Extracto
Ef son la mayor familia de receptores tirosina quinasas. Junto con sus ligandos, las efrinas, cumplen múltiples funciones biológicas. la expresión aberrante de Ephs /efrinas que representan un aumento del receptor Eph a ephrin relaciones ligando es un factor crítico en la tumorigénesis, lo que indica que la regulación estricta de Ef ephrin y de expresión es esencial para el comportamiento normal de las células. Las regiones 3 'no traducidas (3'UTRs) de transcripciones juegan un papel importante todavía ampliamente subestimado en el control de la expresión de proteínas. Basado en la suposición de que paralogues de grandes familias de genes pueden exhibir una organización conservada de elementos reguladores en sus 3'UTRs se aplicó un novedoso enfoque de la bioinformática /biología molecular a las secuencias 3'UTR de Eph transcripciones /ephrin. Se identificaron los grupos de motivos que constan de elementos de poliadenilación citoplasmáticos (CPE), elementos ricos en AU (Ares) y sitios de unión Hur. Estos grupos se unen múltiples factores de ARN-estabilizantes y desestabilizantes, incluyendo Hur. Sorprendentemente, a pesar de su papel ampliamente aceptado como una proteína de ARNm-estabilización, una vez más demuestran que la unión de Hur a estos grupos en realidad desestabiliza transcripciones Ef /ephrin en líneas de células tumorales. En consecuencia, desmontables de Hur modula en gran medida la expresión de múltiples Ephs /efrinas tanto en el mRNA y los niveles de proteína. Juntos, nuestros estudios sugieren que la sobreexpresión de Hur como se encuentra en muchos tumores progresivos podría ser causante de desarreglada receptor Eph a las relaciones de ligando ephrin que conduce a un mayor grado de invasividad tejido
Visto:. Winter J, Roepcke S, S Krause , Müller CE, Otto A, Vingron M, et al. (2008) Análisis Comparativo 3'UTR permite la identificación de clusters reguladoras que Drive Ef /ephrin expresión en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 3 (7): e2780. doi: 10.1371 /journal.pone.0002780
Editor: Thomas Preiss, Victor Chang Instituto de Investigación Cardiaca, Australia |
Recibido: Abril 23, 2008; Aceptado: 25 Junio 2008; Publicado: 23 de julio 2008
Derechos de Autor © 2008 Winter y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por la Deutsche VolkswagenStiftung y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 577, proyecto A6 a SS)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las regiones 3 'no traducidas (3'UTRs) de los ARNm juegan un papel crucial en la regulación postranscripcional de la expresión génica, por ejemplo mediante la modulación de la localización de ARNm [1], [2], [3], la estabilidad [4], y la traducción [ ,,,0],5], [6]. Aparte de tener sitios de unión para los microRNAs recientemente descubiertos, 3'UTRs pueden albergar motivos que interactúan con proteínas específicas de unión a ARN. Estos motivos son normalmente elementos de secuencia corta cuya actividad puede ser influenciado por su estructura secundaria [7]. Por lo tanto, su identificación mediante algoritmos informáticos es difícil y por lo general produce numerosos falsos positivos
Para identificar los motivos 3'UTR se utilizó un nuevo enfoque que se basa en dos supuestos:. En primer lugar, no sólo las regiones sino también elementos dentro de codificación la 3'UTRs que son esenciales para la función de genes podrían ser conservadas entre los parálogos de las grandes familias de genes; En segundo lugar, los ARNm que codifican proteínas que interactúan funcionalmente o cumplen funciones redundantes podrían exhibir una organización conservada de elementos reguladores en sus 3'UTRs. Para investigar esto, elegimos las familias de ligandos ephrin y receptores Eph. La familia de receptores Eph es la mayor subfamilia de tirosina quinasas receptoras. receptores Eph se dividen en dos subclases en base a sus especificidades de ligando. En general, la clase Ef A receptores (EphA) se unen a ligandos ephrin A glicosilfosfatidilinositol-anclado (ephrinA) (con la excepción de EphA4), mientras que Ef clase B receptores (EphB) se unen a ligandos transmembrana que contienen el dominio ephrin B (ephrinB) [ ,,,0],8]. Sin embargo, los datos más recientes sugieren que las interacciones también pueden ocurrir en todas las clases [9]. Tras la unión a sus ligandos ephrin afines, Ef receptores autofosforilarse y activar cascadas de señalización corriente abajo (señalización hacia delante). A pesar de que no poseen actividad catalítica a sí mismos, ambas clases de ligandos ephrin pueden activar las vías de transducción de señales después de la interacción con los receptores Eph (inversa de señalización) [10].
