Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres malignos que conducen con un rápido aumento en la incidencia y la mortalidad. Las recurrencias de CRC después de la resección curativa a veces son inevitables y, a menudo se llevan a cabo dentro del primer año después de la cirugía. Los microARN pueden servir como biomarcadores para predecir la recurrencia temprana del CRC, pero la identificación de ellos de más de 1.400 microARN humanos conocidos es difícil y costoso. Un enfoque alternativo es el de analizar los datos de expresión existentes de ARN mensajero (ARNm), porque en general los niveles de expresión de microRNAs y sus ARNm diana se correlacionan inversamente. En este estudio, se extrajeron seis expresión mRNA de datos de CRC en cuatro estudios (GSE12032, GSE17538, GSE4526 y GSE17181) desde el ómnibus de la expresión génica (GEO). Inferimos perfiles de expresión de microARN y se realizó un análisis computacional para identificar microRNAs asociados con la recurrencia CRC utilizando el método IMRE basado en la base de datos microcosmos que incluye 568,071 conexiones microARN por objetivos entre 711 microRNAs y 20.884 genes blancos. Dos microARN, miR-29a y miR-29c, se dieron a conocer y más meta-análisis de los seis mRNA expresión de datos mostraron que estas dos microARN fueron altamente significativas en base a la combinación de p-valor de Fisher (p = 9,14 × 10
- 9 de miR-29a y p = 1,14 × 10
-6 de miR-29c). Por otra parte, estos dos microARN fueron probados experimentalmente en 78 muestras de CRC humanos para validar su efecto sobre la recurrencia temprana. Nuestros resultados empíricos muestran que los dos microARN fueron significativamente las reguladas (p = 0,007 para el miR-29a y p = 0,007 para el miR-29c) en los pacientes con recurrencia temprana. Este estudio muestra la viabilidad de utilizar los perfiles de ARNm para indicar microRNAs. También demuestra el miR-29a /c podría ser biomarcadores potenciales para el CDN recurrencia temprana
Visto:. Kuo TY, Hsi E, Yang IP, Tsai PC, Wang JY, Juo S-HH (2012) Análisis Computacional de Perfiles de expresión de ARNm Identifica microARN-29a /c como predictor de recurrencia del cáncer colorrectal temprano. PLoS ONE 7 (2): e31587. doi: 10.1371 /journal.pone.0031587
Editor: Steve Horvath, Universidad de California, Los Angeles, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2011; Aceptado: 9 Enero 2012; Publicado: 13 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Kuo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del hospital de la Universidad médica de Kaohsiung (KMUH98-8I04) (http://www.kmuh.org.tw/), Excelencia para Centro de Investigación del cáncer de subvención mediante la financiación del Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, Taiwán, República de China (DOH100-TD-C-111-002) (http://science.doh.gov.tw/), y el Consejo Nacional de Ciencia de la República de China (NSC 99-2320-B-037-014- MY3 y NSC 94-2314B037-104) (http://www.nsc.gov.tw/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres malignos líder con más de 500.000 muertes cada año en todo el mundo [1], [2]. La incidencia y la mortalidad del CCR en China han aumentado rápidamente en los últimos decenios [3]. Actualmente, el tratamiento eficaz para la CRC es la resección curativa del tumor con quimioterapia, pero las recurrencias son a veces inevitable [4]. Entre los pacientes con recidiva, 40% -50% de ellos se producen en el primer año después de la resección quirúrgica inicial, y más del 90% suceda dentro de los cuatro años [5]. El estadio del tumor y las características patológicas son comúnmente utilizados para predecir el pronóstico y facilitar el tratamiento de pacientes con CRC en la práctica. Hasta el momento, no existen marcadores biológicos disponibles para predecir la recurrencia de la CRC.
