Extracto
La mejor manera de aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes es identificar los pacientes que son propensos a desarrollar músculo- enfermedad invasiva por adelantado o metastásico y tratarlos de manera más agresiva. El HCV29 líneas celulares humanas (epitelio normal de la vejiga), KK47 (no muscular bajo grado del cáncer de vejiga invasivo, CVNMI), y YTS1 (cáncer de vejiga metastásico) han sido ampliamente utilizado en estudios de los mecanismos moleculares y la señalización celular durante cáncer de vejiga progresión (BC). Sin embargo, se ha prestado poca atención al análisis del proteoma cuantitativa global de estas tres líneas celulares. Hemos marcado HCV29, células KK47 y YTS1 por el método SILAC usando tres isótopos estables de cada uno de arginina y lisina. Las proteínas marcadas se analizaron mediante 2D ultra-alta resolución de la cromatografía líquida de LTQ Orbitrap espectrometría de masas. Entre 3721 y anotada proteínas identificadas en células únicas KK47 y YTS1, 36 fueron significativamente upregulated y 74 fueron significativamente downregulated con & gt; 95% de confianza. La expresión diferencial de estas proteínas fue confirmada por Western Blot, RT-PCR cuantitativa, y la tinción de células con anticuerpos específicos. la ontología de genes (GO) plazo y la vía de análisis indicaron que las proteínas reguladas diferencialmente estaban implicados en la replicación del ADN y el transporte molecular, el crecimiento y la proliferación celular, movimiento celular, el tráfico de células inmunes, y la muerte celular y la supervivencia. Estas proteínas y las técnicas avanzadas proteoma descritos aquí serán útiles para una mayor elucidación de los mecanismos moleculares en BC y otros tipos de cáncer
Visto:. Yang G, Xu Z, W Lu, Li X, Sun C, Guo J, et al. (2015) Análisis cuantitativo de proteoma diferencial expresión en el cáncer de vejiga contra las células normales vejiga usando SILAC método. PLoS ONE 10 (7): e0134727. doi: 10.1371 /journal.pone.0134727
Editor: Jon M. Jacobs, el Pacific Northwest National Laboratory, Estados Unidos |
Recibido: 20 de enero de 2015; Aceptado: July 13, 2015; Publicado: 31 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro de los archivos de papel y sus archivos de soporte de información
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia para jóvenes científicos de china (Nº 81402115, 81201572), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu, china (núm BK20140172) y el Proyecto 111 de China (No.111-2-06). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BC) es el quinto tipo más común de cáncer en humanos. Hubo un estimado de 74.690 nuevos casos diagnosticados y 15.580 muertes por esta enfermedad en los Estados Unidos en 2013 [1]. De los pacientes totales, BC & gt; 70% tienen la enfermedad no muscular invasiva y ~ 25% se presenta inicialmente con invasión muscular. Los pacientes con la forma del músculo invasivo tienen un riesgo del 50% de las metástasis a distancia y un mal pronóstico [2]. La recurrencia de los tumores superficiales de vejiga es una razón importante para la prevalencia mundial de AC [3]. La mayoría (90%) de BC se clasifican histológicamente como carcinomas uroteliales (UCS), derivados del urotelio de la vejiga [4]. Vejiga tejidos epiteliales tienen una organización jerárquica clara que consta de tres tipos de células morfológicamente distintos: basal, y las células paraguas intermedios, que corresponden respectivamente a principios, los estados del centro y finales de diferenciación [5]. La transformación maligna puede ocurrir en cada uno de estos tipos de células, lo que resulta en una diversidad de fenotipos tumorales [6]. Según el último informe de la Sociedad Americana del Cáncer, la tasa de supervivencia relativa a 5 años antes de Cristo para con la detección temprana (etapa I, (T1, N0, M0)) es de ~ 88% [7]. Por lo tanto, la identificación de nuevos marcadores moleculares en etapa temprana es deseable para mejorar la estratificación del riesgo.