A nivel celular, la señalización a través de receptores Eph y efrinas clientes potenciales a cualquiera de aumento de la adhesión (atracción) o disminución de la adherencia (repulsión) de las células que interactúan. Estas respuestas son importantes en la mediación de una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo la angiogénesis, la segregación de células, la unión celular, la morfogénesis celular y la motilidad celular [11]. Varios de estos procesos están fuera de control durante la tumorigénesis, poniendo de relieve un papel crítico potencial para la señalización /ephrin Eph en el desarrollo de muchos cánceres humanos. En línea con la fisiopatología, varios Ephs y efrinas, incluyendo EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB3, y ephrin-A1, se sobreexpresan en una variedad de tumores, y presentan en su mayoría propiedades promotoras de tumores [11], [12 ].
los patrones de expresión de Ephs y efrinas son complejas, y su expresión correcta es esencial para el correcto funcionamiento de muchos de los procesos mencionados anteriormente. Por lo tanto, una regulación afinada de expresión Ef /ephrin tanto a nivel transcripcional y posttranscriptional parece ser indispensable. A nivel transcripcional, receptores Eph y ligandos ephrin se han implicado como dianas aguas abajo de diversos factores de transcripción, incluyendo proteínas del homeodominio [13] y la familia de proteínas p53 [14], [15], [16], [17]. Se sabe mucho menos acerca de la regulación postranscripcional. Sin embargo, hay evidencia de la participación de la 3'UTR:. Upregulation del receptor de EphA2 en los axones que cruzan la línea media está mediada por una secuencia altamente conservada en 3'UTR de la transcripción que contiene un elemento de poliadenilación citoplasmática (CPE) [18]
Aquí hemos recopilado las secuencias 3'UTR de los receptores Eph del ratón y los ligandos ephrin y los seleccionados para
cis-actuando
motivos de secuencia. Hemos identificado tres tipos diferentes de motivos en varias de las 3'UTRs Ef /ephrin: CPEs, elementos ricos en AU (Ares), y Hur sitios de unión. Mientras que se encontraron algunos de estos motivos para ser distribuidos aparentemente al azar en los respectivos 3'UTRs, se encontraron otros que se vista de las agrupaciones que están altamente conservadas entre diferentes especies de vertebrados. Por otra parte, hemos identificado varias proteínas de unión a ARN, incluyendo Hur, que interactúan con estos grupos, y se muestra que EfnA2, EphA2, y EphA4 son objetivos directos de posttranscriptional Hur en líneas celulares de cáncer. Sorprendentemente, se encontró que Hur no actúa como un factor de estabilidad en la expresión de estos Ef /efrinas, sino que desestabiliza los mensajes respectivos.
Resultados
Las regiones 3 'no traducidas de las transcripciones de las ratón Ef receptores y ligandos ephrin
Para obtener una completa colección de secuencias 3'UTR de longitud completa de los ARNm de los receptores Eph y ligandos ephrin, primero se extrae todas las secuencias Ef /ephrin disponibles de ratón a partir de la base de datos GenBank de la NCBI. Sólo se consideraron las transcripciones poliadenilados a ser de longitud completa, y sólo truncar tales variantes que contienen tanto (i) una secuencia de hexámero consenso cerca del sitio de escisión y (ii) un poli (A) de la cola se incluyeron en el análisis. transcripciones incompletas se extendieron a la cola de poli (A) alineando 3'complete datos de EST utilizando el programa de software CAP3 (para números de acceso ver Tabla S1). isoformas truncadas C-terminal no se incluyeron en el estudio.
Mientras que las regiones y los límites exón /intrón [19] son altamente conservadas entre los diferentes miembros del receptor y ligando ephrin familias de genes Ef, los 3'UTRs de codificación de las transcripciones muestran una alta diversidad de longitud y secuencia: los de los ligandos ephrin puede variar en 552 pb (EfnA4) a 3171 pb (EfnB2) y las de los receptores Eph de 198 pb (EphB6) a 3310 pb (EphA4) (Fig. 1, el cuadro S1). Por otra parte, no hemos podido detectar ninguna conservación significativa en el nivel de la secuencia, ya sea entre los 3'UTRs de las transcripciones de los receptores Eph o las de ligandos ephrin (datos no mostrados).