Recientemente, los microARN han demostrado ser factores importantes para regular muchas funciones de los genes en los cánceres humanos [6], y se han propuesto como nuevo microRNAs biomarcadores para el cáncer [7]. Estudios anteriores han demostrado que la expresión de microARN se altera en diversos tipos de cáncer incluyendo el CRC [8], [9]. Los microARN son endógenos ARNs cortos no codificantes que pueden unirse a las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de sus ARN mensajeros (ARNm diana). Actúan como reguladores post-transcripcional de la expresión de genes [10] a través de la represión de traducción y /o la degradación del ARNm en muchos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular, la proliferación celular, la apoptosis y el metabolismo de [11], [12]. Estos procesos están normalmente implicados en la tumorigénesis [13]. Aunque varios estudios han reportado una asociación entre los microARN y la Convención de desarrollo [14], [15], [16], [17], el papel de los microRNAs en la predicción de la recurrencia CRC apenas ha sido investigado.
Hasta octubre de 2011, se han reportado más de 1.400 microARN humanos [18], [19]. Es difícil, que consume tiempo y costoso para evaluar la consecuencia funcional de cada microRNA en relación con CRC recurrencia. enfoques computacionales se han desarrollado para obtener más información de los datos de expresión de ARNm [20], [21], [22], [23]. En general se cree que los niveles de expresión de la mayoría de los microRNAs y sus mRNA objetivos directos se correlacionan inversamente porque microRNAs ejercen la represión de traducción o mecanismo de degradación [21], [24]. De acuerdo con los perfiles de expresión de microARN se pueden deducir de los datos de expresión de ARNm por los enfoques de la bioinformática. Recientemente, el método IMRE se ha propuesto [22] para predecir la expresión de microARN mediante la utilización de conjuntos de datos y bases de datos de ARNm diana de microARN. En este estudio, se obtuvieron seis conjuntos de datos de expresión de mRNA de los pacientes con CCR desde el ómnibus de la expresión génica (GEO). Se utilizó el análisis computacional y meta-análisis para predecir microRNAs relacionados con CRC recurrencia, especialmente recurrencia temprana. Además hemos utilizado nuestros CRC muestras humanas para validar estos microARN candidatos.
Materiales y Métodos
Estrategia de búsqueda para los conjuntos de datos de ARNm de GEO
En octubre de 2010, se realizaron búsquedas en el GEO ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) para los estudios que proporcionaron datos de expresión de mRNA de los pacientes con CCR. Los términos de búsqueda fueron "cáncer colorrectal" o "CRC" en combinación con "humana [organismo]". En total, se identificaron inicialmente 110 estudios. a continuación, hemos limitado el número de estudios por las palabras clave de "repetición" y "recaída" en sus resúmenes, entre los cuales se extrajeron cuatro estudios (GSE12032, GSE17538, GSE4526 y GSE17181). Se utilizó la recurrencia originalmente se define en estos cuatro estudios. La recurrencia se define comúnmente como una recidiva local o metástasis a distancia del CRC dentro del período de seguimiento, y las longitudes de seguimiento de estos estudios osciló entre 45,9 y 68,6 meses. Los datos GSE17181 y GSE4526 sólo se informaron metástasis a distancia, pero los otros dos conjuntos de datos no especificaron el tipo de recurrencia en sus datos. Hemos descargado su normalizado la expresión del ARNm de datos y la información de la muestra de la GEO. Los estudios GSE17538 y GSE4526 utilizan la misma plataforma de expresión génica (HG-U133Plus 2.0), mientras que los otros dos estudios utilizaron dos diferentes (AceGene Oligo Humano Chip de 30 K y Agilent-014950 CGH microarrays). La información detallada de estos conjuntos de datos descargados se resume en la Tabla 1.
