Extracto
Aproximadamente el 40% de los cánceres rectales Harbor activación de las mutaciones K-RAS, y estas mutaciones se asocian con una mala respuesta clínica a la quimioterapia. El objetivo fue identificar inhibidores de moléculas pequeñas (PYMI) que actúan en sinergia con la radiación ionizante (IR) ( "sensibilizadores") que podrían incorporarse en las estrategias actuales de tratamiento para cánceres de recto localmente avanzado (CHA) que expresan mutantes K-RAS. En primer lugar, optimizado un ensayo de alto rendimiento para la medición de los efectos individuales y combinados de PMI y de IR que produce resultados similares a los del ensayo de formación de colonias estándar de oro. El uso de esta plataforma de cribado y las líneas celulares de cáncer de recto mutantes K-RAS, hemos probado PYMI focalización diversas vías de señalización para la radiosensibilización actividad y luego evaluado nuestros grandes éxitos en experimentos de seguimiento. Los dos radiosensibilizadores más potentes fueron el AZD7762 inhibidor de Chk1 /2 y el inhibidor de PI3K /mTOR BEZ235. El agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que se utiliza para el tratamiento de LARC, sinérgica con AZD7762 y mejorado radiosensibilización por AZD7762. Este estudio es el primero en comparar diferentes PYMI en combinación con IR para el tratamiento del cáncer de recto mutante K-RAS, y nuestros hallazgos sugieren que los inhibidores de Chk1 /2 deben ser evaluados en ensayos clínicos nuevos para LARC.
Visto : Kleiman LB, Krebs AM, Kim SY, Hong TS, Haigis KM (2013) Análisis comparativo de radiosensibilizadores para los cánceres de K-RAS mutante rectales. PLoS ONE 8 (12): e82982. doi: 10.1371 /journal.pone.0082982
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Julio, 2013; Aceptado: 29 de octubre de 2013; Publicado: December 12, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kleiman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Americana del cáncer (MGO-114877 a KMH y PF-11-260-01 de LBK) y con una donación proyecto piloto del programa haz de protones porción Federal. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se estima que 1,2 millones de personas en todo el mundo son diagnosticadas con cáncer colorrectal (CCR) cada año, y alrededor de 600.000 personas mueren de la enfermedad [1]. Se necesitan con urgencia las opciones de tratamiento más eficaces. CRC bajo grado pueden ser curados con cirugía sola, mientras que los cánceres en etapas posteriores se tratan adicionalmente con una combinación de quimioterapia, IR, y las terapias dirigidas, dependiendo de la localización anatómica y la estadificación del tumor. Las terapias dirigidas (PMI y los anticuerpos monoclonales (mAb)) afectan a las vías activadas de manera aberrante en las células cancerosas de señalización y están haciendo lentamente su camino en la clínica para el tratamiento de varios tipos de cáncer, ya sea como monoterapia o bien para mejorar las respuestas a nivel de tratamientos de cuidado. Tres de estos fármacos (todos los mAbs) están aprobados para el tratamiento de CCR metastásico: cetuximab y panitumumab, que inhiben el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina quinasas) y mostrar los beneficios sólo para K-RAS de tipo salvaje tipos de cáncer, y bevacizumab, que inhibe el factor endotelial vascular de la angiogénesis promoviendo el crecimiento (VEGF) [2]. Estos anticuerpos monoclonales hasta la fecha no han demostrado un beneficio para la enfermedad localmente avanzada [3,4], y no hay terapias dirigidas están aprobados para CCR no metastásico.
Debido a su localización anatómica, resecciones quirúrgicas son más desafiante para el cáncer rectal en comparación con el cáncer de colon, y por lo tanto hay un mayor riesgo de recidiva local [5,6]. radioterapia preoperatoria disminuye la tasa de recidiva local y se utiliza en combinación con quimioterapia para tratar LARC [7,8]. Sin embargo, sólo el 10% de estos pacientes logran una respuesta patológica completa (PCR) y un tercio mueren dentro de los 5 años [9,10]. Estrategias para mejorar la respuesta objetivo para aumentar el efecto citotóxico de IR a las células tumorales sin afectar el tejido normal de manera similar, con el fin de minimizar los efectos secundarios de tratamiento. Identificación de drogas chemoradiosensitizing es particularmente pertinente para el ~ 40% de los pacientes con cáncer rectal que albergan mutaciones K-RAS [8]. Mutant K-RAS ha sido ampliamente vinculado a radioresistance en líneas celulares de cáncer humano [11-17]. Además, la respuesta de los pacientes a LARC quimiorradioterapia es muy variable, con algunos pacientes que muestran pCR y otros una respuesta mínima. mutaciones K-RAS son más comunes en pacientes con linfoma no-PCR [18], que se asocia con una menor supervivencia libre de enfermedad [10].