Esquema de la 3'UTRs de Ef /efrinas. Putativa
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motivos de secuencia se destacan en diferentes colores, la conservación entre el ser humano /ratón, humano /ratón /Xenopus se muestra por asteriscos /círculos abiertos.
Orthologous conservación entre humanos y el ratón varió de 60% a 80%, que es comparable con el valor en todo el genoma media de 69% [20].
sitios de poliadenilación alternativos se encontraron en las 3'UTRs de EfnA4, EfnB2, EphA3, y EPHA7 (Fig. 1).
las regiones 3 'no traducidas de las transcripciones de los receptores Eph y ligandos ephrin contiene muy conservadas
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secuencia: motivos
Como se ha señalado anteriormente, las secuencias de Eph 3'UTRs /ephrin están muy mal conservadas entre parálogos. Sin embargo, la regulación postranscripcional menudo se basa en corto
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motivos de secuencia, y genes que codifican proteínas que interactúan funcionalmente y /o podrían esperar los genes pertenecientes a la misma familia de genes que contienen motivos conservados 3'UTR. Para detectar este tipo de elementos se exploraron las 3'UTRs de las transcripciones Ef /ephrin ratón para el conocido
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motivos de secuencia (ver http://genereg.molgen.mpg.de/cgi-bin/regEchse/regEchse.pl: motivos que han sido incluidos en la búsqueda se enumeran en "seleccione motivo conocido; Hur sitios de unión se identificaron utilizando TransTerm http://uther.otago.ac.nz/Transterm.html). Sorprendentemente, esto condujo a la identificación de tres prominentes motivos de economía planificada, Ares y vinculante Hur-sitios en varios de los 3'UTRs Ef /ephrin (Fig. 1). CPEs son unidades de control de la traducción que debe residir en estrecha proximidad al sitio poli (A) para ser funcional [21]. Por lo tanto, en la Figura 1, sólo los CPEs que cumplen este criterio [0-250 pb distancia de poli hexámero (A)] se representan. Hur interactúa con múltiples repeticiones AUUUA [22] y se extiende T-ricos con alta afinidad. Más recientemente, los intentos se han realizado para definir más específicamente un sitio Hur vinculante [23], [24]. En una serie de experimentos de unión Meisner et al. deducida de que el sitio de unión Hur es el NNUUNNUUU 9-mer. Sorprendentemente se ha encontrado este motivo que estar presente en todos los objetivos Hur validados, y un único punto de mutación en el motivo es suficiente para destruir completamente la unión Hur. En este estudio la búsqueda de sitios de unión Hur se basó en este motivo. Tanto Ares y sitios de unión Hur se encuentran en todas las partes de la 3'UTRs. Algunos de los motivos se encontraron aislados, elementos no se superponen. En otros casos, se encontraron CPEs a solaparse con AREs o sitios de unión Hur, o AREs con sitios de unión a Hur. Es de destacar que los tres tipos de motivos, algunos en varias copias, se encuentran juntos en grupos (Fig. 1, el cuadro S2). Estos grupos muestran dos patrones de localización distintas: situado en cualquier parte del 3'UTR sin preferencia obvio para una región especial (por ejemplo EphA3, ver Fig. 1) o específicamente dispuestos en la región 3'terminal de la 3'UTR en las proximidades de el sitio de poliadenilación (por ejemplo EphA2, ver Fig. 1).
En 3'UTRs ortólogos,
cis-actuando
elementos de secuencia con importantes funciones reguladoras se espera que se conservan por medio de la evolución [24] . Para 18 de los 3'UTRs Ef /ephrin 21 ratones investigados en este estudio, las secuencias de ortólogos humanos estaban disponibles, y el 44%, 74% y 72% de CPE, Ares, y Hur sitios de unión, respectivamente, resultaron ser conservados entre las dos especies (Fig. 1 y 2). La más obvia, casi la totalidad de los motivos dispuestos en racimos se conservan. Además de los mamíferos, las secuencias de ortólogos de los 3'UTRs de EfnB2 y EphA2 de los vertebrados inferiores
Xenopus laevis
están disponibles. Una vez más, en especial se comprobó que esos motivos que se disponen en racimos y ubicados cerca del sitio poli (A) debe ser conservado en esta especie (Fig. 1 y 2).