El filtrado de los sujetos de estudio y sondas en los conjuntos de datos
Los datos descargados incluyeron pacientes con CRC diversas fases del tumor: Etapa II en GSE17181 , fase III en GSE4526, y los estadios I-IV en GSE12032 y GSE17538. Sólo se seleccionaron los pacientes con tumor etapa II y III etapa, ya que en conjunto representaron la mayoría de los pacientes con CCR (~ 70%) [25], y aquellos en estadio I y IV proporcionó poca información. Por lo tanto, se han creado un total de seis conjuntos de datos específicos de la etapa (tres etapas II y III etapa de tres conjuntos de datos) para su posterior análisis. Dado que estos conjuntos de datos utilizados plataformas con diferentes sondas para detectar la expresión de ARNm, se realizó el control de calidad de estos conjuntos de datos utilizando los siguientes dos criterios. En primer lugar, se descartó las sondas con el rango intercuartílico (RIC) inferior a la mediana de IQR del total de la sonda-lance, a fin de eliminar las sondas menos expresados diferencialmente. En segundo lugar, si un gen fue interrogado por varias sondas, que tiene el valor más alto RIC se retuvo y se eliminó el resto. Después de que el procedimiento de filtración, más de la mitad de los genes fueron filtradas a cabo en cada uno de estos conjuntos de datos (Tabla 1) guía
Análisis computacional de Imre inferir microRNAs putativos
El método IMRE (http:. //www.lussierlab.org/IMRE) ha sido desarrollado para imputar los niveles de expresión de microARN de expresión mRNA de datos en base a los niveles de expresión ponderados y clasificados y objetivos de microARN putativo [22]. Este método supone una correlación inversa entre la expresión de microRNAs y sus mRNA objetivos directos [26], [27]. Si bien la aplicación del método IMRE para cada dato, hemos identificado un conjunto de microARN ya sea hacia arriba o hacia abajo-regulados regulados. Usando este método, una puntuación que representa el nivel de expresión de microARN se calculó sobre la base de seis descargados de mRNA expresión de datos y las metas de microcosmos que es una base de datos de destino microARN (ver la siguiente sección de "base de datos de predicción de destino" para más detalles). Los procedimientos detallados fueron los siguientes: (1) mRNA en cada sujeto de estudio fue clasificada por su nivel de expresión, y luego obtuvo de acuerdo con su rango utilizando el método OrderedList [28] de Bioconductor [29], y (2) la puntuación de expresión de cada uno de microARN en cada sujeto fue imputado por el cálculo de la diferencia entre la media de puntuaciones de rango ponderado de sus genes diana y genes no objetivo.
Target base de datos de predicción
para predecir objetivos de genes para un determinado microARN, que descargará la última base de datos de predicción de destino de los objetivos microcosmos, anteriormente llamados objetivos miRBase [30], [31] (microcosmos Targets versión 5; http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) y recuperado 568.071 conexiones predijo microRNA por objetivos entre 711 microARN humanos y 20.884 genes blancos. Objetivos microcosmos utiliza el algoritmo de Miranda que es uno de los primer objetivo algoritmos de predicción de genes miARN y uno de los algoritmos más utilizados. El algoritmo se basa en un programa dinámico para buscar máximos alineaciones de complementariedad locales. Para validar la base de datos microcosmos, se compararon los resultados entre los objetivos microcosmos y miRNome que se utilizó en GSE6631 estudio [22]. Además, también utilizamos de Miranda [32] y TargetScan [33] para validar los microARN candidatos sugeridos por la base de datos microcosmos. La base de datos microcosmos produjo la mayoría de los microARN (incluyendo el causal) que se encontraron en el estudio original [22] (Tabla S1). Otra de las ventajas de usar Objetivos microcosmos fue que la última (versión v5 liberación objetivos) contiene la versión más microARN que el miRNome (generado en 2007). De acuerdo con ello, se utilizó la base de datos microcosmos para los estudios posteriores.
Estadística análisis
Después de calcular la puntuación que representa los niveles de expresión de cada uno de microARN para cada sujeto del estudio, encontrarás una lista de posibles microRNAs que, de lo distinto la recurrencia de la no repetición de los pacientes con CCR. Para cada microRNA, se obtuvo un valor de p empírico usando 1000 permutaciones. El valor p de corte para seleccionar microRNAs potenciales se fija para que sea igual a o menor que 0,1. Se utilizó este valor liberal el fin de reducir un error de tipo II en el análisis inicial. El análisis se realizó con el paquete estadístico R con el paquete Bioconductor crepúsculo [34], [35].