K-RAS es una pequeña GTPasa que funciona aguas abajo de los receptores de la superficie celular , tales como EGFR, y alterna entre una, estado inactiva unida a GDP y un activo, el estado [19] GTP. Unida a GTP K-RAS activa varias cascadas de señalización, incluyendo la canónica Raf-MEK-ERK (MAPK) y las vías PI3K-Akt-mTOR, para regular procesos celulares como la proliferación y la supervivencia. Las mutaciones en K-RAS se encuentran con mayor frecuencia en los codones 12 y 13 y la hidrólisis de GTP compromiso estimuladas por las proteínas activadoras de GTPasa (GAP), resultando en hiperactivos K-RAS y la proliferación incontrolada [19].
IR produce diferentes las lesiones del ADN, con los más prominentes siendo ADN doble filamento se rompe (DSBs), y con frecuencia arresta células en el G1-S o la transición G2-M del ciclo celular para permitir la reparación del ADN [20]. Si hay lesiones sustanciales o irreparables, las células pueden morir por apoptosis o necrosis o se someten a la senescencia celular [21]. La radioterapia se puede mejorar mediante la modulación de la reparación del ADN, los puntos de control del ciclo celular, o de las vías de transducción de señales tales como las MAPK o PI3K vías [22,23]. Sin embargo, la estrategia óptima para la incorporación de terapias dirigidas a los regímenes de tratamiento no está claro. En este estudio, hemos optimizado radiosensibilización una pantalla de alto rendimiento para líneas celulares de cáncer de recto e identificamos radiosensibilizador medicamentos para K-RAS mutante cánceres de recto.
Materiales y Métodos
soluciones
Cultivo de células y de drogas
células de cáncer de colon DLD-1 y HCT116 se obtuvieron del laboratorio Vogelstein (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD). líneas celulares de cáncer de recto y páncreas se obtuvieron del Centro de Molecular Therapeutics (Massachusetts General Hospital, Boston, MA). células DLD-1 y HCT116 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS. líneas celulares de cáncer de recto y de páncreas se cultivaron en DMEM /F-12 suplementado con 5% de FBS. Véase la Tabla S1 para obtener información línea celular y en la Tabla S2 para la información de la droga.
Los tratamientos con fármacos y radiación
El día después de la siembra de células, el medio se reemplazó por medio que contiene vehículo o drogas, e IR se aplicado 2 horas más tarde con una JL Shepherd Mark I Modelo 25 irradiador con una fuente de Cs-137. Sham irradiadas (0 Gy) controles fueron tratados exactamente igual que las muestras irradiadas, excepto que no se aplicó radiación. No hay pozos de borde de placas de 96 pocillos se utilizaron para el análisis. medios que contienen drogas fue reemplazada cada dos días, pero los resultados fueron similares cuando sensibilización radiológica de drogas no fue reemplazado.
Colonia ensayo de formación de
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos de tal manera que cada pocillo contenía por lo menos 20 colonias que tocaban mínimamente después de 2-3 semanas. Las células se fijaron y se tiñeron durante 30 minutos con una mezcla de 6% de glutaraldehído y 0,5% de cristal violeta en agua destilada. Las placas se escanean y colonias con al menos 50 células se contaron usando ImageJ. La fracción superviviente (SF) después de los tratamientos de IR de drogas y se define como: (chapado eficiencia x número de colonias formadas) /(número de células sembradas), donde se define la eficiencia de recubrimiento para una línea celular dada para el correspondiente tratamiento de control como: (número de colonias) /(número de células sembradas).
CyQUANT
The Cell CyQUANT directa Ensayo de proliferación (Life Technologies, Molecular Probes) se realizó en placas de 96 pocillos de acuerdo con el las instrucciones del fabricante, excepto que el ácido nucleico de la mancha CyQUANT directa se utilizó a una concentración final de 1: 1000 y la CyQUANT Supresor Antecedentes Direct I a 1: 200, y el período de incubación fue de 30 minutos. La fluorescencia se midió con un lector de placas de fluorescencia SpectraMax M5 (Ex /Em = 485 /538nm). señal de fondo de los pozos con los medios de comunicación, pero no las células se sustrajo a cabo.
