et al. (2013) Análisis Integral del hereditario sin poliposis cáncer colorrectal: la contribución de Expresión del alelo-específica y otros ensayos de diagnóstico Algoritmos. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10.1371 /journal.pone.0081194
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2013; Aceptado: 9 Octubre 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 De Lellis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por fondos del Ministerio de Educación, Universidad e Investigación de Italia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
hereditario sin poliposis cáncer colorrectal (HNPCC), también conocido como síndrome de Lynch, es la forma más frecuente de predisposición autosómico dominante de cáncer colorrectal (CCR) [1]. El diagnóstico genético de portadores de defectos de la línea germinal en las familias afectadas es fundamental para una vigilancia clínica eficiente y permite la quimioprevención específica que ha sido recientemente demostrado reducir sustancialmente la incidencia de cáncer en estos pacientes [2]. Sin embargo, la identificación de defectos de la línea germinal patógenos en este síndrome no es trivial, tal como se refleja por la amplia fluctuación en el tipo de alteraciones genéticas identificadas en diferentes estudios y por el número correspondiente de las variantes con significado incierto (VUS) detectado [3-6] . La tasa variable de alteraciones detectadas refleja en diferencias parte en la sensibilidad de los métodos moleculares utilizados y en parte el hecho de que el diagnóstico clínico no tiene en cuenta completamente para la heterogeneidad genética subyacente, incluso cuando la selección de probandos se basa en estrictos criterios de Ámsterdam I (AC -I) o Amsterdam criterios II (AC-II) [7]. La mayoría de los pacientes con HNPCC están relacionados con reparación de defectos desajuste de la línea germinal (MMR) y desarrollar tumores con altos niveles de inestabilidad de microsatélites (MSI-H), el sello distintivo de la deficiencia de MMR. La línea germinal
MLH1
o
MSH2
variantes se identifican en la mayoría de estos pacientes, mientras que en otras variantes de genes MMR se detectan en una fracción más pequeña de los casos [1-6]. En particular, también deleciones que afectan a la línea germinal el extremo 3 'del gen de molécula de adhesión celular epitelial (
EPCAM
) pueden causar HNPCC a través de la hipermetilación y el silenciamiento de la corriente abajo
MSH2
promotor en los tejidos que expresan EpCAM [ ,,,0],8].
EpCAM
deleciones fueron reportados a una frecuencia relativamente alta (16-21%) en los diferentes estudios llevados a cabo en los casos negativos para los defectos MMR línea germinal [9,10]. La frecuencia más alta (hasta 33%) de
EPCAM
reordenamientos se observó en el subgrupo de pacientes MSI-H negativos para las alteraciones MMR de la línea germinal y que carecen de expresión tumor MSH2 [11,12], pero la frecuencia global de estos reordenamientos en serie de los probandos con HNPCC, no seleccionados para el estado mutacional del tumor o la inmunotinción MSH2, no ha sido evaluada.
Además de los genes MMR y
EPCAM
, otros genes juegan un papel en este síndrome genéticamente heterogénea. Una proporción relativamente alta de familias que cumplen CA tiene "familiar colorrectal tipo de cáncer X" (FCCTX), una agregación de cáncer colorrectal sin evidencia de línea germinal o defectos MMR asociados a tumores [4]. Para la mayoría de estas familias, la alteración genética responsable de la predisposición al cáncer de colon no se conoce, aunque los defectos en los genes MMR no, como
MUTYH
,
OGG1
o
BMPR1A
, de vez en cuando se detectan [13-15]. En este sentido, también
APC
variantes asociadas a fenotipos atenuados pueden solaparse con muy HNPCC [16], ampliando aún más la gama de CRC genes que predisponen a cribar.
