Extracto
Antecedentes
Los métodos convencionales para la detección del cáncer de pulmón incluyendo la tomografía computarizada (TC) y la broncoscopia son caros e invasivos. Por lo tanto, todavía hay una necesidad de una técnica de detección de cáncer de pulmón óptima.
Métodos
El aliento exhalado de 50 pacientes con diagnóstico histológico de cáncer de pulmón demostrado por las muestras de biopsia de broncoscopia (32 adenocarcinomas, 10 de células escamosas carcinomas, 8 carcinomas de células pequeñas), se analizaron mediante espectrometría de movilidad de iones (IMS) y se comparó con 39 voluntarios sanos. Como evaluación secundaria, se compararon los pacientes con adenocarcinoma con y sin factor de crecimiento epidérmico mutación (EGFR).
Resultados
Un algoritmo de árbol de decisión podría separar a los pacientes con cáncer de pulmón incluyendo adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y el carcinoma de células pequeñas. De cien quince por separado se analizaron compuestos orgánicos (VOC) picos volátiles. Pico-2 tomó nota como n-dodecano utilizando la base de datos IMS fue capaz de separar los valores con una sensibilidad del 70,0% y una especificidad del 89,7%. La incorporación de un algoritmo de árbol de decisión a partir de n-dodecano, una sensibilidad de 76% y se logró especificidad de 100%. La comparación de los picos de VOC entre adenocarcinoma y sujetos sanos, n-dodecano fue capaz de separar los valores con una sensibilidad del 81,3% y una especificidad del 89,7%. Catorce pacientes positivos para la mutación de EGFR mostraron una significativamente mayor n-dodecano que para los 14 pacientes negativos para EGFR (p & lt; 0,01), con una sensibilidad del 85,7% y una especificidad del 78,6%
Conclusión
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en este estudio prospectivo, de COV modelos de picos usando un algoritmo de árbol de decisión fueron útiles en la detección de cáncer de pulmón. Por otra parte, el n-dodecano análisis de pacientes con adenocarcinoma podría ser útil para discriminar la mutación EGFR
Visto:. Handa H, usuba A, S Maddula, Baumbach JI, Mineshita M, Miyazawa T (2014) exhalado para el análisis del aliento Detección de cáncer de pulmón El uso de espectrometría de movilidad iónica. PLoS ONE 9 (12): e114555. doi: 10.1371 /journal.pone.0114555
Editor: Francisco Aguayo Renán, Universidad de Chile, Chile
Recibido: 11 Julio, 2014; Aceptado: 11 de noviembre de 2014; Publicado: 9 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Handa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia y por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica (20410061, 24800068). El Dr. Baumbach fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alemania) en el Centro de Investigación Cooperativa (Sonderforschungsbereich) SFB 876 "Suministro de información por los recursos limitados Análisis", TB1 proyecto "con recursos limitados El análisis de espectrometría de datos". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen intereses en competencia las siguientes: Dres. Baumbach y Maddula eran empleados de B & amp; S Analytik GmbH hasta 2013 y Baumbach es accionista de B & amp; S Analytik GmbH. No hay conflictos de consultoría, patentes, productos en desarrollo, o los productos comercializados. Los autores confirman que este empleo no altera su adhesión con respecto a las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos y material.
Introducción
Recientemente, el equipo de National Lung Screening Trial informó que el cribado con la dosis baja computa tomografía (CT) redujo la mortalidad de cáncer de pulmón en un 20%. TC de baja dosis es una importante prueba de detección; Sin embargo, es caro y hay riesgos asociados con la exposición a la radiación. Por otra parte, el análisis del aliento es fácil de usar y libre de radiación. cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC /MS) [1] - [2] y matrices de sensores químicos: cuarzo microbalanza [3], ondas acústicas de superficie [4], matriz de polímero de carbono [5], sensor colorimétrico [6], nanotubos de carbono de pared única [7] y nanopartículas de oro [8], pueden detectar compuestos orgánicos volátiles (COV) en el cáncer de pulmón de la respiración humana. Además, el olor canino se ha centrado en el diagnóstico de cáncer de pulmón [9] - [10].