Hoechst tinción y análisis
Las células en placas de 96 pocillos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con Hoechst ácido nucleico tiñen 33342 (Molecular Probes) diluido 1: 40.000 en PBS durante 30 minutos. Para cada pocillo, las imágenes fueron obtenidas con un microscopio Zeiss Axio Observador Z1 en cuatro lugares 100μm separadas y posteriormente analizados con el software de análisis de imagen de la célula CellProfiler2 (www.cellprofiler.org). Los núcleos conteo promedio de las cuatro imágenes de cada pocillo se utilizó para su posterior análisis.
Recuento celular
se desprendieron células se sembraron en placas de 6 ó 12 pocillos y al final del experimento utilizando tripsina /EDTA y se recogió en medio de crecimiento. La suspensión de células se diluyó 1: 1 en 0,2% de azul de tripano y la concentración celular y la viabilidad se evaluó usando un contador de células Nexcelom Cellometer Auto T4. Se utilizó el número de células vivas para el análisis adicional.
CellTiter-Glo
El CellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilidad de ensayo (Promega) se realizó en placas de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante , excepto que un cuarto de la cantidad recomendada de CellTiter-Glo reactivo se utilizó por pocillo. señal de fondo de los pozos con los medios de comunicación, pero no las células se sustrajo a cabo.
Cálculo de sobrevivir fracciones
FE se describen como la fracción de células que quedan después del tratamiento. Los promedios de tres experimentos se representaron gráficamente y las barras de error representan las desviaciones estándar. Los datos se normalizaron para vehículo más sham IR. Para parcelas de datos después del tratamiento IR, para dar cuenta de los efectos de los fármacos por separado, además de drogas IR, además, fue normalizado a fármacos más simulada del IR para cada concentración de fármaco (representado por una línea discontinua en el valor 1). Un SF de fármaco más IR menor que el SF de vehículo más IR sugiere sinergia. t de Student pruebas se utilizaron para evaluar si los FE medias para los tratamientos y los controles fueron significativamente diferentes. los valores de p ≤ 0,05 para el fármaco más el tratamiento con IR en comparación con el control del vehículo más el IR se indican con asteriscos en las figuras.
Western Blot
Western Blot se realizó con tampón de lisis RIPA y métodos estándar. Para las mediciones de PARP escindida, se recogieron las células flotantes cada vez que se cambió el medio y al final del experimento, y después de la lisis combinan con lisado de las células adherentes. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo Odyssey durante la noche a 4 ° C, se lavaron en PBS que contiene 0,1% de Tween-20, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios diluidos 1: 10.000 en tampón de bloqueo Odyssey. Las membranas fueron escaneados utilizando un generador de imágenes de infrarrojos LI-COR Odyssey Odyssey y el software 2.1 se utilizó para la cuantificación. Véase la Tabla S3 para obtener una lista de los anticuerpos utilizados.
perfiles del ciclo celular
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y después del tratamiento se lavaron en PBS, se trataron con tripsina, y se recogen en los medios de comunicación. Todos los pasos posteriores se realizaron en hielo o en un conjunto de centrífuga a 4 ° C. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se lavaron en PBS, y luego se resuspendieron en Mg2 + - y Ca2 + libre de PBS. 95% de EtOH se añadió gota a gota mientras vórtex a velocidad baja, y se almacenaron las células a -20 ° C hasta su uso. Las células se centrifugaron después durante 5 minutos a 2000 rpm, se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en 1 mg /ml ARNasa, y después se transfirieron a tubos de FACS. Se añadió yoduro de propidio (PI) diluido en PBS a una concentración final de PI de 1μg /ml. Las células se mantuvieron en la oscuridad hasta que se analizaron en un LSR II quad-láser del citómetro ejecuta el software FACSDiva (BD Immunocytometry). FlowJo versión 7.6 se utilizó para analizar los datos con el Decano-Jett-Fox (DEF) modelo matemático.