Multialignments de ejemplos representativos de los motivos que se encuentran agrupadas en las partes 3'terminal del EfnA1, EfnA4, EphA2 y EphA4 3'UTRs. Las posiciones de los CPEs, Ares, sitios de unión Hur, así como el hexámero consenso de la señal de poliadenilación se indican debajo de las alineaciones.
Identificación de proteínas que se unen a motivos de secuencia en los 3'UTRs /ephrin Eph
sobre la base de los siguientes criterios, se seleccionaron las partes 3'terminal de la 3'UTRs EfnA1, EphA2, y EphA4 para una caracterización adicional. En primer lugar, cada uno contiene la secuencia de motivos en clúster que constan de CPE y sitios de unión Hur. EphA2 y EphA4, además, contienen AREs en estos racimos. Por lo tanto, las partes 3'terminal de estos 3'UTRs parecían ser buenos candidatos para la identificación de proteínas que interactúan con los grupos de motivos. En segundo lugar, todos los tres grupos de motivos muestran un alto grado de conservación ortólogos en humanos (Fig. 1). Además, el grupo de EphA2 está altamente conservada en
Xenopus laevis
(por EfnA1 y EphA4, no información de la secuencia estaba disponible para esta especie). En tercer lugar, la región 3'terminal de la EphA2 3'UTR ya se ha demostrado para cumplir importantes funciones reguladoras [18].
Para probar para la unión de las proteínas que interactúan con estos grupos con motivos, los transcritos marcados radiactivamente que abarca la 3 "regiones terminales de la EfnA1, EphA2, y EphA4 3'UTRs (Fig. 3a) se incubaron con lisado de cerebro de ratón y UV-reticulado. Cerebro de ratón se utilizó en este experimento porque varios son- conocidos y proteínas de CPE de interacción son altamente expresado en este órgano. Los complejos se resolvieron por electroforesis a través de geles de acrilamida SDS, y los geles secos se expusieron a película de rayos X. Curiosamente, este método no sólo identificó varias proteínas que se habían unido a los grupos de motivos de las tres regiones 3'terminal, pero también reveló un patrón de bandas de superposición (Fig 3b.): Las proteínas de 30 a 45, 50 y 75 kD unido a las tres secuencias, aunque la afinidad a las regiones 3'terminal de la EphA2 y EphA4 3'UTRs parecía mucho más alta que a la de la EfnA1 3'UTR. Las proteínas de ~ 60 kD y 70 eran exclusivamente detectable en los carriles EphA2 y EphA4 (Fig. 3b). Las identidades de las proteínas que interactúan se determinaron en un ensayo de pulldown ARN-proteína con el posterior análisis de la fracción eluida por espectrometría de masas. Marcado con biotina
en CD -
in vitro
transcripciones -transcribed correspondientes a la región 3'terminal de la EphA2 3'UTR se incubaron con lisado de cerebro de ratón y se bajó con perlas magnéticas de estreptavidina. Transcripciones en orientación antisentido con respecto a la región elegida se usaron en un experimento de control negativo. Los complejos se resolvieron mediante SDS-PAGE, se tiñeron con Coomassie coloidal, y las bandas enriquecen específicamente en la muestra obtenida con los transcritos de sentido se analizaron por ionización electrospray (ESI) espectrometría de masas. Curiosamente, además de varias proteínas que se sabe que están implicados en la transcripción y mRNA de empalme-mielina factor de expresión 2 (MYEF-2); heterogénea nuclear ribonucleoprotein M (hnRNP M); lejos contra la corriente proteína 1 de unión (proteína de unión FUSE-1, FBP); factor de empalme, prolina y glutamina-ricos (PSF) -nos identificó AUF1 y KSRP, dos proteínas de unión son (ARE-BP) que son conocidos reguladores de la estabilidad del mRNA (Fig. 3c, Tabla 1). Para confirmar la interacción se repitió el ensayo desplegable ARN-proteína. Esta vez, sin embargo, los complejos de ARN-proteína se transfirieron a membranas de PVDF y se detectaron las proteínas que interactúan con anticuerpos específicos. Como era de esperar, KSRP une a la sonda de ARN correspondiente a la región terminal de EphA2 3'UTR pero no con el control negativo antisentido (Fig. 3d). Curiosamente, en relación con AUF1, sólo pudimos detectar la unión de las isoformas de p45 y p42, pero no los p40 y p37 isoformas. Además ARE y CPE-motivos, la parte 3'terminal de la EphA2 3'UTR alberga un sitio de unión de la Hur NNUUNNUUU consenso. Sin embargo, Hur no fue identificado como una proteína que interactúan en el análisis de espectrometría de masas. Para probar directamente para la unión de Hur se incubaron la membrana de transferencia de Western con un anticuerpo dirigido contra la proteína Hur endógeno. Como era de esperar, Hur se encontró a interactuar específicamente con la región 3'terminal de la EphA2 3'UTR.