Para reducir un error de tipo I, que además combinaron los resultados de los seis conjuntos de datos mediante meta-análisis para el principio microRNAs seleccionados. estadístico Q de Cochran se utilizó para probar la heterogeneidad entre estos conjuntos de datos. El meta-análisis se realizó con base en el tamaño del efecto (la diferencia en las puntuaciones pronosticadas entre el recurrente y pacientes con CRC no recurrentes) y el error estándar. se informó de un tamaño del efecto global y el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Para identificar el microARN más significativa con el valor p más pequeño global y para aumentar aún más el poder, se realizó un análisis conjunto mediante la combinación de los valores de p primas basado en la combinación de Fisher de los valores de p [36] con el valor p de corte de 5 × 10
-5 (~0.05 /711, 711 microRNAs).
Bench experimentos para confirmar los hallazgos
para verificar los microARN candidatos indicados por el método de cálculo de arriba y meta-análisis, recogido más de 78 tejidos tumorales de CRC en el hospital de la Universidad médica de Kaohsiung. Las características clínico de estos 78 pacientes se muestran en la Tabla S2. Estas muestras se obtuvieron quirúrgicamente de los pacientes con CRC UICC etapas I-III y se congelaron en nitrógeno líquido a -80 ° C. Para evitar la influencia potencial del tratamiento neoadyuvante sobre la expresión de microARN, todos los pacientes no fueron sometidos a tratamiento neoadyuvante, quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Médica de Kaohsiung. Estos 78 pacientes se agruparon en la recurrencia temprana (43 casos) y los grupos de recurrencia no tempranos (35 controles). No hay diferencia significativa en la edad y sexo entre los dos grupos. recurrencia temprana se define como la recurrencia (crecimiento tumoral restringido a la anastomosis o de la región de la operación primaria) local o metástasis a distancia (metástasis a distancia o difusa siembra peritoneal) dentro de 1 año después de la resección radical [5], [24], [37] . recurrencia temprana no fue definida como sin recurrencia dentro de 1 año. Cabe destacar que algunos de los pacientes recurrentes no anticipada pueden tener recurrencia como el seguimiento continúa
.
se homogeneizó Aproximadamente 100 mg de tejido utilizando un homogeneizador de sobremesa (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerna, Suiza) en 1 ml de reactivo TRIzol (Invitrogen) y se purificó con columnas Qiagen RNAeasy (Qiagen). Se extrajeron los ARN totales y purificadas de cada tejido tumoral, y TaqMan RT-qPCR microARN (Applied Biosystems) ensayos se utilizaron para cuantificar el nivel de expresión de microARN. PCR en tiempo real se llevó a cabo usando el Applied Biosystems 7500 Secuencia Sistema Detector. Todos en tiempo real las reacciones de PCR se llevaron a cabo por triplicado. U6b se utilizó como control interno debido a que es un control interno que se utiliza comúnmente para la normalización expresión microRNA y también porque se ha demostrado U6b relativamente estable sobre la base de nuestros datos interno. El nivel de expresión relativa de un microARN se calculó utilizando la ecuación, ingrese
10 (2
-ΔCt), donde Ct = (CT
miR-CT
U6b). La media de log
10 (2
-ΔCt) y también se calculó su desviación estándar (SD). Se comparó la diferencia en los niveles de expresión de microARN entre los grupos recurrentes tempranos y no anticipadas por la prueba t independiente y análisis ANCOVA múltiple con ajuste por edad, sexo y estadio del tumor. Nuestros datos experimentales se dividieron en dos grupos según la mediana de cada miR-29a y datos de miR-29c. El método de Kaplan-Meier se utilizó para detectar la relación entre el tiempo de recaída después de la cirugía y miRNAs dicotomizadas expresión. El nivel de significación se fijó en 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SAS9.1.