Resultados
Optimización del ensayo de alto rendimiento (HTA)
Los efectos de la radiación en líneas de células cultivadas se evalúan normalmente a través de un ensayo de formación de colonias (CFA). Este enfoque no es susceptible de análisis de alto rendimiento, sin embargo, debido a que es mucho tiempo, costoso, y requiere la optimización significativa para cada línea y el tratamiento de células. Por lo tanto, nuestro objetivo inicial fue optimizar un ETS para la medición de las respuestas a las drogas y el IR. En primer lugar, hemos generado un conjunto de datos de referencia con el CFA, donde se sembraron las células en placas de 6 pocillos, una gama de dosis de IR se aplica en el día siguiente, y el número de colonias se evaluó después de 2 semanas. A continuación, las células se sembraron en placas de 96 pocillos, IR se aplicó en el día siguiente, y el número de células viables se evaluó por el ensayo CyQUANT después de 3 a 8 días (Figura S1). El punto de tiempo 1 semana para placas de 96 pocillos produjo resultados similares a los del CFA.
Hemos encontrado que el tratamiento de algunas líneas celulares de cáncer de recto con IR y /o PMI causó núcleos y agrandamiento de las células y se aplanan. En estos casos, CyQUANT y otros ensayos de proliferación común que se basan en el contenido de ADN (por ejemplo Syto-60) produjeron una lectura inexacta del número de células que no estaba de acuerdo claramente con lo que hemos observado mediante inspección visual. Este efecto fue especialmente notable en el tratado IR-RCM-1 células (Figura S2A), pero no para las células SW837. Decidimos para teñir los núcleos en las placas de 96 pocillos con Hoechst, la imagen de las placas y, a continuación estimar el número de células en cada pocillo mediante la segmentación de los núcleos con el software CellProfiler. Este ensayo produjo resultados cualitativamente similares a las células contando 1 semana post-IR (bajo rendimiento) y el CFA para ambas líneas celulares (Figura S2B). El protocolo ( "ETS") que se utiliza para la pantalla radiosensibilización se muestra en la Figura S3.
Radiosensibilización pantalla
Los medicamentos seleccionados para la pantalla afectan a diversas vías de señalización, tales como los que tienen una función conocida en radiosensibilización, así como aquellos que se cree están hiperactivado en el cáncer, pero sin un papel establecido en respuesta a la radiación. Se incluyeron los fármacos oncológicos en tuberías en las grandes compañías farmacéuticas con datos preclínicos o clínicos prometedores. En algunos casos, se incluyeron múltiples fármacos dirigidos a la misma vía para comparar sus potencias y para abordar el papel de los efectos fuera de la meta. La selección final de los fármacos compuesta 28 PYMI (Tabla 1). Se utilizó concentraciones de fármaco que van desde ~ 10 nM a 1μM, ya que estos son típicamente concentraciones clínicamente alcanzables. IR dosis variaron de 2 Gy a 8 Gy ya que los pacientes a menudo reciben LARC dosis fraccionadas de 1,8 Gy IR, pero a veces reciben dosis más altas.
Drogas
Primaria target
GefitinibEGFRAZD8931pan-ErbBGDC-0941PI3KBKM120pan-PI3KBEZ235PI3K/mTORGDC-0980PI3K/mTORPerifosineAKT/mTORSorafenibRaf/VEGFR/etc.PLX4032Raf (V600E) Raf265Raf /VEGFRCI-1040MEKAZD6244MEKGSK1120212MEKPD325901MEKSP600125JNK IILY2228820p38DovitinibFGFR/PDGFRAbt888PARPAT-406IAPsAZD1480JAK1/2PD0332991CDK4/6AZD7762Chk1/2KU-55933ATMVorinostatHDACAUY922Hsp90AZD1152Aurora kinaseSunitinibmultiple targetsMidostaurinmultiple targetsTable 1. Medicamentos evaluados como agentes individuales y en combinación con la radiación en la pantalla.
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Las líneas celulares de cáncer de recto mutante K-RAS SW837 y MCR-1 se utiliza para la pantalla, y los resultados se muestra en la Figura S4. La PMI tiene una amplia gama de potencias, con inhibidores de MEK siendo generalmente el más fuerte en su propia (Figura S5A). Se han utilizado dos medidas para caracterizar cuantitativamente radiosensibilización. En primer lugar, se calculó el grado de radiosensibilización mediante la comparación de las diferencias en la FE resultantes del tratamiento de SMI con y sin IR (por ejemplo, la figura S5B). En segundo lugar, se utilizó la independencia de Bliss (BI) para determinar si los efectos son antagónicos, aditivo o sinérgico. BI asume que las actividades de la SMI y IR son mutuamente excluyentes. El esperado efecto combinado (F
Cexp) es el producto fraccional de los efectos de los tratamientos individuales. La diferencia entre F
Cexp y el efecto combinado observado (F
mazorcas) determina si los dos tratamientos son antagónicos (F
Cexp & lt; F
mazorcas), aditivos (F
Cexp = F
mazorcas), o sinérgico (F
Cexp & gt; F
mazorcas). No se detectó ningún antagonismo (BI valor negativo) entre cualquier SMI e IR. valores de BI para los seis radiosensibilizadores más fuertes se ilustran en la Figura 1. Sólo la PI3K /mTOR inhibidor BEZ235 y el puesto de control quinasas 1 y 2 (Chk1 /2) inhibidor de AZD7762 sinérgica con 2 Gy IR en ambas líneas celulares.