Con base en las consideraciones anteriores, se propusieron las pruebas genéticas tradicional en HNPCC se centró en el análisis de los genes MMR y varios algoritmos de diagnóstico para optimizar este examen [17-21]. Sin embargo, estos algoritmos pueden limitar la sensibilidad de las pruebas genéticas, subestimando portadores de variantes patógenas en los genes MMR. Recientemente, un ensayo de ADNg muy processive (ColoSeq, Universidad de Washington, Seattle, WA) basado en la captura selectiva y secuenciación de próxima generación (NGS) se diseñó para analizar simultáneamente los genes relacionados con la triple vírica y -unrelated en HNPCC [22]. pruebas basadas en NGS puede superar algunas de las limitaciones de los métodos de bajo rendimiento, pero incluso este enfoque tiene algunas desventajas. Por ejemplo, NGS no proporciona ideas sobre el papel patogénico de VUS que tienen más probabilidades de ser detectados por estos métodos altamente processive. Por otra parte, los enfoques basados en la genómica no están diseñados para definir el potencial patogénico de
cis CD - variantes y trans-actuación que afectan a la expresión génica. Estas limitaciones podrían ser, en parte, superar por ensayos basados en cDNA, tales como el análisis de la expresión específica de alelo (ASE) que tiene el potencial para descubrir defectos en la línea germinal de predisposición al cáncer colorrectal, incluso cuando una variante patógena no ha sido comprobada o el papel de las variantes detectadas están claros [23-27].
en el presente estudio, se ilustran los resultados de los análisis realizados integradora en una serie de 132 pacientes con HNPCC italianos utilizando ensayos desarrollados anteriormente y novedosos para la proyección de la línea germinal y defectos tumorales. Mostramos que el análisis de la línea germinal ASE complementa ensayos basados en gDNA en la identificación y caracterización de los defectos que predisponen a la CRC. Nuestro enfoque integrador también muestra que la inclusión de
MUTYH
y
APC Hoteles en la proyección aumenta el número de variantes patógenas detectadas. Teniendo en cuenta el número de pacientes analizados, el panel de genes seleccionados y la gama de los métodos empleados, este estudio proporciona indicaciones para la traducción clínica de la prueba genética HNPCC que se puede aplicar a los enfoques tradicionales o NGS. En particular, nuestros resultados apoyan la inclusión del análisis de la ASE y la detección de los genes de poliposis en los algoritmos para el diagnóstico genético de HNPCC.
Materiales y Métodos
Pacientes y estrategia de cribado integradora
Se estudiaron 132 pacientes no relacionados AC-AC-I o II previamente reclutados en diferentes instituciones italianas. DNA y RNA se extrajeron como se describe anteriormente [25]. Todos los participantes del estudio dieron su consentimiento informado por escrito después del asesoramiento verbal y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Chieti. Tumorales análisis IHC MSI y se llevaron a cabo en los probandos con muestras tumorales disponibles. A todos los pacientes, independientemente de los resultados de los tumores MSI y IHC análisis, fueron sometidos a pruebas de detección de sustituciones de nucleótidos de la línea germinal en los genes MMR como se detalla a continuación. Probandos negativos para las sustituciones de nucleótidos patógenos se probaron más de reordenamientos de la línea germinal extendidos en
MSH2
,
MLH1
y
EPCAM
, seguido de la detección de la línea germinal
MSH2
y
MLH1
la metilación del promotor. ASE análisis de genes MMR se realizaron en pacientes con ARN y heterocigotos disponible para al menos un marcador alélica, independientemente de los resultados de las pruebas de detección anteriores. Los pacientes negativos en los análisis anteriores se probaron para
APC
y
MUTYH
variantes de secuencia como se describe a continuación. Los datos de variación identificados en este estudio se han presentado a la Sociedad Internacional de Tumores gastrointestinales hereditarias (Insight, http://www.insight-group.org/variants/database/) de base de datos.
La detección de nucleótidos de la línea germinal sustituciones en los genes MMR
Los pacientes fueron seleccionados inicialmente para variantes en la secuencia
MSH2
y
MLH1
mediante análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) o desnaturalización electroforesis en gel de gradiente (DGGE) . Todos los casos negativos en SSCP o DGGE se proyectaron más de variantes en
MSH2
,
MLH1
y
MSH6 fotos: por desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC) y la secuenciación automática, la cual detectado unas pocas mutaciones adicionales escapado a la selección inicial (datos no mostrados). Para predecir los posibles efectos nocivos de la novela VUS utilizamos la siguiente
In silico herramientas
: PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (http: //tamizar. jcvi.org/), el HSF (http://www.umd.be/HSF/), mosca de la fruta (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), mutación Catador (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (http://www.interactive-biosoftware.com). También utilizamos la MAPP-MMR (http://mappmmr.blueankh.com/) y PON-MMR (http://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) algoritmos de predicción que fueron validados específicamente para missense variantes en los genes MMR .