Resultados
Identificación de miR-29a y miR-29c como microARN candidatos a la CRC recurrencia
Al aplicar el método de IMRE los seis independientes CRC ARNm microarrays de datos, se identificaron cuatro microARN (miR-29a, miR-29c, miR-100 y miR-627) en la etapa II conjuntos de datos y tres microARN (miR-29a, miR-29c y miR-363) en la etapa III conjuntos de datos con un valor de p ≦ 0,1 (Tabla 2). Entre ellos, miR-29a y miR-29c se indicaron tanto en la etapa II y III conjuntos de datos. La figura 1 muestra que el miR-29a tuvo una puntuación más alta en los pacientes recurrentes (indicado como 1) que los pacientes no recurrentes (indicado como 0) en los seis conjuntos de datos. Debido a que la puntuación se calcula a partir de un conjunto de valores de expresión de miR-29a objetivo genes ', una puntuación más alta significa que estos genes diana fueron reguladas en el grupo de recurrencia. En otras palabras, la correlación inversa entre un microARN y su gen diana indica que el miR-29a se había reducido regulado en el grupo de recurrencia y, por tanto, puede desempeñar un papel como un supresor tumoral de CCR. El patrón similar se observó también para miR-29c (datos no mostrados). En este estudio, que no identificó ninguna microARN regulados hasta llegar a nuestro punto de corte definido (P ≦ 0,1) entre los pacientes recurrentes y no recurrentes en los seis conjuntos de datos.
El eje Y es una puntuación que representa el los niveles de expresión de miR-29a y el eje x es el grupo con y sin recurrencia de la CRC. El grupo "1" se refiere al grupo recurrencia y "0" se refiere al grupo de no repetición. La puntuación se calcula a partir de un conjunto de valores de expresión de los genes miR-29a dirigidas ', significa una puntuación más alta que estos genes específicos fueron reguladas en el grupo de recurrencia "1" .El patrón similar se encontró para miR-29c.
el metanálisis de miR-29a y miR-29c
Se realizó un metanálisis para evaluar la intensidad de las asociaciones entre los dos microARN y la recurrencia de CRC (Figura 2) . El uso de meta-análisis, se espera obtener resultados globales y más fiables. El modelo de efectos aleatorios mostró un tamaño del efecto de 213,36 (IC del 95%: 147,38 a 279,34) para miR-29a y un tamaño del efecto de 176,91 (IC del 95%: 111,63 a 242,18) para MIR-29c. De hecho, el modelo de efectos fijos también dio resultados idénticos. combinación de Fisher de los valores de p = 9,14 mostró p × 10
-9 de miR-29a y p = 1,14 × 10
-6 de miR-29c. No hubo heterogeneidad significativa entre los datos de los dos microARN (p = 0,59 para el miR-29a y p = 0,69 para el miR-29c).
En el meta-análisis, el tamaño del efecto (la diferencia en las puntuaciones predichas entre el recurrente y pacientes con CRC no recurrentes) y el error estándar se calcularon para cada estudio. Un tamaño general del efecto y los intervalos de confianza del 95% (IC del 95%) se registraron con los valores de p se estima en base a la combinación de Fisher de los valores de p [36].
A continuación, además analiza los ARNm y su vías en relación con CRC recurrencia para obtener una visión más clara a la patogénesis de la enfermedad. En primer lugar, tenemos una lista de los 10 mejores vías enriquecidos con genes diana de miR-29a /29c (Tabla S3). A continuación, encontrarás una lista de genes diana principales que se asocian significativamente con más recurrencia CRC en el conjunto de datos GEO (Tablas S4). CDC42, que está implicado en 3 vías principales (véase la Tabla S3), fue significativamente diferente entre los pacientes recurrentes y no recurrentes (p = 0,00053 combinado).
miR-29a y miR-29c nivel de expresión en muestras de CRC
Nos recogieron más de 43 pacientes con CRC de recurrencia temprana y 35 pacientes de recurrencia temprana no para validar el miR-29a y miR-29c en lo que se refiere a la predicción de la recurrencia temprana de CRC. Se encontró que tanto el miR-29a y miR-29c tenían significativamente más bajos niveles de expresión en el grupo de recurrencia temprana de la recurrencia grupo no temprana (tanto los valores de p fueron 0,007 después de ajustar por el sexo, la edad y la etapa del cáncer). Ambos microRNAs siguió siendo significativa incluso después de excluir los 10 sujetos (8 primeros no sujetos y 2 sujetos tempranos) de la etapa del cáncer I (Tabla 3). Nuestros resultados empíricos de acuerdo con los resultados del análisis computacional basado en conjuntos de datos de microarrays mRNA, que indica que los dos microRNAs juegan un papel importante en la recurrencia temprana de CRC. En el análisis de Kaplan-Meier, hemos demostrado que, o bien un alto nivel de miR-29a o miR-29c tenía una mejor supervivencia a los 12
º mes, pero sólo el miR-29a podríamos predecir significativamente la recurrencia temprana (Figura S1). El fracaso de la predicción por miR-29c en el análisis de Kaplan-Meier puede ser debido a un seguimiento corto o un corte inadecuado debido a un tamaño pequeño de la muestra.