Los valores corresponden a BI (F
Cexp - F
mazorcas) x 100 y se calcularon en base a los datos en bruto de la pantalla se representa en la figura S4. Las concentraciones de fármaco variaron de 10 nM a 1.25μM. Radiosensibilización no se consideró si la fracción superviviente (SF) después del tratamiento fármaco solo fue de menos de 0.125, ya que un efecto sinérgico de la combinación con IR puede no ser detectable. Aunque CI-1040, Raf265, y GDC-0980 fueron ligeramente radiosensitivas, que no se incluyeron en los estudios de seguimiento, ya que otros inhibidores de las mismas vías (AZD6244 y BEZ235) exhibió más potente sinergia.
para los cinco inhibidores utilizados que se dirigen a la vía PI3K /Akt /mTOR, SW837 células eran más sensibles a fármaco solo, mientras que las células RCM-1 fueron más fuertemente radiosensitized. Todos estos medicamentos radiosensitized al menos ligeramente células RCM-1 a 8 Gy IR, pero sólo BEZ235 fue fuertemente radiosensibilizadores a 2 Gy IR. Por otro lado, los cuatro inhibidores de MEK de orientación eran más potentes en su propia en células MCR-1 y mostraron una tendencia hacia una ligera radiosensibilización de células SW837 RCM-1 pero no.
BEZ235 y AZD7762 radiosensibilizar
Radiosensibilización fue confirmada por BEZ235 y AZD7762 por el CFA (Figura S6). Estos PMI radiosensitized en un rango de dosis de IR tan bajas como 0.5 o 1 Gy (Figura S7). Desde 1,8 Gy IR general se administra durante cinco días consecutivos para varias semanas durante el curso del tratamiento para LARC, nos preguntamos si el PMI siguen radiosensitivas con dosis fraccionadas de IR. En primer lugar, evaluamos los efectos de la aplicación de 2 Gy IR en cuatro días consecutivos, pero esto fuimos demasiado pocas células restantes para el análisis radiosensibilización (Figura S8A-B). Sin embargo, nuestros resultados sugieren que los fármacos que se radiosensibilizador con una aplicación de IR también se radiosensibilizadores utilizando este protocolo (datos no mostrados). Para poder evaluar los efectos de días consecutivos de IR, se aplicó 0,5 o 1 Gy en cuatro días consecutivos. Detectamos radiosensibilización similares por BEZ235 y AZD7762 como cuando se aplicó una vez IR (Figura S8C-D).
La mayoría de los cánceres pancreáticos albergan mutaciones K-RAS [19], y estos tumores a menudo son tratados con radioterapia. Para investigar el alcance de nuestros hallazgos, se realizaron estudios de seguimiento con las únicas dos otras líneas establecidas de células de cáncer de recto (SW1463 y el coche-1) y con líneas celulares de cáncer de páncreas. Todas estas líneas albergan mutaciones K-RAS, excepto para las células de CaR-1. BEZ235 radiosensitized firmemente a todas las líneas celulares de cáncer rectal, pero sólo débilmente radiosensitized una línea celular de cáncer de páncreas (PANC-1) a 2 Gy IR (Figura 2A). AZD7762 radiosensitized todas las líneas celulares de cáncer rectal, pero sólo las células de cáncer de páncreas MiaPaca-2 a 2 Gy IR (Figura 2B). AZD7762 se ha evaluado principalmente para el cáncer de páncreas en combinación con gemcitabina y MiaPaca-2 células son los más utilizados en estos estudios pre-clínicos [24,25]. Radiosensibilización también se detectó en las células PATU8988T a 5 Gy IR (Figura 3), una dosis que está siendo evaluado en ensayos clínicos. Sin embargo, las líneas celulares de cáncer de páncreas mostraron una respuesta más variable a AZD7762 en presencia de IR en comparación con líneas celulares de cáncer de recto, y nuestros datos sugieren que BEZ235 y AZD7762 puede más universalmente radiosensibilizar cánceres rectales.