biomarcadores candidatos para la detección BC evaluados hasta la fecha incluyen la telomerasa, el antígeno tumor de vejiga (BTA), proteína de la matriz nuclear 22 (NMP-22) , y producto de degradación de fibrina (FDP). La fiabilidad de las pruebas basadas en estos biomarcadores es pobre debido a su baja sensibilidad y altas tasas de falsos positivos [8-11]. Las proteínas potencialmente pueden ser identificados específica para tipos agresivos o no agresivos de cáncer. el análisis del proteoma es un reto debido a la cantidad limitada de muestra clínica disponible [12]. Monitoreo del proteoma de las células BC podría proporcionar información adicional para fines de diagnóstico clínico.
Los recientes avances en la espectrometría de masas (MS) para la identificación y cuantificación de proteínas facilitan el análisis en profundidad de un gran número de proteínas, y se han utilizado para el examen de todo el proteoma en varios sistemas. Tales métodos incluyen la electroforesis en gel de 2D diferencia (2D DIGE), el iTRAQ similar (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta), la afinidad de isótopos con código de etiquetado (ICAT), y el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) [13- 15]. En comparación con los métodos de cuantificación absoluta basados en péptidos, SILAC tiene las ventajas de mezclar las muestras desde el principio, y la reducción de la variabilidad de muestra a muestra. El marcaje metabólico con isótopos estables ha sido descrito como el "patrón oro" en la cuantificación de proteínas [16]. La arginina (Arg) y lisina (Lys) son los aminoácidos marcados con isótopos estables de uso más frecuente en los estudios basados en SILAC, porque la posterior digestión con tripsina de las proteínas aisladas (que escinde en residuos básicos) para el análisis MS genera péptidos con una sola amino marcado ácido, lo que simplifica el análisis y la cuantificación [17]. En el presente estudio, tres isótopos estables cada uno de Arg (R0, R6, R10) y Lys (K0, K4, K8) en tres culturas separadas ( "luz" (L), "medio" (M), y "pesado" (H)) se utilizaron para analizar las diferencias proteoma en diversas etapas de BC. Distintivo L, las formas M y H de cada péptido como se detecta por MS reflejan las cantidades relativas de la proteína correspondiente en tres etapas de células BC isotópicamente codificados
Se estudiaron tres líneas celulares humanas:. Epiteliales normales de vejiga HCV29, de bajo grado cáncer de vejiga invasivo no muscular (CVNMI) KK47, y el músculo metastásico YTS1 cáncer de vejiga invasivo. Cada una de las tres líneas de células se cultivaron en medio añadieron con tres combinaciones de marcado Lys y Arg ( "luz"), D
4-Lys y
13 C
6-Arg ( "medio"), y
13 C
6
2-Lys y
13C 15N
6
15 N
4-Arg ( "pesado"). Las proteínas con & gt; 98% la incorporación del marcador se analizaron y cuantificaron mediante 2D-HPLC-MS LTQ Orbitrap (figura 1). La expresión diferencial de las proteínas identificadas, que están presumiblemente relacionados con el desarrollo antes de Cristo, fue confirmada por Western Blot, RT-PCR cuantitativa, y la tinción de células con anticuerpos específicos.
Material y Métodos
cultivo de células
HCV29, se establecieron las células KK47 y YTS1 como se describe anteriormente [18-20] y cedida gentilmente por el Dr. Sen-itiroh Hakomori (El Instituto Biomembranas; Seattle, WA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO
2 atmósfera. Para el etiquetado de SILAC, las células fueron cultivadas en SILAC marcado con RPMI 1640 con 10% de FBS dializado y 1% de penicilina /estreptomicina que contiene "luz" (K0R0), "medio" (K4R6), o "pesado" (K8R10) Lys y Arg. Para evitar Arg-to-Pro conversión, se añadió L-Pro (200 mg /L) al medio como se describe anteriormente [21]. Las células fueron cultivadas durante al menos 5 pasos para eliminar no marcado Lys y Arg.