Análisis de los reordenamientos de la línea germinal extendidos en
MSH2, MLH1
y
EPCAM
Genómica
MSH2
y
MLH1
reordenamientos fueron seleccionadas por la sonda de amplificación dependiente de ligado múltiplex (MLPA) en 78 pacientes negativos al diagnóstico básico de la secuencia patogénica variantes o con VUS. La confirmación de reordenamientos se obtuvo por no fluorescente de PCR múltiple acoplado a HPLC (NFMP-HPLC) o mediante tecnología lab-on-a-chip para el análisis de las variaciones del número de copias (CNV-LOC), como se describe anteriormente [28,29] . Desde la versión original de la
MSH2 /MLH1
kit MLPA (P003 SALSA, MRC-Holland, Amsterdam, Países Bajos) empleado no incluye sondas correspondientes a
EPCAM
, hemos desarrollado 3 novedoso NFMP -HPLC ensayos para la detección y confirmación de reordenamientos genómicos que afectan el extremo 3 'de
EPCAM
y la intergénica
MSH2 CD -
EPCAM
región (Tabla S1). Estos ensayos se realizaron en un subgrupo de 33 casos con VUS o negativo en las proyecciones anteriores y para los que el ADN no se habían utilizado en los análisis anteriores. Se realizó un análisis de punto de interrupción como se describe anteriormente [28,29].
Germinal
MSH2
y
metilación del promotor MLH1
conversión de ADN por bisulfito sódico en en 44 casos negativos en el cribado inicial para variantes de secuencias de patógenos y reordenamientos genómicos utilizando el kit de modificación de ADN de impresión de datos (SIGMA, Saint Louis, MO), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección de la línea germinal
MLH1
metilación del promotor se llevó a cabo por PCR específica de metilación (MSP) utilizando un degenerado y un cebador específico de metilación diseñado por Suter et al [30]. Además, hemos diseñado un control de PCR en la que el cebador degenerado utilizado para MSP fue emparejado con un cebador específico para el ADN no metilado (Tabla S2). Se utilizó el ADN de la línea celular SW48 como
MLH1
el control del promotor metilación positivo. La detección de la línea germinal
MSH2
metilación del promotor se llevó a cabo por MSP utilizando cebadores específicos para los alelos metilados y no metilados, tal como se describe por Chan et al [31]. Los controles positivos para
MSH2
metilación del promotor se obtuvieron utilizando los ADNs de control que habían sido metilados universalmente utilizando S-adenosilmetionina (SAM) y Metiltrasferasa M.SssI CpG (New England Biolabs, Ipswich, MA).
análisis ASE
analiza ASE de
MSH2
,
MLH1
o
MSH6
se lleva a cabo mediante extensión de cebador en pacientes con ARN disponible y heterocigotos para, al menos, un marcador alélico, independientemente de su estado mutacional. ASE análisis se llevaron a cabo como se describe previamente usando
32P-marcada o cebadores no marcados acoplados a análisis por Molecular Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) o por DHPLC (Transgenomic, Omaha, NE), respectivamente [23,25 ]. Tres ensayos de ASE se realizaron tanto con cebadores
32P-etiquetados y con el método basado en DHPLC, que dio resultados comparables (Tabla S3). Para cada ensayo ASE, se empleó la relación media obtenida con plantillas gDNA para normalizar los datos generados en los experimentos de extensión del cebador realizadas usando plantillas de ADNc. Estas relaciones de cDNA /gDNA normalizados fueron designados como valores ASE. Basado en estudios anteriores, solamente marcados desequilibrios en la expresión alelo relativa correspondiente a doble desequilibrios en las proporciones alélicas (& lt; 1: 2 o & gt; 2: 1 proporciones, equivalentes a valores ASE & lt; 0,5 o & gt; 2, respectivamente) fueron consideradas de forma conservadora evidencia de una alteración patógena [23,25,26]. Estos valores ASE se desvían más de 3 desviaciones estándar de los valores medios observados en los controles heterocigotos para dos genes que predisponen CRC que previamente analizado en base a la disponibilidad de marcadores ASE frecuentes en la población italiana (ASE de
MLH1
en los controles, significa 1.04, SD 0.11, usando rs1799977; ASE de
APC
en los controles, con una media de 1,25, 0,21 SD, usando rs2229992) [24,25].