Efectos de BEZ235 ( A) o 250 nM AZD7762 (B) 1 semana post-IR. Se utilizaron diferentes concentraciones de BEZ235 dependiendo de la sensibilidad de cada línea celular para el tratamiento BEZ235 en ausencia de IR (las líneas de páncreas eran más sensibles a BEZ235): 250 nM para el SW837, RCM-1, y las células SW1463, 50 nM para el coche-1 y Capan-1 células, 25 nM para las células PANC-1, y 1 nM para las células PATU8902 y PATU8988T. El HTA se utilizó para las líneas celulares de cáncer rectal y células Capan-1, y se utilizó el recuento de células para las líneas restantes.
Izquierda
, los datos se normalizaron al vehículo más tratamiento simulado (IR efectos de la PMI en la ausencia de IR).
Derecho
, los datos se normalizaron a los correspondientes controles no irradiados. los valores de p ≤ 0,05 para IR más el tratamiento SMI en comparación con el control de infrarrojos más vehículo se indican con asteriscos.
Se realizó el ensayo CellTiter-Glo 1 semana post-IR.
Izquierda
, los datos se normalizaron al vehículo más tratamiento simulado (IR efectos de la PMI en la ausencia de IR).
derecha, los datos se normalizaron a los correspondientes controles no irradiados; barras sólidas representan los efectos de la IR por sí solos. los valores de p ≤ 0,05 para IR más el tratamiento SMI en comparación con el control de infrarrojos más vehículo se indican con asteriscos.
5-FU sinergia con AZD7762 y mejora la radiosensibilización
Un SMI incorpora en una ensayo clínico para los pacientes LARC sería administrado concomitantemente con IR y quimioterapia basada en 5-FU [3]. Antimetabolitos tales como 5-FU y gemcitabina inhiben la replicación del ADN y dan como resultado una detención de la fase S. tratamiento AZD7762 fue sinérgica con 5-FU en las líneas celulares de cáncer de recto en ausencia de IR (Figura 4A (ver los datos de 250 nM AZD7762) y S9), pero no se detectó ninguna sinergia para BEZ235 y 5-FU (Figura S10). Además, 5-FU mejorada radiosensibilización por AZD7762, pero no por BEZ235 (Figura 4B (ver los datos de 50 nM AZD7762) y S10). Por lo tanto, nos centramos en AZD7762 como el chemoradiosensitizer más prometedor.
Resultados de la HTA para SW837 células se muestran. Ver Figura S10 para los datos sobre las células RCM-1 y el tratamiento BEZ235. (A) Los datos están normalizados al vehículo más simulada del IR. (B) Se normalizaron los datos correspondientes a los controles no irradiados. los valores de p ≤ 0,05 para IR más el tratamiento SMI en comparación con el control de infrarrojos más vehículo se indican con asteriscos.
El tratamiento de combinación de AZD7762 e IR promueve el daño del ADN y la apoptosis
IR inducida DSBs son detectados por la proteína serina /treonina quinasas ataxia telangiectasia mutada (ATM) y quinasa relacionada con 3 ATM y Rad (ATR), que fosforilan muchos sustratos intracelulares, incluyendo Chk1 /2, H2AX y p53 [26]. Chk1 y Chk2 son serina /treonina quinasas que desempeñan papeles esenciales en la respuesta a las DSB por el mantenimiento de la S- y los puestos de control de la fase G2 y la regulación de la recombinación homóloga reparación [26,27]. ATR fosforila Chk1 en S317 y S345, que catalíticamente activa Chk1 y conduce a la autofosforilación en S296, y ATM fosforila Chk2 en T68, que conduce a Chk2 homodimerización y autofosforilación en T383, T387 y S516 [28,29]. inhibidores de Chk1 quinasa aumentan la fosforilación de Chk1 S345 debido a la activación de ATR y la disminución de la desfosforilación por PP2A [30,31]. Del mismo modo, los inhibidores de la quinasa Chk2 aumentan la fosforilación de Chk2 T68, que es dependiente de ATM y regulada por múltiples proteínas fosfatasas [32].