(A) Esquema de 3'UTRs de EfnA1, EphA2 y EphA4 como se muestra en la figura. 1. Las sondas utilizadas para los ensayos de UV-reticulación y desplegables ARN-proteína se indican (B) UV-reticulación con lisado de proteína a partir de cerebro de ratón y radiactivamente sondas marcadas correspondientes a motivos agrupados presentes en las partes 3'terminal de EfnA1, EphA2 y EphA4 3 'UTRs. (C) 10% de SDS-gel teñido con Coomassie coloidal que muestra las proteínas eluidas de estreptavidina perlas acopladas a una sonda biotinilado correspondiente a la parte 3'terminal de la EphA2 3'UTR (carril izquierdo) o a la secuencia antisentido respectivo (carril de la derecha ). bandas diferenciales fueron extirpados y analizados por espectrometría de masas. se dan identidades proteína. análisis (D) de transferencia Western de pulldowns ARN-proteína con lisado de proteína a partir de cerebro de ratón y sondas biotiniladas correspondientes a la parte 3'terminal de la EphA2 3'UTR (carril de la izquierda) o a la secuencia antisentido respectivo (carril derecho). KSRP, AUF1, Hur y hnRNP A0 se detectan utilizando anticuerpos específicos. análisis (E) Westernblot de pulldowns ARN-proteína con lisado de proteína a partir de cerebro de ratón y sondas biotiniladas correspondientes a las partes 3'terminal de Eph 3'UTRs /ephrin o a la secuencia de EphA2 antisentido. Hur y AUF1 se detectan utilizando anticuerpos específicos.
Sobre la base de semejanzas de talla de 30-45 kD, el ensayo de reticulación UV sugerido unión de las mismas proteínas que las partes del 3'terminal EfnA1, EphA2, y EphA4 3'UTRs (Fig. 3b). Esto podría indicar que la expresión de varios de los receptores y efrinas Eph está regulado por un mecanismo compartido. Para demostrar que las proteínas idénticas se unen a los grupos con motivos identificados en varios 3'UTRs /ephrin Ef, hemos realizado ensayos desplegables ARN-proteína adicional con
en CD -
in vitro -transcribed Opiniones y biotina 3 ' partes terminales de todos los 3'UTRs /ephrin Eph que contienen Ares, CPEs y /o sitios de unión Hur (Tabla 2). Además, se utilizó 'parte terminal de una Ef 3'UTR que no contiene un motivo de este tipo (EphA1; el único motivo identificado en el 3'UTR de esta transcripción es un sitio de unión Hur situado fuera de la 3' de la 3 parte terminal de ). Una vez más, los complejos se transfirieron a membranas de PVDF, y éstas se incubaron con anticuerpos para detectar la proteína de 32 kD Hur y los cuatro isoformas AUF1, p37, p40, p42, y p45, respectivamente. Para nuestra sorpresa, se encontró que tanto Hur y AUF1 p42 /p45 obligados a algunos, pero no todos los transcritos (Figura 3e.), Y los modelos de unión de ambas proteínas fueron sólo parcialmente superpuestas: tanto Hur y AUF1 interactuaron con terminal 3 ' regiones del EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, y EphA6 3'UTRs, pero sólo AUF1 unido a las regiones terminales 3 'de EfnA1, EphA3, y EphB1 3'UTRs (Fig. 3e). Sin la unión de cualquiera AUF1 o Hur fue visto con la región 3 'terminal de EphA1, que no contiene un motivo.