En general, la ASE en
MLH1
,
MSH2
y
MSH6
se midió utilizando 8 descritos anteriormente [23,25] y 3 nuevos ensayos. Los cebadores para nuevos ensayos se describen en la Tabla S4.
tumor MSI y IHC análisis
ensayos tumorales se realizaron a las entidades colaboradoras que reclutaron a los pacientes. MSI se analizó en la mayoría de los probandos (93/102) con muestras tumorales disponibles, de acuerdo con las directrices internacionales [32]. Expresión inmunohistoquímica de las proteínas MSH2, MLH1 y MSH6 se analizó para determinar 73/102 casos con muestras tumorales disponibles como se describe anteriormente [13].
La detección de
APC
y
MUTYH
sustituciones de nucleótidos
La secuencia de codificación y las fronteras intrón-exón de
APC
y
MUTYH
se analizaron por secuenciación directa en 19 probandos negativos en el cribado de genes MMR. Estos pacientes fueron seleccionados en base a la disponibilidad de ADN y en la presencia de al menos un pólipo momento del diagnóstico en los probandos y /o de sus familiares.
Resultados
Múltiples enfoques se utilizaron para analizar 132 pacientes con HNPCC no relacionados por defectos patógenos en triple vírica y no los genes MMR. Variantes
MSH2, MLH1 y MSH6 nucleótidos
Hemos detectado 41 se ha descrito anteriormente y 15 nuevas variantes de genes MMR (Tabla 1 y Tabla S5). Estos incluyen 27 cambios pérdida de la función de nucleótidos (sin sentido y del marco de lectura) introducir codones de terminación prematuros (PTCs), 14 variantes localizadas en los sitios de empalme, 3 deleciones en marco y 12 sustituciones de cambio de sentido. Ocho de las variantes de empalme sitio fueron verificados experimentalmente para asociarse con el empalme modificada, incluidos 7 analizado en estudios anteriores [33-38] y 1 en el presente estudio (véase más adelante), mientras que 5 fueron considerados patógenos están situados en los dinucleótidos casi invariables en extremos de intrones (Tabla 1 y Tabla S5). Dos eliminaciones dentro del marco y 9 variantes de cambio de sentido se informaron como patógenos o potencialmente patógenos basado en
in silico
análisis, ensayos funcionales, clasificador cualitativa o modelo de predicción multifactorial en los informes anteriores [39-44] que se indican en la tabla S5.
pacientes
AC Hotel MSI
MMR defectuoso IHC
defectos de la línea germinal
a
variantes de nucleótidos y reordenamientos
alterados ASE
b
LCH-1IMSI-hMLH1
MLH1
c.301GA (p.Gly101Ser) GDLM-#2-III-1IMSI hMSH2
MSH2
c.942 + 3ATGDLM-7 #-III-3IMSI hMLH1 /MSH2
MSH2 sobre Del exón 7LCH-8IMSI-HMSH2GDLV-11#II-9IMSI- HMLH196#1636IIMSI-HMLH1GDLM-9#II-2IMSI-hMSH2
MSH2
c.1549_1550delGCinsT (p.Ala517Tyrfs * 9)
MSH2
GDLG-18 #-III-19IMSI Hn.i.
MSH2 sobre Del exón 3LCH-19IMSI-hMSH2
MSH2
c.2245GT (p.Glu749*)GDLG-20#II-1IMSI-HMLH1
MLH1
LCH-27IMSI-HMSH2
MLH1
GDLG-49#IV-2IMSI-HMSH2
MSH2
c.1024GA (p.Val342Ile) GDLV-52#II-2IMSI-hMLH1
MLH1
LCH-57IMSI-hMLH1
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) LCH-58IMSI-hMSH2
MSH2
c.2005 + + 3_2005 14del12LCH-59IMSI-hMSH2
MLH1
c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31) LCH-88IMSI-Hn.a.
MLH1
c .1731GA (p.Ser577Ser) LCH-93IIMSI-Hn.a.
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 19#719IIMSI-hMSH2
MSH2
c.1444dupA (p.Arg482Lysfs * 6) 297#875IMSI-hMLH1
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 307#2619IMSI-hMLH1
MLH1
c.199GA (p.Gly67Arg) 309#3478IMSI-hMSH2
MSH2 sobre Del exones 9-10311#2042IMSI-Hn.i.