Nuestros resultados en las líneas celulares de cáncer de recto son consistentes con los efectos bien establecidos de Chk1 /2 y los inhibidores de AZD7762. Chk1 y la actividad Chk2 (Chk1 pS296 y pS516 Chk2) fueron inhibidos por AZD7762 en presencia y ausencia de IR (Figuras S11a y S12A), lo que indica que el fármaco bloquea eficazmente sus objetivos. La fosforilación de Chk1 y Chk2 en ATM sitios mediadas por ATR /(Chk1 pS345 y Chk2 pT68) aumentó después del tratamiento AZD7762 (Figuras S11b y S12B). La fosforilación de Chk1 en S345 es conocido por promover Chk1 degradación proteolítica [33], y encontramos que AZD7762 disminución de los niveles de Chk1 (Figura S11C).
Las células cancerosas a menudo pierden su puesto de control G1, por ejemplo, mediante mutación del tumor supresor p53, y son más dependientes del punto de control G2 y Chk1 /2 la actividad [22]. Chk1 /2 agotamiento o la inhibición, particularmente en las células deficientes en p53, anula el punto de control G2 inducida por agentes genotóxicos e impide la reparación del ADN, que finalmente llevan a la catástrofe mitótica y apoptosis o senescencia [20,28]. La falta de la reparación del ADN se detecta habitualmente por la fosforilación prolongada de la variante de la histona H2AX en S139, que se fosforila rápidamente por ATM, ATR o ADN-PK en respuesta a DSBs [34]. De hecho, encontramos que el tratamiento con AZD7762 abrogó la detención en G2 inducida por IR (Figura S13) y condujo a un aumento de la fosforilación de H2AX (γH2AX) y la apoptosis en las líneas celulares de cáncer de recto (Figuras 5 y S14).
Western Blot se muestran los resultados para las células RCM-1. Ver Figura S14 para la cuantificación y los datos sobre las células SW837 y SW1463. El número de días post-IR se indica. (A) ADN DSBs como se indica por los niveles de γH2AX. (B) La apoptosis como lo indican los niveles de PARP escindida.
AZD7762 es un radiosensibilizador más potente que otros inhibidores de la ATM /2-Chk1
Hemos encontrado que otros fármacos que se dirigen ATM-Chk1 /2 no son tan buenos como AZD7762 en radiosensibilizador líneas celulares de cáncer de recto. AZD7762 radiosensitized en alrededor de un 40 veces la concentración más baja que la ATM inhibidor KU-55933 (Figura 6). Varios inhibidores de Chk1 y Chk2 están en desarrollo preclínico y los primeros ensayos clínicos [26]. Se comparó AZD7762 a otros dos que están disponibles comercialmente (SCH900776 y LY2603618) [35]. AZD7762 es igualmente potente contra Chk1 y Chk2 in vitro (IC
50 = 5 nM y & lt; 10 nM, respectivamente), mientras que SCH900776 es selectivo para Chk1 (IC
50 = 3 nM) sobre Chk2 (IC
50 = 1.5μM), y LY2603618 se reporta como un inhibidor de Chk1 selectiva, pero no hay datos publicados [20]. AZD7762 radiosensitized y la actividad Chk1 inhibido en un 10 veces la concentración más baja que SCH900776 y LY2603618 (Figura 7), a pesar de que al menos AZD7762 y SCH900776 tienen afinidades de unión similares in vitro para Chk1.
El ensayo CellTiter-Glo se realizó con células SW837 1 semana post-IR. Se normalizaron los datos a los correspondientes controles no irradiados. los valores de p ≤ 0,05 para IR más el tratamiento SMI en comparación con el control de infrarrojos más vehículo se indican con asteriscos.
(A) El ensayo CyQUANT se realizó con células SW837 1 semana post-IR. SCH900776 y LY2603618 son inhibidores de Chk1. Se normalizaron los datos a los correspondientes controles no irradiados. los valores de p ≤ 0,05 para IR más el tratamiento SMI en comparación con el control de infrarrojos más vehículo se indican con asteriscos. (B) células SW837 se trataron con vehículo o SMI dos horas antes de IR, y los lisados de proteínas se recogieron tres horas post-IR. Chk1 y sitios de autofosforilación Chk2 se midieron mediante transferencia Western.