Discusión
el estudio de los microARN ha comenzado una nueva era para una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, el papel de los microRNAs en la recidiva del CCR todavía no está claro. En este estudio, hemos identificado el miR-29a y miR-29c candidatos como importantes mediante el empleo de un método ingenioso que prioriza los microARN candidatos de acceso público en todo el genoma de expresión génica de datos. El uso de meta-análisis de conjuntos de datos disponibles públicamente y confirmación experimental, hemos medido directamente y validado miR-29a y miR29c como predictores de recurrencia temprana de CRC. Hasta donde sabemos, no se han reportado estos dos microARN estar relacionada con la recurrencia precoz del CCR.
Para deducir la expresión de microARN, se aplicó el método de IMRE por la combinación de micro ARN de predicción de destino y datos de expresión de ARNm. La principal ventaja de este método es que el acceso público de mRNA expresión de datos para la identificación de los microARN supuestos relacionados con las enfermedades de interés. Sin embargo, una estimación robusta para la expresión de microARN también depende de una base de datos fiable de predicción de destino. Aquí hemos utilizado Objetivos microcosmos para la predicción de genes diana de microARN. No hicimos uso de la unión de la combinación de diferentes algoritmos de predicción, como miRNome, ya que es probable que reduzca la potencia debido a muchos objetivos previstos en falso. Además de las metas microcosmos, también utilizamos otras dos bases de datos de predicción, Miranda [32] (agosto de 2010 con la liberación buena puntuación mirSVR, conservada microARN) y TargetScan [33]. miR-29a y miR-29c también fueron indicados por estos software predictivo dos microARN estar involucrado en CRC recurrencia, lo que indica la robustez del método IMRE. Sin embargo, el nivel de significación fue inferior mediante el uso de Miranda (p = 0,0173 para el miR-29a y p = 0.00197 para miR-29c en combinación valor p) de Metas microcosmos (p = 9,14 × 10
-9 de miR-29a y p = 1,14 × 10
-6 de miR-29c). La razón puede ser debido a objetivos más predichos por Miranda que Targets microcosmos.
Se ha hecho un progreso importante para identificar las asociaciones entre los microARN y varias enfermedades comunes, pero aún así es caro para llevar a cabo una expresión de todo el genoma matriz de revelar microRNAs relacionados con la enfermedad. Aunque el uso de herramientas bioinformáticas, tales como el método IMRE puede reducir el número de candidatos y dar prioridad a estos candidatos, un gran número de falsos positivos son inevitables. En el presente estudio, se encontró que algunos microARN altamente significativas predecirse a través de este análisis computacional en un conjunto de datos no puede ser replicada en otros conjuntos de datos. En lugar de utilizar la corrección de Bonferroni conservador, se analizaron varios conjuntos de datos para identificar los microRNAs consistentes para reducir el error de tipo I. El experimento de muestras humanas confirmó aún más el hallazgo en silico.
Nuestros resultados indican que la baja regulación de miR-29a y miR-29c está asociado con la recurrencia temprana del CRC. La baja regulación de la familia miR-29 se ha informado en varios cánceres humanos incluyendo el cáncer de pulmón [38], el cáncer de próstata [39] y el cáncer de mama invasivo [40]. Un estudio reciente ha demostrado que el miR-29 está implicada en la ruta de p53, un importante regulador supresor de tumor [41]. MiR-29 se activa p53 e induce la apoptosis a través de la supresión de la CDC42 y p85 [41]. Nuestro análisis de miR-29 de las metas sugirió que CDC42 (valor combinado p = 0,00053 en la Tabla S4) y otros ARNm son propensos a estar involucrados en la vía potencial de desarrollo de CCR. Además, se observó que la forma mutante de p53 en 51 a 74% del total de CRC y otros tumores humanos [42]. Los estudios ofrecen una posibilidad biológica para apoyar el papel de miR-29 familiares en la supresión de la recurrencia CRC.