MLH1
c.731GA (p.Gly244Asp) 338#1489IMSI-hMLH1 /MSH6
MLH1
c.382GC (p .Ala128Pro) 349#1581IMSI-hMSH2
MSH2
c.942 + 3AT363#2541IMSI-hMSH2
MSH2
exones Del 9-10412#3342IIMSI-hMSH2
EPCAM sobre Del exón 3
- MSH2
exón 7#459 2809IMSI-hMSH2
MSH2 sobre Del 5'upstream región - exón#8476 R26IMSI-hMSH2
MSH2 sobre Del exones 1 a 6.667#2412IMSI-hMSH2
MSH2
c.942 + 3AT668#2371IMSI-hMLH1
MLH1
c.545 + 3AG670#2413IMSI-hMLH1
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) 727#AAIMSI -HMSH2
MSH2
c.942 + 2TA814#DGRIMSI-Hn.a
MSH2
c.. [376GγA (;) 2251G & gt; C] (p [Gly126Ser (;) Gly751Arg].) 986#3487IMSI-hMLH1
MLH1
c.1731 + 4AG 1068#3015IMSI-hMLH1
MLH1
c.1050delA (p.Gly351Aspfs * 16) 1070#2957IMSI-hMSH2
MSH2
c.2287G & gt;. C (p.Ala763Pro) 1.080#2974IIMSI-Hn.a
MSH2
c.2089CT (p.Cys697Arg) 1.251#3260IIMSI-hMSH2
MSH2
c.374C & gt; T (p.Gln125 *) 1256#3479IIMSI-hMSH2
MSH2
c.1786_1788delAAT (p.Asn596del) 1.293#3286IMSI-hMLH1
MLH1 sobre Del exón 61301#3323IIMSI-hMSH2
MSH2
c.2519_2530del12 (p.Val840_Cys843del) 1.459#3324IIMSI-hMLH1
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) LES1#LPIIMSI-Hn.a.
MLH1
c.731GA ( p.Gly244Asp) 298#668 /1584IMSI-hMSH2
MSH2
c.1077-2A & gt;#C319 1004IMSI-hMSH2
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 350#1933IMSI-hMLH1
MLH1
c.676CT (p.Arg226 *) 360#2916IMSI-hMLH1 /MSH6
MLH1
c.1731 + 4AG
MLH1
903#2630IIMSI-hMSH2
MSH2 sobre Del exón 31218#3238IMSI-hMLH1
MLH1
exones Dup 2-31.515#3442IIMSI-hMSH2
MSH2
c.1255CT (p.Gln419 *) 334#1170IMSI-hMSH2
MSH2
c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)
MSH2
711#2495IIMSI-hMLH1
MLH1
c.1459CT (p.Arg487 *) 1.205#BAIIMSI-hMLH1
MSH2
c.1215CA (p.Tyr405 *) 1206#GEIMSI-hMSH2
MSH2
c.1046CG (p.Pro349Arg) 357#2038IMSI-Hn.a.
MSH2
c. 2294delC (p.Ala765Valfs * 47) 600#2237IMSI-Hn.a.
MSH2 sobre Del exones 4-61138#3149IMSI-Hn.a.
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del)#737 2838IMSI-Hn.a.
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) TO9726IMSI-Hn.a.
MLH1
c.2040CA (p.Cys680 *) GE9804IMSI-Hn.a .
MSH2
c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2) GE9726IMSI-Hn.a.
MSH2
c.2536CT (p.Gln846 *) SI9744IMSI-Hn.a.
MSH2
c.942 + 3ATGE9914IMSI-Hn.a
MLH1
c.677 + 1GAF102IMSI-Hn.a
MLH1
c.546-2A & gt;... GSI9606IMSI-Hn.a
MLH1
c.911AT (p.Asp304Val)LCH-4IMSI-Hn.i.LCH-12IMSI-Hn.i.LCH-85IMSI-Hn.a.LCH-47IMSI-Hn.a.871#R08IMSI-Hn.a.GE0101IMSI-Hn.a.GE9801IMSI-Hn.a.GE9903IIMSI-Hn.a.LCH-6IMSSn.a.LCH-13IMSSn.i.LCH-79IMSSn.a.296#776IMSSn.i.303#2547IMSSn.i.308#1260IMSSn.i.