espectrometría de movilidad iónica (IMS) con la columna multi-capilar (MCC), un dispositivo de análisis de aliento, puede detectar específica COV en pacientes con cáncer de pulmón [11]. IMS /MCC puede detectar una concentración muy baja de compuestos orgánicos volátiles (normalmente en el ppbv- a PPTV-gama, pg /L para ng /L-gama) en menos de 8 minutos de tiempo total de análisis y es superior a GC /MS, ya que puede aplicarse en la cama-sitio y muestreo directo se pueden tomar sin la preparación [11] - [21]. En Europa, 550 MBq fuentes de radiación β-son aceptables; Sin embargo, para el mercado japonés, regulaciones restringen las fuentes
63Ni-β de radiación a menos de 100 MBq. Por lo tanto en este estudio, se utilizó una fuente de ß-ionización 95 MBq. El objetivo inicial de este estudio es confirmar la reproducibilidad de los resultados de IMS /MCC (usando BioScout: B & amp; S Analytik, Dortmund, Alemania). Para una población japonesa
La quimioterapia de pacientes con cáncer de pulmón depende de estado de rendimiento, características histológicas, la estadificación del tumor, y las características moleculares. Anteriormente, 2 fármacos de quimioterapia de combinación, incluido el platino se ha realizado como tratamiento de primera línea para pacientes con cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células (CPNM) considerada como una sola enfermedad a pesar de su heterogeneidad histológica y molecular. Sin embargo, recientemente, el descubrimiento de anormalidades moleculares tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico mutación (EGFR), y nuevos agentes como EGFR inhibidor de la tirosina quinasa de tratamiento modificado de NSCLC. Esto condujo tratamiento CPNM a la terapia personalizada. Las diferencias de tipo histológico y alteraciones genéticas son los factores más importantes en la decisión del tratamiento actual del cáncer de pulmón. El segundo objetivo de este estudio es confirmar si los patrones de COV son capaces de detectar histológicamente confirmado de cáncer de pulmón y mutaciones del conductor como mutación del EGFR.
Métodos
El análisis de la respiración utilizando un espectrómetro de movilidad de iones ( IMS) se realizó de forma aleatoria en voluntarios sanos y pacientes con cáncer de pulmón en la Escuela de Medicina de la Universidad de Santa Marianna del 1 de septiembre 2011 al 14 de enero de 2013. en todos los pacientes con cáncer de pulmón, se recogieron muestras de aliento antes de la broncoscopia. El Comité de Ética de la Facultad de la Universidad de Santa Marianna aprobó este estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los sujetos (No1820). Este estudio se ha registrado en el Hospital Universitario de la Red de Información Médica Clínica de Registros de Ensayos (UMIN-CTR) (UMIN000006696, 000008328).