Una mirada más cercana a la composición de los diferentes elementos de los extremos 3'UTR reveló que AUF1 había unido a todos son las transcripciones que contienen excepto EPHA7, sino también a cuatro transcripciones que no contenían un ARE (EfnA1, EfnB2, EphA6, EphB1). Para la unión de Hur, la presencia del sitio de unión consenso Hur era esencial, pero no suficiente: no pudimos detectar la unión de Hur a cualquiera de las transcripciones que carecen de este sitio; Sin embargo, de los ocho transcripciones que contienen este sitio, Hur obligado a EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, y EphA6 pero no a EfnA1, EfnB3, y EphB1.
Debido a Hur se une al ARN de una sola hebra, que era propuesto que el sitio de unión Hur podría tener que asumir una conformación particular de someterse alta afinidad Hur vinculante [24]. Por lo tanto, hemos utilizado el programa Mfold para predecir estructuras secundarias en las sondas 3'UTR que habíamos utilizado en el ensayo desplegable ARN-proteína. De acuerdo con los resultados de Meisner et al. (2004), se encontró que había interactuado Hur solamente con esas transcripciones en el que se predijeron los sitios de unión Hur que se ubicará en bucles de cadena sencilla (Fig. 4a). Los sitios de unión Hur de las transcripciones restantes eran todos (al menos parcialmente) situadas en regiones de doble cadena (Fig. 4b) y por lo tanto posiblemente inaccesible a Hur.
que se muestran son las estructuras secundarias de las sondas utilizadas en UV -crosslinking y ARN-proteína experimentos desplegables que corresponden a las partes 3'terminal de 3'UTRs Eph /ephrin como se predijo por Mfold. (A) Las sondas con Hur sitios ubicados en las regiones de cadena sencilla (asteriscos) que mostraron unión de alta afinidad de unión a Hur. (B) Las sondas, donde se prevé que ser albergado en las regiones de doble hebra sitios de unión Hur.
La estructura secundaria de una transcripción parcial relativamente corto puede diferir en gran medida de la estructura de toda la 3'UTR y por lo tanto podrían no reflejar la conformación
in vivo
. Para obtener una perspectiva de la accesibilidad de los sitios de unión Hur albergadas en los 3'UTRs /ephrin Eph se utilizó el algoritmo de Mfold para predecir las estructuras secundarias de todo el 3'UTRs. Curiosamente, aparte de EfnB3 y EphA1, todos 3'UTRs /ephrin murinos Ef contienen al menos un sitio de unión Hur prevé que sea parte de una región de cadena sencilla en o fuera de los grupos de motivos descritos, lo que sugiere un papel particularmente importante de Hur en la regulación de la expresión Ef /ephrin (Fig. S1).
Hur regula la expresión de Ef /efrinas en líneas celulares de cáncer de
la expresión anormal de Ef /efrinas se ha informado en varios tipos de cáncer, y se asocia con un mal pronóstico y estadios avanzados de malignidad [11], [25]. Mientras tanto esfuerzo se ha puesto en el esclarecimiento de la regulación transcripcional de Ef /efrinas en líneas celulares de cáncer y tejidos cancerosos, la regulación postranscripcional se ha descuidado. Setenta y dos por ciento de los sitios de unión Hur de ratón 3'UTRs Ef /ephrin están conservados en humanos (véase más arriba). Para probar si nuestros hallazgos en las células de ratón también se aplican a las células humanas que inmunoprecipitaron Hur de la línea celular de carcinoma cervical HeLa y la línea celular de astrocitoma /glioblastoma U373MG (Fig. 5a), utilizando un anticuerpo anti-Hur y realizó RT-PCR en el inmunoprecipitar con cebadores específicos para EfnA2, EphA2, y EphA4, que son tres los ARNm conocidos por ser altamente expresado en varios tipos de cáncer [11]. Como control negativo se realizó el mismo procedimiento con inmunoglobulinas no específicas en lugar de anti-Hur de anticuerpos (Fig. 5a y b), y como control negativo para la RT-PCR se realizó la etapa de cDNA de síntesis sin transcriptasa inversa (datos no mostrados). En comparación con el control de IgG negativo, no estaba claro enriquecimiento de EfnA2, EphA2, y los mensajes EphA4 en los inmunoprecipitados de las dos líneas celulares (Fig. 5b) que indica que Hur había unido a los mRNAs Eph /ephrin
in vivo
. De nota, mensaje GAPDH no diana también podría ser amplificado, aunque menos eficiente y en la misma medida en ambos grupos de IP; este hallazgo se ha descrito antes [23], y verificado el uso de cantidades iguales de material de entrada.
inmunoprecipitación
(A) de la endógena Hur. HeLa o U373 lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-Hur o con IgG no específicas. Los inmunoprecipitados se cargaron en 10% SDS-Páginas y se analizaron por Westernblot con anti-Hur anticuerpo; HC, cadena pesada; LC, cadena ligera (B) RT-PCR de ARN después de la extracción de los inmunoprecipitados Hur e IgG con cebadores específicos para EfnA2, EphA2, EphA4 y GAPDH.