MUTYH
. C [1145G & gt; A]; [1395_1397delGGA] (p.[(Gly382Asp)];[(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.
APC
c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1
MLH1
c.1367C & gt; A (p.Ser456 *) 1008#2829In.a.MSH2
MSH2
c.1757C & gt; G (p.Ser586 *) 1077#2979In.a.MLH1
MLH1
c.453 + 1GA1420#3343IIn.a.MSH2
MSH2
c.868GT (p.Glu290 *) LCH-15In.ani
MLH1
c.1918CT (p.Pro640Ser) LCH-23IIn .ana
MSH2 sobre Del exón 1GDLG-29 III-# 8IIn.ana
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) GDLG-31 III-# 11In.ana
MLH1
c.954delC (p.His318Glnfs * 49)
MLH1
LCH-86In.ana
MSH2
c.212-1G & gt;#A83 3103In.ana
MLH1 sobre Del exón 1
MLH1
601#2307In.ana
MSH6
c.3013CT (p.Arg1005 *) 1.157#834In.ana
MSH2
c.119delG (p.Gly40Alafs * 24)#324 R10In.ana
MLH1
c.1896GA (p.Glu632Glu) 337#2224In.ana
MLH1
c.1989GT (p.Glu663Asp) 359#2578In.ana
MLH1
c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44) 463#3031In.ana
MLH1
c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 602#2416In.ana
MLH1
c.1011delC (p. Asp338Ilefs * 29) 985#2683In.ana
MLH1 sobre Del exón 61074#3001In.ana
MSH2
c.1059delG (p.Asn354Thrfs * 3)#1200 3221In.ana
MSH6
c.738_741delAAAA (p.Lys246Asnfs * 32) GE0201In.ana
MSH2 sobre Del exon16GE9911In.ana
MLH1
c.1011delC (p.Asp338Ilefs * 29) TO0012In.ana
MLH1
c.1888_1892delATTGA (p.Ile630 *) TO0225In.ana
MLH1
c.2040CA (p.Cys680 *) GE0410In.ana
MSH2
c.942 + 3ATGE0330In.ana
MSH2
c.1216CT (p.Arg406 *) 162#2696In.ana
MLH1
c.1559-2A>GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table . 1. Visión general de MSI, IHC y el estado mutacional en 132 pacientes no relacionados con HNPCC satisfacer AC Hotel na, datos no disponibles; ni, IHC variantes no informative.aNovel están en negrita. defectos de genes MMR línea germinal para algunos pacientes se ha informado anteriormente (véase la Tabla 2 y los cuadros S3, S5, S6 y S7). También se detectaron varias variantes previamente reportados como no patógeno (véase el cuadro S5) .base valor & lt; 0,5 o & gt; 2. Descargar CSV CSV
Se realizó
in silico
análisis para inferir el efecto funcional de 4 variantes (3 missense y 1 intrónica) para los que se disponía de informes anteriores ninguna de estas informaciones. Para la novela de sentido erróneo 3 variantes de un efecto perjudicial sobre la función de proteínas fue predicho por
In silico herramientas
incluyendo PON-MMR y la MAPP-MMR (cuadro S5).
En las herramientas de silico
indicaron un efecto potencial en el empalme de la nueva variante intrónica (
MLH1
c.1731 + 4AG) (véase más adelante) (cuadro S5). Una variante adicional, la novela
MSH2
en marco deleción (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), se consideró potencialmente patógenos, ya que elimina 4 residuos de aminoácidos altamente conservados en otras especies y se encuentra en el dominio ATPasa de la proteína MSH2, donde las variaciones se informó anteriormente para causar defectos de falta de coincidencia de unión o liberación [45,46].
se encontró un paciente (814#/DGR) para llevar dos sustituciones de cambio de sentido en
MSH2 gratis (c.376GA y c.2251GC) predijeron que se patógenos (véase el cuadro S5). Por desgracia, no hay familiares de este paciente estaban disponibles para las pruebas genéticas y la fase de las dos variantes que no se pudo determinar.