Además de los microARN, la recurrencia de CRC podría ser también influenciada por las etapas del tumor y el período de seguimiento arriba. En el análisis de cálculo, que sólo centramos en los pacientes con CRC, con el estadio tumoral II y III etapa porque representaban la mayoría de los pacientes con CCR. Sólo unos pocos pacientes en estadio I presentaron recidiva y la mayoría de los pacientes en estadio IV presentaron recidiva después de la cirugía que conduce a la información menos útil para nuestro estudio. Aunque nuestro estudio empírico utilizado recurrencia temprana (es decir, la recurrencia se lleva a cabo dentro de 1 año después de la cirugía) como el fenotipo de interés, informes recientes indican que el 40-50% de las recidivas se manifieste dentro del primer año después de la resección inicial, y el tiempo de la primera el tratamiento de la recurrencia está fuertemente relacionada con la supervivencia [43] Nuestros resultados experimentales de las muestras humanas de recurrencia temprana estuvieron de acuerdo con la conclusión del análisis computacional que se basa en los pacientes para un seguimiento de 3-6 años, lo que indica que nuestra experimental hallazgo es menos probable que sea influenciada por la duración del seguimiento.
Hemos validado el miR-29a y miR-29c como biomarcadores para CRC recurrencia temprana. Los otros tres microARN (miR-100, miR-627 y miR-363) también fueron identificados por el análisis computacional pero sólo fueron significativas en los pacientes de uno u otro estadio II o III. Por lo tanto, no se investigaron más en el presente estudio debido a una menor prioridad que el miR-29. Nuestro número limitado de muestras experimentales también puede no proporcionar una potencia suficiente para analizar estos dos microARN que sólo son significativos en una etapa del cáncer. Dado que nuestro principal objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de este enfoque computacional para identificar microRNAs útiles, sin analizar estos tres microRNAs potenciales no reduciría significativamente la contribución científica de nuestro estudio.
En conclusión, este estudio mostró una estrategia eficiente combinando el análisis in silico y el experimento empírico para sugerir microARN-29a y 29c-microARN como potenciales biomarcadores para predecir la recurrencia temprana del CRC. El uso de estos biomarcadores pueden permitir a los proveedores de salud y los pacientes a tomar una forma más eficaz para prevenir la recurrencia de CRC. Además, nuestro estudio también proporciona una dirección para una mayor investigación sobre el mecanismo de CRC recurrente.
Apoyo a la Información
Figura S1. Los sujetos fueron
dicotomizadas a tener niveles altos o bajos de microARN según la mediana de 1,39 para el miR-29a y 0,58 para el miR-29c. La línea continua indica el grupo de alto nivel y la línea de trazos significa grupo de bajo nivel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031587.s001 gratis (DOC)
Tabla S1.
microRNAs significativas con p-valores y la tasa de falso descubrimiento (FDR) [1], [2] por miRNome y Objetivos microcosmos en GSE6631. La mayoría de los microARN significativos (incluyendo el causal, el miR-204, indicado por la línea de subrayado) se muestra por tanto de la base de datos de predicción de dos objetivo, miRNome microcosmos y metas, con el GSE6631
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0031587.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
características clínico-patológicas de los 78 pacientes con cáncer colorrectal.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s003 gratis (DOC) sobre Table S3. vías con miR29a o genes diana miR29c analizados por el sistema de análisis de vías MetaCore
Top 10 enriquecida.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s004 gratis (DOC) sobre Table S4.
Asociación significativa de miR-29a genes diana /29c con la recurrencia de CCR en los conjuntos de datos.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s005 gratis (DOC)