La lisis celular y la proteína de extracción
Las proteínas totales de las tres líneas de células se lisaron y se extrajeron utilizando T-PER Reactivo (Thermo científica; San José, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, las células (~ 1 × 10
7) fueron separadas con tripsina, se lavaron dos veces con helado de 1 × PBS (tampón fosfato 0,01 M que contiene 0,15 M NaCl, pH 7,4), se lisaron con 1 ml de t-PER reactivo que contiene inhibidores de la proteasa (PMSF 1 mM y 0,1% de aprotinina), se incubaron durante 30 min en hielo, se homogeneizó y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 ° C. La concentración de proteína se determinó mediante ensayo BCA. (Beyotime; Haimen, China)
SDS-PAGE y
In-gel digestión
Las proteínas se separaron en un 10% SDS-PAGE , visualizado por tinción Coomassie durante 2 h, y se destiñó durante la noche. cortes de gel extirpados se lavaron con 25 mM de bicarbonato de amonio /50% de acetonitrilo (ACN). piezas secas se incubaron con 20 l de ditiotreitol 10 mM (DTT) a 56 ° C durante 1 hora y luego con un volumen igual de 20 mM yodoacetamida (IAM) a temperatura ambiente en la oscuridad. cortes de gel se lavaron y tripsinizaron con 20 l (10 ng /l) tripsina (Promega, Madison, WI, EE.UU.) durante 30 min a 4 ° C. Se eliminó el exceso de solución de tripsina, 20 l de 25 mM NH
4HCO se añadió
3, y la mezcla se incubó durante la noche a 37 ° C. los productos extraídos se secaron con un concentrador SpeedVac (Trampa CentriVap Fría, Labconco, Kansas, MO, EE.UU.). [22]
MALDI-TOF /TOF-MS
Las muestras secas se disolvieron con 0,1 % ácido trifluoroacético (TFA), manchado sobre un blanco de muestra MTP AnchorChip, y secado al aire. Los péptidos se recristalizaron con ácido α-cyanohydroxycinnamic matriz (CHCA; 1 l de 10 mg /ml) y se caracterizan por MALDI-TOF /TOF-MS (UltrafleXtreme, Bruker Daltonics; Bremen, Alemania). La ionización se consiguió por irradiación con un láser de nitrógeno (λ = 337 nm) que opera a 20 Hz. Los espectros de masas se adquirieron utilizando los programas de software FlexControl y FlexAnalysis
En solución de digestión
Las proteínas de tres tipos de células marcados con isótopos estables se mezclaron a 1:. 1: 1, reducido, y alquilado por incubación con cantidades iguales de 10 mM de DTT y 20 mM IAM. proteínas alquilados fueron digeridos por la tripsina añadido en una proporción de 01:50 (w /w) y se incubaron durante la noche a 37 ° C [23]. péptidos totales se concentraron y se desalaron usando una unidad de 10 kD de exclusión por tamaño de ultrafiltración de centrifugado y se secan utilizando un concentrador SpeedVac.
LC-MS /MS análisis
2D-LC-MS se realizó usando LTQ Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [24]. péptidos digeridos (100 g) se inyectaron en una columna bifásica capilar (id 200 micras) rellena con C
resina 18 (Reprosil-Pur, 5 micras, Dr. Maisch GmbH) y resina de intercambio catiónico fuerte (Luna 5 micras SCX 100A, Phenomenex). efluentes de péptidos de la columna bifásica en cada paso se dirigieron en un 15 cm C
18 columna analítica (de diámetro interno de 75 micras, Reprosil-Pur, 3 micras) a un caudal de 500 nl /min. Nano-ESI se realizó con la corriente de pulverización 2,0 kV y se calienta capilar temperatura 200 ° C. Una MS de barrido completo (300-1800) en el Orbitrap fue seguido por cinco MS /MS scans de los cinco más intensa iones seleccionados a partir del espectro de MS en LTQ. Cargo de cribado estado fue habilitado +2, +3, +4, y por encima de [25].