El aire exhalado de los 50 pacientes (31 hombres, 19 mujeres), con el cáncer de pulmón confirmado histológicamente por biopsia de broncoscopia se comparó con 39 voluntarios sanos (25 hombres, 14 mujeres). historiales de tabaquismo de los sujetos se midieron utilizando paquetes-año
Ion espectrometría de movilidad (IMS)
IMS (BioScout, B & amp; S Analytik, Dortmund, Alemania). combinada con una columna capilar múltiples ( MCC, tipo OV-5, Multichrom Ltd, Novosibirsk, Rusia) y acoplado a un espirómetro (Ganhorn Medizin Electronic, Niederlauer, Alemania), como se utilizó una unidad de entrada de la muestra CO2-controlada. La Tabla 1 muestra las características del espectrómetro de movilidad de iones
Los principales parámetros de análisis del aliento se han resumido anteriormente [11] - [21]. Y será discutido aquí en breve. IMS se refiere a la detección de los iones formados a partir de análisis a la presión ambiente dentro de un tubo de deriva. La espectrometría de movilidad de iones término se refiere al método de caracterizar el análisis de los gases de su movilidad iónica en fase gaseosa. Normalmente, el tiempo de desplazamiento de los enjambres de iones, formada utilizando fuentes de ionización adecuados a continuación, pasan a través de persianas eléctricas, se miden. movilidad de iones para el análisis puede proporcionar un medio para detectar e identificar los vapores. La velocidad de arrastre está relacionada con la intensidad de campo eléctrico por la movilidad. Por lo tanto, la movilidad es proporcional a la de tiempo inverso de deriva, que se mide a una longitud de deriva fijo. IMS combina la alta sensibilidad y relativamente bajo coste técnico con una adquisición de datos de alta velocidad. El tiempo para adquirir un solo espectro está en el rango de 10 ms a 100 ms. Por lo tanto, IMS es un instrumento adecuado para el control del proceso, pero debido a la aparición de reacciones ion-molécula y relativamente pobre resolución de las especies formadas, en general no es para la identificación de compuestos desconocidos. En comparación con la espectrometría de masas, el recorrido libre medio de los iones es mucho más pequeña que las dimensiones del instrumento. Un ion formado tiene un alto número de colisiones con las moléculas de gas portador en el camino hacia la deriva de Faraday-placa. Sin embargo, debido a las condiciones de alto vacío en la espectrometría de masas, un ion formado habrá normalmente no tienen colisión con otras moléculas durante la deriva. En el pequeño intervalo de tiempo entre las colisiones ión ganará energía del campo eléctrico externo y perder la energía por el siguiente proceso de colisión. En consecuencia, se alcanzará una velocidad de desplazamiento más o menos constante. Por lo tanto, un enjambre de iones a la deriva en tales condiciones experimenta un proceso de separación que se basa en diferentes velocidades de deriva de iones con masas diferentes o estructuras geométricas. Colección de estos iones en un Faraday-placa entrega una señal dependiente del tiempo que corresponde a la movilidad de los iones que llegan. Tal espectro de movilidad de iones contiene información sobre la naturaleza de los diferentes compuestos presentes en el gas de muestra
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En comparación con otros métodos de análisis, IMS tiene una significativamente gran densidad de información con baja carga comparativa en peso, potencia y tamaño. Naturalmente, hay otras técnicas analíticas, que contienen mucho mayor densidad de información como espectrometría de masas. Otras técnicas son más pequeños y más económicos en el poder como los sensores de ondas acústicas de superficie. IMS muestra su especificidad, dependiendo del tamaño de iones, la química y la naturaleza de la muestra. Puede ser muy alta, a través de una combinación de tiempo y la deriva de las propiedades de ionización. Cuando siempre es posible, se prefiere un guión GC-IMS. Por sí mismo IMS es superior a la MS y GC con respecto a los servicios públicos, el consumo de gas, no se requiere de vacío y los requisitos de energía relativamente bajos.
En la espectrometría, unos 95 MBq se aplicó fuente
63Ni ß-radiación para el la ionización del gas portador (aire sintético). Generalmente, el número total de iones formados es ligeramente inferior utilizando 95 MBq en comparación con 550 MBq. Como resultado, el número total de iones con el pico del ion reactivo en aire sintético disminuirá el intervalo lineal marginalmente. Para los casos de aplicaciones como el análisis del aliento en su mayoría a trabajar en los límites de detección del análisis, la ocurrencia de análisis juega un papel más importante que el intervalo lineal. Como se muestra más adelante en este documento, el poder de discriminación y de la capacidad de detección de los análisis en el aliento exhalado no se ven afectados por la diferencia en la actividad de la fuente de ionización
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El espectrómetro se conectó a un MCC polar que funcionaba como una unidad de pre-separación. Para MCC, los análisis de aliento exhalado se enviaron a través de 1000 capilares paralelos, cada uno con un diámetro interno de 40 micras y un espesor de película de 200 nm. El diámetro total de la columna de separación fue de 3 mm.