En general, la detección de variantes de secuencia en los genes relacionados con HNPCC permitió la detección de 56 sustituciones diferentes con un significado patogénico definido o potencial en 72 pacientes, incluyendo 26 en
MLH1 gratis (46,5%), 28 en
MSH2 gratis (50%) y 2 en
MSH6 gratis (3,5%) (Tabla 1 y Tabla S5).
reordenamientos genómicos de MSH2, MLH1 y EPCAM
Proyección de
MLH1
y
MSH2 fotos: por MLPA, seguido de pruebas confirmatorias utilizando LOC-CNV y /o NFMP-HPLC, se indica la presencia de reordenamientos genómicos (incluyendo 14 supresiones y 1 duplicación) en 15 de los 78 pacientes analizados (19%) (Tabla 1 y la Tabla S6). El gen afectado por la reordenación era
MSH2
en 10 probandos (13%) y
Hoteles en MLH1 5 probandos (6,5%).
EPCAM
reordenamientos fueron seleccionadas por NFMP-HPLC en pacientes sin variantes patógenas detectables o con VUS. Por otra parte,
EpCAM
reordenamientos fueron evaluados en 3 pacientes (476#R26, 459#2809 y#412 de 3342) que en base a MLPA y la detección NFMP-HPLC tenían evidencia de
MSH2
deleciones que implican la primero exón del gen (Tabla S6). Uno de estos pacientes (476#R26) tenían una deleción de
MSH2
exones 1-6 y ensayos basados en EpCAM NFMP-HPLC indicó que la reorganización no se extendía a la
EpCAM MSH2
región intergénica (Tabla S6). En otro paciente (459#2809), se informó anteriormente para tener una deleción que abarca los exones 1-8 de
MSH2
[28], los ensayos de EpCAM mostraron que la supresión incluido el
MSH2 página 5 'aguas arriba región, pero ahorrado el extremo 3 'de
EPCAM gratis (Figura S1). En el tercer paciente (412#3342) la supresión que haya efectuado todos los
EPCAM
exones incluidos en los ensayos de EpCAM (exones 3, 8 y 9) (Figura S1). Esta supresión extendido hasta el exón 7 de
MSH2
, como se indica por MLPA y NFMP-HPLC (Tabla S6). No
se detectaron EpCAM
reordenamientos en los otros pacientes analizados. Todos los
MLH1, MSH2 y
EPCAM
reordenamientos fueron confirmados por al menos 2 ensayos independientes con base en MLPA, NFMP-HPLC o LOC-CNV. En 9 casos la confirmación de los reordenamientos podría también obtenerse a través de análisis de punto de interrupción o RT-PCR (Tabla S6), como se informó anteriormente [28,29].
promotor de la línea germinal metilación
gen
línea germinal MMR promotor de la metilación se analizó en los casos negativos en el cribado inicial de nucleótidos variantes patógenas y reordenamientos genómicos. CpG metilación del promotor se observó solamente con los ADN de control positivo (línea celular SW48 para
MLH1 Opiniones y control de ADN metilado universalmente para
MSH2
, respectivamente - los datos no presentados).
línea germinal análisis de la línea germinal ASE
Entre los 22 pacientes que podrían ser analizados, se observó alterado ASE de
MLH1
en 6 pacientes y de
Hoteles en MSH2 2 pacientes (Tabla 2 y la Tabla S7). De estos pacientes, 2 mostraron monoallelic expresión de
MLH1 gratis (GDLV-52#II-2 y 83#3103) y 6 tenían expresión marcadamente desequilibrado de
MLH1 gratis (360#2916, GDLG-#20 II-1, GDLG-31#III-11 y LCH-27, ASE medio valora 4.7, 2.01, 2.24 y 2.64, respectivamente) o
MSH2 gratis (GDLM-9#II-2 y#334 1170, ASE medio valora 3.58 y 9.20, respectivamente). Los pacientes restantes habían desequilibrado o moderadamente equilibrado ASE (Tabla 2 y la Tabla S7). valores ASE observados en los 22 probandos se representan en la Figura 1. Como referencia, la figura representa también los valores que hemos medido anteriormente en los individuos de control heterocigotos para la variante c.655AG frecuente (rs1799977) de
MLH1
[ ,,,0],25]. Los pacientes
a
germinal variantes patógenas
análisis ASE
gen marcador ASE
Consecuencia
ASE valor normalizado (SE)
b
GDLM-2#III-1
MSH2
c.942 + 3AT
MLH1
c. 655AGp.Ile219Val1.00 (+0,07) LCH-8
MSH2
c.984CTp. (=) 1,09 (0,07)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.97 (0,16) GDLG -18#III-19
MSH2 sobre Del exón 3
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.91 (0,10) LCH-27
MLH1
c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0.38) GDLG-31 III-11#
MLH1
c.954delC (p.His318Glnfs * 49)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val2.24 (+0,07) LCH-51
MLH1
c.655AGp.Ile219Val0.84 (0,10) LCH-59
MLH1
c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)
MLH1
c. 655AGp.Ile219Val0.97 (0,11) GE9804
MSH2
c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.09 (+0,05) 96#1636
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.17 (+0,06) 334#1170
MSH2
c.278_279delTTp.Leu93Profs em> MSH2
c.278_279delTT * 69.20 (3,97) 359#2578
c.1639_1643dupTTATA MLH1
(p.Leu549Tyrfs * 44)
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.33 (+0,04) 314#1200
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.01 (0.03) 1.082#2982
MLH1
c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)
MSH6
c.540TCp. (=) 1.10 ( 0,12) 83#3103
c
MLH1 sobre del exón 1
MLH1
c.655AGp.Ile219ValLoss de G alleleTable 2. resultados de la extensión del cebador los análisis de ASE realizó en este estudio.