Se analizaron los análisis de los datos
Los datos en bruto MS utilizando el programa de software MaxQuant (V. 1.2. 2.5) [26,27]. se requiere una tasa de falsos descubrimiento (FDR), de 0,01 para las proteínas y péptidos y un péptido de longitud mínima de 6 aminoácidos. MS /MS espectros fueron registrados por Andrómeda [28] contra la base de datos humana IPI (V. 3.85). El programa determina el estado MaxQuant SILAC de péptidos a partir de diferencias de masa entre los pares de péptidos SILAC, y esta información se utiliza para realizar búsquedas con Arg6 fija y Lys4 o modificaciones Arg10 y Lys8, según el caso. La cuantificación de MaxQuant se realizó tal como se describe anteriormente [26].
La regulación diferencial dentro de cada experimental M /L ratio y H /L ( "medio /luz") ( "pesado /ligero") Relación de las proteínas identificadas se normalizó utilizando el análisis de puntuación z, como se ha descrito anteriormente [29,30]. En breve, M /L y las proporciones de H /L fueron convertidas en espacio log2, y relaciones medias y SD (desviación estándar) se calcularon para cada conjunto de datos. El log2 M /L y H relación /L de cada proteína fueron convertidas en una puntuación z, utilizando la siguiente fórmula: en la que B se considera como una sola proteína en una población conjunto de datos (a ... .n). La puntuación z es una medida de la cantidad de unidades SD (sigma) de la log2 M /L o H relación /l de la proteína estaba lejos de la media poblacional. Una puntuación z ≥1.960σ representado que la expresión diferencial de la proteína mintió fuera del intervalo de confianza del 95%, una puntuación ≥2.576σ representa la expresión fuera del intervalo de confianza del 99%, y una puntuación ≥3.291σ representado confianza del 99,9%. Las puntuaciones Z ≥1.960σ fueron considerados significativos [29].
anotación funcional y Ingenuity Pathways Analysis
proteínas identificadas fueron analizados utilizando la base de datos SWISS-PROT para clasificar su proceso biológico, componente celular, y la función molecular [31]. gen sobrerrepresentados ontología (GO) términos significativos se identificaron utilizando la base de datos para anotación, y Visualización Integrada y Descubrimiento (DAVID) de genes recursos bioinformáticas [32, 33]. Las proteínas determinan ser regulados diferencialmente como se describe en la sección anterior fueron tabulados en su índice números de proteína Internacional (IPI) de Excel y se cargaron en DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) para el análisis funcional de anotación . Los conjuntos de datos que contienen los identificadores de genes y expresión de los valores correspondientes fueron entonces cargados en la aplicación Ingenuity Systems. Cada número IPI fue asignada a su correspondiente gen objeto en la base de conocimientos Ingenuity Pathways. Redes de las proteínas se generaron mediante algoritmos basados en su conectividad. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para calcular un valor de p que indica la probabilidad de que una función biológica particular y /o enfermedad asignado a esa red se debió a la casualidad.
Western Blot
Western Blot se realizado como se describe anteriormente [34]. En resumen, las proteínas se separaron sobre 10% de gel de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, y la membrana se bloqueó usando 5% de leche sin grasa en TBST y se sondaron con anticuerpos específicos. Los anticuerpos primarios fueron de conejo anti-insulina-como factor de crecimiento 2 de unión a ARNm de la proteína 1 (IGF2BP1) (# AP10466b, Abgent; San Diego, CA, EE.UU.), asociado anti-melanoma-conejo antígeno 4 (MAGEA4) (# AP6166a, Abgent), de conejo anti-Thy-1 glicoproteína de membrana (thy1) (# AP2050a, Abgent), Sigma proteína 14-3-3 (SFN) (# SC-365539, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.), anti-conejo -fibronectin (FN1) (# F3648, Sigma-Aldrich), ratón anti-vimentina (VIM) (# V5255, Sigma-Aldrich), el antígeno CD70 (CD70) (# sc-7681, Santa Cruz Biotechnology), y anti-ratón ß-catenina (CTNNB1) (# 610153, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios fueron conejo conjugado anti-ratón o de cabra anti-conejo (# A0216 y#A0208, Beyotime) apropiado peroxidasa de rábano (HRP). Las bandas se visualizaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia (Westar Nova, Cyanagen; Bolonia, Italia).