El aire exhalado de los sujetos fue tomada directamente a través del espirómetro usando una boquilla estándar que contiene un sensor ultrasónico sin registrar el 500 mL de volumen muerto en la espiración. El contenido de un bucle de muestra de 10 ml se añadieron a la entrada de la MCC y transportados a IMS, que estaba conectado directamente a la región de ionización después de pre-separación. El tubo de MCC y la deriva se llevaron a cabo a 40 ° C. El gas portador y de la deriva utilizado fue aire sintético (Nippon MegaCare, Tokio, Japón)
El análisis estadístico
Los picos se caracterizaron utilizando el software Visual Ahora 2.2 (B & amp; S Analytik, Dortmund Alemania). [14], [22] - [25]. Todos los picos encontrados fueron caracterizados por su posición con el tiempo de deriva (correspondiente 1 /K
0-valor) y el tiempo de retención, y su concentración en relación con la altura del pico (tabla 1). Los detalles del procedimiento de análisis de datos se realizaron basan en los métodos descritos en detalle anteriormente [15], [22] - [26] y se resume aquí [27] - [31].
Para los diferentes grupos y cada de los picos, se generaron diagramas de cajas y bigotes. La suma de rangos fue proporcionado por el test de Wilcoxon-Mann-Whitney utilizando la corrección de Bonferroni. Visual Ahora 2.2 se utilizó para clasificar los picos de mayor diferencia entre los grupos
La relación entre los picos encontrados en BioScout y el análisis se realiza por comparación utilizando la base de datos de Visual ahora Versión 110801 (B & amp;. S Analytik, Dortmund, Alemania), que se obtiene por mediciones descritas anteriormente [11], [32] - [34]. En el presente trabajo, los picos se correlacionaron con el análisis más cercano de la base de datos de referencia y se comparan con la posición real del pico.
Resultados
Todos los cánceres de pulmón fueron histológicamente probada por las muestras de biopsia de broncoscopia. En 28 pacientes, la biopsia transbronquial en las lesiones pulmonares periféricas utilizando tanto la ecografía endobronquial con guía-vaina y la navegación broncoscopia virtual fue confirmada. En 22 pacientes, las lesiones traqueobronquiales céntricos pudieron ser confirmados directamente. Los tipos de cáncer de pulmón fueron: 32 adenocarcinomas, 10 carcinomas de células escamosas y 8 carcinomas de células pequeñas. De los 32 pacientes con adenocarcinoma, 14 resultaron ser positivos para la mutación de EGFR, 14 fueron negativos para la mutación de EGFR y 4 pacientes fueron positivos para la fusión de cinasa de linfoma anaplásico (ALK). TNM del cáncer de pulmón mostró puesta en escena: Etapa 1 = 13 pacientes, fase 2 = 6 pacientes, etapa 3 = 8 pacientes y la etapa 4 = 23 pacientes. Siete de 39 voluntarios sanos y en 33 de 50 pacientes con cáncer de pulmón tenían antecedentes de fumar (tabla 2).
Un total de 115 picos diferentes se compararon con respecto a la capacidad de separación en pacientes con cáncer de pulmón y voluntarios sanos (Fig. 1). Diez picos de VOC se identificaron con la significación mayor que 95% (p & lt; 0,01) en pacientes con cáncer de pulmón. De éstos, el pico-2, que tiene el pico más fuerte COV, se observa como el n-dodecano utilizando la base de datos IMS y fue capaz de separar los valores con una sensibilidad del 70,0% y una especificidad del 89,7%. Los otros 9 picos de COV también se identificaron utilizando la base de datos (tabla 3). Además, utilizando un algoritmo de árbol de decisión con n-dodecano como punto de partida, una sensibilidad del 76%, una especificidad del 100%, VPP del 100% y un VPN del 76,4% se registraron (Fig. 2).
de cien quince por picos de COV se detectaron con espectrometría de movilidad iónica en pacientes con cáncer de pulmón y voluntarios sanos.