En otra serie de experimentos hemos probado si Hur regula la expresión posttranscriptionally /ephrin Ef. Llamamos abajo Hur en células HeLa y U373MG utilizando dos oligonucleótidos diferentes Hur-siRNA (Fig. 6a y datos no mostrados) y se detectaron EfnA2, EphA2, y EphA4 mRNAs de Real-Time RT-PCR 72 h después de la transfección. Hur ha sido reportado como una proteína estabilizante de ARNm, lo que sugiere que su derribo llevaría a una reducción de la expresión de ARNm /ephrin Ef. Sin embargo, mientras que la cantidad de ARNm de EphA2 sí se redujo después de derribo de Hur, para nuestra sorpresa, los niveles de mRNA EfnA2 y EphA4 aumentaron significativamente (Fig. 6a). Para probar si los cambios observados en el nivel de ARN reflejan la situación a nivel de proteínas cargamos la misma cantidad de proteína lisados de células HeLa y células U373 después de Hur knock-down y realizó el análisis de Western blot con anticuerpos de detección de EphA2 y EphA4 (Fig. 6b) . En confirmación de los experimentos de PCR en tiempo real, se encontró que la expresión de la proteína EphA2 se redujo drásticamente por 10 veces en HeLa y 5 veces en las células U373 después de knock-down de Hur, mientras que la expresión de EphA4 se incrementó en 1,2 veces y 2 veces, respectivamente (Fig. 6b). oligonucleótidos ARNsi de control no tenían un efecto significativo en EphA2 o EphA4 expresión de la proteína cuando se compara con un control transfectadas de manera simulada. De nota, el anticuerpo EphA4 disponible en el mercado usado en este experimento detecta tres bandas diferentes en células HeLa (Fig. 6B), todas las cuales se upregulated después Hur knock-down. Dos de estas bandas pueden corresponder a dos isoformas diferentes EphA4 con una diferencia de tamaño de 37 aminoácidos que se muestran en el navegador del genoma. La tercera banda puede representar una isoforma HeLa-específico que aún no se ha detectado en cualquiera de las bases de datos convencionales
.
Hur fue derribado con un oligonucleótido Hur RNAi específico en HeLa y células U373 (A) la expresión de ARNm de EfnA2, EphA2 y EphA4 72 horas después de la transfección de un oligo específico Hur RNAi se comparó con la transfección de un oligo de control no silenciamiento medido por tiempo real RT-PCR. Se muestran relaciones entre los niveles de expresión después de la caída Hur y transfección de oligonucleotodides control no silenciamiento. Los valores se normalizaron a GAPDH. análisis (B) Westernblot de expresión de la proteína de EphA2, EphA4 (tres isoformas, ver las flechas), Hur y GAPDH 72 horas después de la caída de Hur (panel superior, carril 3) con anticuerpos específicos en comparación con un control mock (carril 1) así como un control de siRNA no silenciar (carril 2). La cuantificación de las bandas (contra GAPDH) se realizó utilizando el software Image Quant 5.2 (panel inferior). Las veces de aumento o disminución de la expresión se representan.
Para distinguir entre los efectos indirectos y la transcripción de ARNm de estabilización causadas por el derribo de Hur, bloqueamos la transcripción con actinomicina D 48 h después de la transfección de siRNA Hur oligos o oligos de control y medición de los mRNA vidas medias de EfnA2, EphA2, y por EphA4 en tiempo real RT-PCR. Sorprendentemente, se encontró que knock-down de Hur aumenta la vida media de todos los ARNm Ef /ephrin probadas. Esto sugiere que Hur desestabiliza estos ARNm (Fig. 7a), y que la disminución en el mensaje de EphA2 detectado después de knock-down de Hur puede ser causada por la inhibición de la transcripción secundaria EphA2
.