cuantitativa en tiempo real PCR
Las células (1 × 10
5 por pocillo en una placa de 6 pocillos) se cultivaron y se trataron como se describe anteriormente. El ARN total se aisló utilizando un kit de RNApure tisular (CWBiotech; Beijing, China) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron utilizando el programa DNAMAN (V. 6.0.3; Lynnon Biosoft, Canadá). Primera línea de cDNA fue sintetizado a partir de ARN total usando ReverTra Ace-α (Toyobo; Osaka, Japón). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó mediante SYBR Green basado en LightCycler Tino detección con UltraSYBR mezcla (CWBiotech). La expresión génica se cuantificó por el 2
-ΔΔCT método [35].
tinción celular
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos esterilizados en placas de 24 pocillos hasta confluencia del 70-80%, se lavó , inmovilizado, permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se bloquearon con 5% de leche sin grasa durante la noche a 4 ° C. Las células fijadas se incubaron con anticuerpos primarios diluidos durante 12 horas, se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con FITC a 4 ° C durante 6 h en la oscuridad, se lavaron, se tiñeron con 4 mg /ml DAPI a temperatura ambiente durante 10 min, se lavó con 1 x PBS, y se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (Eclipse E600, Nikon, Tokio, Japón).
resultados
Determinación de la eficacia de incorporación de isótopos
Para analizar los cambios dinámicos en la oncogénesis BC en el nivel de proteoma, se aplicó el método SILAC a tres líneas celulares de vejiga para obtener poblaciones de células marcadas. un etiquetado adecuado es un requisito previo para la cuantificación fiable utilizando este método. En el caso del etiquetado incompleta de las proteínas, en particular para el etiquetado de eficiencia & lt; 95%, la cuantificación de proteínas de baja abundancia serían enmascaradas por péptidos "ligeros" contaminados. Para determinar la eficiencia de incorporación de la etiqueta Lys y Arg, "luz" (HCV29), "medio" (KK47), y (YTS1) las proteínas "pesados" se separaron, y la proteína de alta abundancia fue
In-gel
digerido. MALDI-TOF /TOF-MS Resultados para GVVDSEDLPLNISR péptido en la proteína de choque térmico 90 (P08238) indicó que la incorporación completa de marcado isotópicamente Arg y Lys se logró en KK47 y YTS1, y ninguna conversión-Arg-a-Pro (Figura 2A). análisis LC-ESI-MS /MS de la VNQIGSVTESLQACK péptido doblemente cargado de alfa-enolasa (P06733) y GGPEVQQVPAGER de la ácido graso sintasa (P49327) mostró que estos dobletes de los cúmulos de pico reales eran de HCV29, KK47, y las células YTS1, respectivamente ( La figura 2B).
(A) Determinación de la eficacia de incorporación por MALDI-TOF /TOF-MS. Picos anotado como R0 (izquierda), R6 (centro) y R10 (derecha) son GVVDSEDLPLNISR péptido de la proteína de choque térmico 90 desde HCV29, KK47, y las células YTS1. Identificación (B) y la cuantificación de proteoma en las células BC por 2D-HPLC LTQ Orbitrap MS. Picos anotado como K0, K4 y K8 (izquierda) y R0, R6 y R10 (derecha) pagan doblemente péptido VNQIGSVTESLQACK de enolasa alfa y GGPEVQQVPAGER de la sintasa de ácidos grasos.