la comparación de los picos de COV entre adenocarcinoma y sujetos sanos, se encontró que 11 picos de COV tener importancia más alta que 95% (p & lt; 0,01) y n-dodecano (pico 2) era capaz de separar los valores con una sensibilidad del 81,3% y una especificidad del 89,7% (Fig. 3). Además, los pacientes de adenocarcinoma 14 pulmonares positivos para la mutación EGFR muestran un pico de n-dodecano VOC significativamente más alta que para los pacientes de adenocarcinoma 14 pulmonares negativos para la mutación EGFR sin 4 pacientes positivos para la fusión ALK (p & lt; 0,01), con una sensibilidad del 85,7% . y una especificidad del 78,6% (. Figs 4 y 5)
pico 2 fue significativamente mayor en los pacientes con cáncer de pulmón (p & lt; 0,001). El cuadro representa los percentiles 25 y 75, los bigotes representan el rango, y la caja forrada representa la mediana, mientras que los círculos representan la media. pacientes con adenocarcinoma de pulmón reveló un pico significativamente mayor n-dodecano VOC de voluntarios sanos y el pico n-dodecano COV podría separar los valores con una sensibilidad del 81,3% y una especificidad del 89,7%.
Catorce pacientes con mutación de EGFR aparece un pico significativamente mayor n-dodecano con una sensibilidad del 85,7% y una especificidad del 78,6% (p & lt; 0,01). que en 14 pacientes con adenocarcinoma sin la mutación EGFR
al comparar picos de VOC entre carcinoma de células escamosas y el grupo sano, se encontró que 11 picos de COV a tener un significado mayor que 95% y el pico-69 fue capaz de separar el mejor valor con una sensibilidad de 97,4 y una especificidad del 60,0% (p & lt; 0,001) . La comparación de los picos de VOC entre carcinoma de células pequeñas y sujetos sanos, pico-6 se encontró que era significativamente más alta que 95% (p & lt; 0,01) con una sensibilidad de 97,4% y una especificidad del 50,0%. Además, un algoritmo de árbol de decisión podría separar tipos histológicos de cáncer de pulmón y voluntarios sanos (Fig. 6).
Discusión
En este estudio prospectivo, modelos de picos de COV mediante una decisión algoritmo de árboles fueron útiles en la detección de cáncer de pulmón. Se encontró que algunos picos de COV muestran diferencias significativas entre los pacientes con adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas y voluntarios sanos. Además, algunos picos de VOC positivos para la mutación EGFR muestran aumentos significativos, especialmente del pico de n-dodecano, que era el biomarcador más valioso. Se espera que el análisis de VOC usando IMS para ser una prueba de detección importante para el cáncer de pulmón. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que muestra que el análisis de n-dodecano de pacientes con adenocarcinoma podría ser útil para discriminar para la mutación de EGFR.
Análisis de VOC de cáncer de pulmón mediante GC /MS se ha utilizado ampliamente desde 1985 . En GC /MS, se utilizaron algunos modelos de COV para analizar la significación, con una sensibilidad y especificidad del 54 al 100% y 67 a 100%, respectivamente [35]. Westhoff et al. fue el primero en informar el análisis de COV para el cáncer de pulmón utilizando IMS. Informó que 23 picos de COV de aliento exhalado podían separar el cáncer de pulmón y de un control sano, no afectado por la historia de tabaquismo [11]. Sin embargo, las tecnologías de espectrometría utilizando muestras del aliento se vieron afectadas por las condiciones ambientales, olor oral y la nutrición. toma de muestras de las vías respiratorias directa bajo broncoscopia fue insignificante para el olor oral y algunos picos de VOC muestra diferencias significativas entre el sitio del tumor de pulmón y el sitio normal. Por otra parte, algunos picos de VOC, 2-butanol, 2-metilfurano y n-Nonanal, resultaron útiles para adenocarcinoma separada y carcinoma de células escamosas [36] - [37]. Para el adenocarcinoma de pulmón, n-dodecano se encontró que era un importante pico de COV tanto para el análisis del aliento y el muestreo broncoscopia y se informó de que se asocia a los pacientes con cáncer de pulmón [36] - [37].