(A) 48 horas después de la transfección de un oligonucleótido específico Hur RNAi o un control de oligonucleótidos las vidas medias de EfnA2, EphA2 y EphA4 mRNAs se evaluaron mediante el uso de 5 mg /ml de actinomicina D; mRNA vidas medias se midieron por tiempo real RT-PCR, la expresión de ARNm se normalizó a GAPDH. (B) 3'terminal partes de EfnA2, EphA2 y EphA4 3'UTRs fueron clonados en el vector pGL3 promotor y transfectadas en células HeLa. 30 horas después de la transfección las células se recogieron y se luciérnaga se midió la actividad de luciferasa. Para la normalización una luciferasa de Renilla plásmido (PRL) fue co-transfectado. (C) 24 horas después de la transfección de una célula HeLa oligonucleótidos Hur RNAi específicas fueron transfectadas con construcciones del promotor pGL3 como se describe en (B), y 48 horas más tarde se midió la actividad luciferasa de luciérnaga, y se normalizaron a la co-transfectadas plásmido PRL.
Para confirmar aún más que los efectos observados son mediados por
cis
secuencias albergadas en las partes 3'terminal del EfnA2, EphA2, y EphA4 3'UTRs-actuando, pGL3P reportero plásmidos llevar estas secuencias (incluyendo los sitios de unión Hur) aguas abajo del ADNc de la luciferasa de luciérnaga se transfectaron en células HeLa. Para la normalización, el vector pRL que contiene el
Renilla
cDNA de la luciferasa fue co-transfectado. pGL3P construcciones que contienen el EfnA2, EphA2 o EphA4 secuencias 3'terminal produjeron significativamente menos luciérnaga actividad luciferasa que el vector pGL3P sin insertos 3'UTR, lo que confirma una función de desestabilización para las partes 3'terminal de estos 3'UTRs (Fig. 7b). Después de knock-down de Hur con un oligo RNAi específica este efecto desestabilizador podría ser rescatado parcialmente, lo que sugiere, además, una función de desestabilización para la proteína Hur (Fig. 7c). Knock-down de Hur con un oligo iARN una región diferente del ARNm Hur mostró resultados comparables (datos no mostrados). fuera de objetivo efectos fueron excluidos por transfección de un vector pGL3P sin sitios de unión Hur.
Discusión
En este estudio se utilizó un enfoque de biología de la bioinformática /molecular para detectar la 3'UTRs de transcripciones de Ef receptores y ligandos ephrin para putativo
cis-actuando
motivos de secuencia y caracterizar su función biológica.
Se demuestra que varios de los 3'UTRs Ef /ephrin, aunque exhibiendo divergencia sustancial entre parálogos en términos de longitud y secuencia, contienen grupos de motivos conservados evolutivamente compuestos de la superposición de CPEs, Ares, y los sitios de unión a Hur. Se identificaron Hur y varias otras proteínas implicadas en el control de la estabilidad del mRNA como parejas de interacción de estos grupos. El cambio de los ratones a líneas celulares de cáncer humano, también obtuvimos evidencia de que la expresión de Ef /efrinas se regula posttranscriptionally través de la interacción de los grupos de secuencias conservadas y Hur, lo que sugiere una relación entre la regulación deficiente de expresión /ephrin Ef en el cáncer y la sobreexpresión de Hur.
las regiones 3 'no traducida de las transcripciones de los receptores Eph del ratón y los ligandos ephrin
Una característica distintiva de los miembros de las familias /ephrin Ef es su expansión de los números durante el curso de la evolución, debido a la duplicación múltiple eventos [19]. Las respectivas regiones codificantes y límites exón /intrón están muy conservadas entre los ortólogos y parálogos, que se refleja por las funciones redundantes que Eph /efrinas pueden cumplir y por la capacidad de los receptores Eph para interactuar con múltiples efrinas. Por otra parte, los 3'UTRs de Eph orthologues /ephrin están muy conservadas entre humanos y de ratón (hasta 80%), que indica una fuerte presión de selección y quizás conservación de distintos perfiles de expresión. En contraste, los 3'UTRs de paralogues /ephrin Ef muestran un alto grado de divergencia estructural, que puede haber permitido Ephs /efrinas para adquirir diversos perfiles de expresión (celulares o subcelulares), como ha sido sugerido por otros paralogues conservadas [26].