Modelo
celular para SILAC cuantificación del proteoma en BC progresión
las proteínas aisladas de las tres líneas celulares se mezclaron (1: 1: 1) y se digirió utilizando un filtro de 10 KD (Millipore; Billerica, MA, EE.UU.). Los péptidos se analizaron por ultra alta resolución cromatografía líquida-MS en tándem (NLC-ESI-MS /MS) en una trampa de iones lineal LTQ instrumento Orbitrap híbrido. Un total de 3721 proteínas únicas se identificaron en dos replicar experimentos independientes (Figura 3A y en la Tabla S1). De estos, 1766 proteínas (47,5% del total) que fueron identificados en ambos experimentos y cumplieron con los criterios establecidos para la cuantificación de proteínas fueron sometidas a un mayor análisis bioinformático. Los histogramas de distribución de tasas de registro, tanto para M /G y H /L se ajustan a una distribución de Gauss. La mayoría de las proteínas identificadas estaban dentro del rango de ± 1 de tasas de registro (Figura 3C y 3D). Utilizando 1 como la relación de registro de umbral, la expresión de proteínas de 255 fue mayor en tanto KK47 y HCV29, y la expresión de las proteínas 434 fue menor en tanto KK47 y HCV29 (Figura 3B). las puntuaciones z distribución basada en la población permite la comparación directa de las proteínas de diferentes experimentos. Los diferentes puntos de corte de nivel de confianza se aplicaron a los datos por análisis de puntuación z para determinar qué proteínas se regula significativamente diferencialmente. Los puntos de corte aplicados fueron 95%, 99% y 99,9%, correspondiente a las puntuaciones z de ± 1.960, ± 2.576 y 3.291 ±, respectivamente. Utilizando un punto de corte del 95%, se observó la regulación diferencial significativa para 110 proteínas en KK47 vs. HCV29 (36 Upregulated, 74) y la regulación a la baja de 87 proteínas en YTS1 vs. HCV29 (17 arriba, 70 abajo). se observó la regulación diferencial para 35 proteínas en las dos líneas BC vs. HCV29 utilizando un punto de corte 99% (2 arriba, 33 hacia abajo), pero sólo cinco de estas proteínas usando un corte de 99,9% (2 arriba, 3 abajo) (Tabla 1 ). Las tablas 2 y 3 lista de las proteínas upregulated y downregulated determinados en los dos experimentos, con sus tasas medias de SILAC y las puntuaciones z. Todas las proteínas diferencialmente regulado con & gt; 95% de confianza tenía un & gt; alteración de 5 veces de relaciones de SILAC, y la mayoría de las proteínas reguladas diferencialmente con & gt; 99% de confianza tenía un & gt;. Alteración de 10 veces de relaciones de SILAC
(A) diagramas de Venn del número de proteínas identificadas a partir de experimentos individuales. (B) Las relaciones de KK47 /HCV29 (M /L) y YTS1 /HCV29 (H /L) para el conjunto de 1766 proteínas. log2 de la relación de SILAC para cada proteína (n = 2) refleja las diferencias en la expresión relativa entre KK47, YTS1, y células HCV29. (C) La distribución de los coeficientes de SILAC M /L. (D) La distribución de los coeficientes de SILAC H /L. (E) gráfico de clúster ( "mapa de calor") generada por la agrupación jerárquica de las proteínas reguladas significativos después de promediar las puntuaciones z utilizando un punto de corte del 95%.
La agrupación jerárquica se realizó el análisis de muestras para examinar las correlaciones de los patrones de proteoma entre las tres líneas celulares. El gráfico de clústeres ( "mapa de calor") muestra que las muestras de la misma agrupación línea celular juntos (Figura 3E). Algunos proteomas fueron distintiva entre las tres líneas celulares basados en alteraciones significativas en comparación metastásico no muscular de bajo grado invasivo, mientras que otros proteomas fueron moderados y consistente. Las proteínas en el primer grupo pueden estar implicados en el desarrollo antes de Cristo.