Se sabe que los pacientes con CPNM Este de Asia tienen mayores casos de mutación de EGFR [38] - [40]. mutaciones del conductor, incluyendo EGFR, se han centrado en el cáncer de pulmón y otros tumores malignos [41] - [43]. La mutación de EGFR tiene una instancia mayor que otras mutaciones del conductor en el cáncer de pulmón y es sensible al inhibidor de tirosina quinasa de EGFR. Los resultados de este estudio muestran que el adenocarcinoma de pulmón positivo para la mutación de EGFR tiende a aumentar la intensidad de algunos picos de COV utilizando IMS. EGFR puede tener un metabolismo específico que puede producir diversos compuestos orgánicos volátiles. La detección de la mutación EGFR necesita pieza quirúrgica, broncoscopia o tejidos biopsia con aguja guiada por TC, fluidos de lavado bronquial y derrame pleural con células tumorales. Un estudio anterior informó el aliento exhalado condensado podría evaluar la mutación de EGFR. Sin embargo, todavía era difícil de detectar mutaciones de EGFR en el condensado de aire exhalado ya que los componentes celulares se presentan en el condensado de aire exhalado no son representativos del tumor [44] - [45]. El análisis de los patrones de COV, incluyendo un algoritmo de árbol de decisión puede ser útil para detectar la mutación de EGFR emitida de líneas celulares de cáncer de pulmón en el futuro.
Este estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la muestra fue pequeño y se requieren estudios de muestras más grandes. Aunque se necesitan más muestras de aliento de pacientes para superar los problemas potenciales con las investigaciones estadísticas, en anteriores tamaño de las muestras para el análisis de la literatura aliento había sido menor si se compara con el presente estudio [36] - [37]. Al lado de la principal cuestión a tener más muestras de aliento de pacientes que los picos para superar los problemas potenciales con las investigaciones estadísticas en general, aquí 89 muestras fueron investigados y se encontraron 115 picos. En segundo lugar, VOCs en pacientes con cáncer de pulmón pueden ser afectados por el tabaquismo historia. Debe tenerse en cuenta, si las diferencias no se relacionaron con el consumo de tabaco en pacientes con cáncer de pulmón, lo que fue considerado en detalle por Westhoff y col. [11] muestra, que en ambos grupos, incluyendo un mayor número de fumadores y no fumadores la diferenciación utilizando la espectrometría de movilidad iónica se realizó con éxito. Para las moléculas investigadas por IMS en este estudio, las diferencias eran independientes de la condición de fumador y significativo para ambos grupos. En el estudio de Westhoff et al. [11]. no había ninguna base de datos disponible para identificar el análisis. Recientemente, Darwiche et al. [36] mostró mediante la comparación de las mediciones de la toma de muestras de aire desde el mismo paciente en el sitio de localización del cáncer y no cáncer durante la broncoscopia, diferencias encontradas estaban relacionados con el lugar de la muestra fue tomada, directamente sobre las células cancerosas o en el otro sitio de pulmón . En tercer lugar, de conformidad con las regulaciones japonesas, las restricciones de las fuentes
63Ni β-radiación de menos de 100 MBq se han establecido para este estudio piloto japonés, que es más baja que las restricciones europeas. Sin embargo, los resultados del estudio actual demuestran que IMS con una fuente de β-radiación 95 MBq podría discriminar entre voluntarios sanos y pacientes con cáncer de pulmón con éxito. Por lo tanto, la creación de una base de datos para la población asiática en relación a los picos de VOC y sustancias puede ser requerida. En estudios futuros, se necesitan ensayos multicéntricos utilizando IMS para analizar el cáncer de pulmón.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer al Sr. Jason Tonge para la preparación de manuscritos.