aEn Tabla S7 se resumen los resultados de los análisis de ASE para 8 pacientes adicionales incluidos en el presente estudio, cuyos resultados ASE se había informado anteriormente [23,25] .bMarkedly desequilibrado valores ASE están en negrita .cFor este análisis PE paciente realizado en el presente estudio confirmó la pérdida de la expresión para el alelo G demostrado previamente por secuenciación de ADNc [28]. Descargar CSV CSV
Los valores ASE entre las 2 líneas discontinuas corresponden a menos del doble desequilibrios en proporciones alélicas (ver Métodos).
Tres pacientes con alteración de la línea germinal ASE (GDLG-31 III-11 #, 83#3103 y#1170 334) eran conocidos portadores de
MLH1
o
MSH2
deleciones. Por el contrario, en 2 pacientes con desequilibrio de cribado inicial ASE para las variantes de patógenos por SSCP o DGGE fue negativa, pero la posterior re-análisis por DHPLC y secuenciación identificó un marco de lectura de
MSH2
(caso GDLM-9#II-2) y un intrónica
MLH1
variante con un efecto potencial sobre el empalme (caso 360#2916, véase más adelante) (Tabla 1 y Tabla S7). En general, las variantes con un papel patogénico clara o potencial se detectaron en 5 de los 8 pacientes con ASE desequilibrada (Tabla 1 y Tabla S7), mientras que en 3 pacientes (GDLG-20#II-1, HCL-27 y GDLV-52#) alterado II-2 ASE fue el único defecto de la línea germinal detectado [23,25].
el análisis de una nueva variante de corte y empalme putativo
in silico
análisis por diferentes predicción de empalme herramientas de software (ver Métodos) indicaron que el efecto de la novela
MLH1
variante c.1731 + 4AG compartida por 2 probandos (360#2916 y#986 de 3487) era incierto. Sin embargo, sugirieron que este cambio podría afectar de empalme por la disminución de la fuerza de la zona donante (disminución promedio de 13%, gama de 7,4 a 22%). La disponibilidad de cDNA en el paciente 360 # 2916 nos permitió probar si la variante c.1731 + 4AG se asoció a un defecto de empalme. Esta alteración era difícil de alcanzar en la prueba inicial de RT-PCR amplificado de ADNc de tipo salvaje debido a que sólo transcripciones fueron revelados por la secuenciación directa o mediante análisis electroforético (datos no mostrados). Sin embargo, con base en los resultados del análisis ASE que muestran un marcado desequilibrio en la expresión alélica (proporción promedio de alelos normalizada 4.7, derivada de ensayos radioactivos y basadas en DHPLC, el cuadro S3), la hipótesis de que un empalme alterada podría ser revelado por DHPLC. Como se predijo, el análisis más sensible DHPLC permitió la detección de un pico principal con un tiempo de retención correspondiente a la transcripción de tipo salvaje y de un pico menor que corresponde a una transcripción más corto menos expresado. La secuenciación confirmó que cuanto menos expresado
MLH1 Versión taquigráfica lleva a un out-of-marco de la omisión de exón 15 (Figura S2).