Clasificación funcional y análisis de la vía de las proteínas identificadas
interpretación funcional es un paso crucial en el análisis de datos cuando se amplia anotación funcional de los conjuntos de datos es no disponible. Teniendo en cuenta su localización exclusiva en GO, las proteínas identificadas estaban vinculados a al menos un término de anotación cada uno dentro de la función GO molecular, proceso biológico, y las categorías de componentes moleculares. Las funciones moleculares más comunes son vinculantes (47,2%), y la actividad catalítica (30,9%) (Figura 4A). Las principales categorías de procesos biológicos eran celular (16,3%), de un solo organismo (14,2%), y metabólico (13,8%) (Fig 4B). Las principales categorías de componentes celulares eran celular (17,6%), parte de la célula (17,6%), y orgánulos (15,8%) (Figura 4C).
Las proteínas que se muestran fueron vinculados a al menos un término de anotación dentro de la GO molecular de función (A), proceso biológico (B), y los componentes celulares (C) categorías.
Para identificar los términos de enriquecimiento asociados con los grupos upregulated y downregulated de proteínas después de un promedio de las puntuaciones z usando la 95 % de corte, listas de proteínas se han subido a la página web DAVID usando el proteoma humano completo como fondo. Para ayudar a aclarar qué funciones moleculares y procesos biológicos fueron los más afectados durante la maduración antes de Cristo, GO términos excesivamente representados fueron identificadas con base en el recuento de umbral de ≥ 2 y Expresión Análisis sistemático Explorer (EASE) & lt; 0.1. Se analizaron las funciones de más de una representación moleculares, procesos biológicos, componentes celulares y en los términos de GO enriquecido significativas de proteínas upregulated. La función molecular más alto rango era la actividad transmembrana transportador de aminoácidos neutros (2 proteínas). Los procesos biológicos más alto rango eran celular de aminoácidos proceso derivado metabólico (4 proteínas), ribonucleoproteína la biogénesis complejo (4 proteínas), la respuesta al estímulo extracelular (4 proteínas), y el proceso de biosíntesis compuesto de nitrógeno (4 proteínas). Los componentes celulares más altamente clasificados fueron intracelular de orgánulos de membrana no acotada (14 proteínas) y orgánulos de membrana no acotada (14 proteínas).
A continuación, sobre-representados funciones moleculares, procesos biológicos, y los componentes celulares en los términos de GO enriquecido significativas de proteínas downregulated fueron analizados. Las funciones moleculares más alto rango eran de iones de calcio de unión (16 proteínas), la actividad de la molécula estructural (11 proteínas), y la unión a proteínas idénticas (10 proteínas). Los procesos biológicos más altamente clasificados fueron adhesión celular (14 proteínas), la adhesión biológica (14 proteínas), respuesta a heridas (13 proteínas), y la respuesta inmune (13 proteínas). Los componentes celulares más altamente clasificados eran membrana plasmática (40 proteínas), que forma parte de la membrana plasmática (30 proteínas), y orgánulos de membrana no acotada (24 proteínas) (Tabla S2)
.
Las proteínas se analizaron adicionalmente, y proteínas metabólicas y vías canónicas y de interconexión se generaron utilizando Ingenuity Pathways Analysis (IngenuityH Systems, www.ingenuity.com). Las funciones de red principales identificadas como proteínas upregulated en las células BC estaban implicados en la replicación del ADN, el metabolismo de aminoácidos, el transporte molecular (52 proteínas; la figura 5A), la expresión génica y trastornos hereditarios (33 proteínas), el crecimiento celular y la proliferación (20 proteínas; la figura 5B), y después de la traducción modificación y el cáncer (4 proteínas). Las funciones de red superiores identificados como proteínas de regulación a la baja en las células BC eran movimiento celular y el tráfico de células inmunes (97 proteínas; la figura 5C), el metabolismo de los lípidos (31 proteínas; la figura 5D), el desarrollo celular, el crecimiento y la proliferación y la muerte celular y la supervivencia (6 proteínas). Estos hallazgos indican que proteomas celulares de BC estaban cambiando continuamente dependiendo de la etapa de la metástasis de las células.