Discusión
El objetivo de este estudio fue identificar nuevas opciones de tratamiento para los pacientes LARC con mutaciones K-RAS mediante la optimización de un alto -throughput ensayo de cribado y un panel de PMI focalización diversas vías de señalización para la radiosensibilización. Nuestra suposición subyacente de este trabajo fue que un SMI con un efecto sinérgico en las células cancerosas cuando se combina con terapia de radiación es más deseable que uno que tiene un efecto altamente citotóxico por sí mismo. Se identificaron seis PYMI que radiosensibilizar células de cáncer de recto mutantes K-RAS: BEZ235 (PI3K /inhibidor de mTOR), AZD7762 (Chk1 /2 inhibidor), AZD8931 (pan-ErbB inhibidor del receptor), AT-406 (inhibidor de la proteína de la apoptosis (IAP) inhibidor de la familia), AZD6244 (inhibidor de MEK), y Abt888 (inhibidor de PARP). Aunque se han mostrado otros inhibidores de los receptores ErbB y proteínas anti-apoptóticas de ser radiosensibilizador [23], AZD8931 y AT-406 no han sido previamente informado de que radiosensibilizadores. BEZ235 y AZD7762 eran los más potentes sensibilizadores y nos hemos centrado en estos dos fármacos.
BEZ235 se ha demostrado que radiosensibilizar tumores de diversos tejidos, incluyendo glioblastomas, los fibrosarcomas y líneas celulares NCSLC que albergan mutaciones K-RAS [36- 38]. BEZ235 también normaliza la vasculatura del tumor en experimentos de xenoinjertos, que permitirá mejorar la perfusión del tumor, oxigenación, y las respuestas a la radioterapia [36]. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar el efecto radiosensibilizador visto con BEZ235, incluso dentro de la misma línea celular (células H460): abrogación del G IR inducida
2 detención y la apoptosis [37], y el aumento de G
2 arresto y la senescencia [39]. Común a todos los documentos que describen un efecto radiosensibilizador de BEZ235 se retrasa la reparación del daño en el ADN. Aquí, se muestra por primera vez que BEZ235 actúa como un potente radiosensibilizador de líneas celulares de cáncer rectal y de páncreas. Las células con PIK3CA la activación de mutaciones o pérdida del gen supresor de tumores PTEN son más sensibles a BEZ235 de células que carecen de estas mutaciones [40], y la alta sensibilidad de PATU8902 y células PATU8988T a BEZ235 puede explicarse por su deficiencia PTEN (Tabla S1). La inhibición de PI3K y mTOR por BEZ235 parece ser un enfoque terapéutico prometedor, especialmente en combinación con IR para el cáncer rectal. No se han realizado ensayos clínicos con BEZ235 de CCR o en combinación con IR (www.clinicaltrials.gov).
AZD7762 se ha demostrado que radiosensibilizar varias líneas celulares de cáncer in vitro y en modelos de xenoinjerto, mediante la anulación del punto de control G2 y la inhibición de la reparación del ADN. AZD7762 principalmente se ha evaluado para el cáncer de páncreas, pero también se ha demostrado que radiosensibilizar de próstata, de pulmón, de mama y células de cáncer de colon [24,25,41-43]. fibroblastos humanos normales y pequeñas células epiteliales del intestino no se radiosensitized por AZD7762 [25,42]
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No hay estudios previos han comparado radiosensibilización por AZD7762 y otros inhibidores, y nos pareció que es un mejor radiosensibilizador de células de cáncer de recto de inhibidores de otras proteínas implicadas en la respuesta a agentes genotóxicos, así como otros inhibidores de la vía 2 /ATM-Chk1. AZD7762 tiene marcadamente diferentes efectos en comparación con el puesto de control de inhibidores de la quinasa SCH900776 y LY2603618 en que es el único que disminuye la viabilidad de su propio en 1μM (a través de DSBs y apoptosis; datos no mostrados) y es el radiosensibilizador más fuerte. La explicación más simple de estas diferencias es que AZD7762 inhibe Chk2 mientras que los otros dos medicamentos no lo hacen, y que Chk2 juega un papel importante en la radiosensibilización de células de cáncer rectal. Sin embargo, muchos estudios (basados principalmente en siRNA desmontables) han sugerido que la quimioterapia y la radiosensibilización están mediadas por Chk1 y en un grado mucho menor Chk2, y que los efectos de AZD7762 se deben a su inhibición de Chk1 [20,24,44- 46]. No está claro si los inhibidores-Chk2 específica poseen la quimio y la actividad significativa radiosensitivas [47-49]. Además, se muestra que AZD7762 es un inhibidor más fuerte de Chk1 de SCH900776 y LY2603618. Por lo tanto, la radiosensibilización más fuerte por AZD7762 es probablemente debido a sus efectos mejorados sobre Chk1, y, en menor medida, su inhibición de Chk2.
Hemos encontrado que AZD7762 sinergizada con 5-FU y que 5-FU mejorado radiosensibilización por AZD7762.