(A y B) las funciones de red Top de la replicación del ADN, el transporte molecular, el crecimiento celular y la proliferación celular de las proteínas upregulated. (C y D) funciones Top red de movimiento celular, el tráfico de células inmunes, y el metabolismo de los lípidos. Las líneas continuas: interacciones directas conocidos. Las líneas discontinuas: sospecha o interacciones indirectas. Blanco: proteínas que se sabe en la red, pero no identificados en nuestro estudio
Confirmación de MS resultados por Western Blot
Las variaciones de las proteínas diferenciales descritas anteriormente fueron confirmados por Western Blot. . Thy1, MAGEA4, IGF2BP1 y SFN se detectaron en niveles altos en las células BC KK47 y YTS1 que en las células HCV29 epiteliales de vejiga normales, mientras que VIM, CTNNB1, FN1 y CD70 fueron detectados en niveles inferiores de KK47 y YTS1 que en HCV29 (Figura 6B y 6C). En general, los resultados de Western Blot fueron consistentes con las variables de análisis MS (Figura 6A; S1 y S1 Tabla FIG)
(A) SILAC L:. M: H ratios medias de seis proteínas seleccionadas. (B) Análisis de transferencia Western de proteínas seleccionadas. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF, se sondaron con sus anticuerpos primarios, y se incubaron con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugado con HRP de conejo anti-ratón o de cabra. (C) la cuantificación densitométrica de los niveles de proteína. La proteína se normalizó por el Tublin, y luego en comparación con HCV29, que fueron arbitrariamente fijado en el 1,0. la expresión (D) Gen para las proteínas se analizó mediante qRT-PCR. Expresión relativa en comparación con las muestras de control se analizó por el método 2
-ΔΔCt y representado como Log
2. La expresión de genes anteriores Log
2 (2) o por debajo de registro
2 (1/2) se upregulated o downregulated significativamente, respectivamente.
Confirmación de los resultados SILAC de QRT-PCR
la expresión de seis genes que responden a nivel transcripcional se evaluó mediante qRT-PCR. En las células BC KK47 y YTS1, expresión de
MAGEA4
,
thy1
, y
IGF2BP1
se incrementó significativamente, mientras que la de
VIM
,
CTNNB1
, y
FN1
se redujo considerablemente (figura 6D). Estos resultados son consistentes con los resultados de SILAC.
Confirmación de SILAC y los resultados de transferencia Western mediante tinción de células con anticuerpos
Los anticuerpos que reconocen MAGEA4, thy1, IGF2BP1, proteínas VIM, CTNNB1, y FN1, cuya expresión diferían significativamente en las células BC vs células HCV29, se utilizaron para confirmar los resultados de los análisis anteriores y para evaluar las distribuciones de proteínas. intensidad de la señal de fluorescencia en las dos líneas celulares de BC fueron significativamente mayores para MAGEA4, thy1, y IGF2BP1 y significativamente menor para VIM, CTNNB1, y FN1, de acuerdo con SILAC, Western Blot, y los resultados de RT-PCR. Se observó la localización preferencial para MAGEA4 en el citoplasma central (incluyendo las mitocondrias y centrosoma) y la región nuclear, para Thy1 y VIM en la membrana citoplasmática y el citoplasma, para IGF2BP1 en la región nuclear y el citoplasma, y para CTNNB1 y FN1 en la membrana citoplásmica (Fig 7 )
HCV29, células KK47 y YTS1 se cultivaron y se tiñeron con seis anticuerpos dirigidos a las proteínas identificadas (MAGEA4, thy1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, FN1) marcado con Cy3 como se describe en M & amp;. M. Las imágenes se muestran las imágenes de combinación de anticuerpos conjugados con Cy3 y DAPI de los núcleos (aumento del objetivo de 60 ×). Las barras de escala: 70 micras
Discusión
El carcinoma urotelial de la vejiga es único entre los carcinomas epiteliales en sus caminos divergentes de la tumorigénesis.. En el momento del diagnóstico de células de transición antes de Cristo, ~ 80% de pacientes en el bajo grado (grado 1-2) etapa no músculo invasivo (CTA o cT1). En los pacientes con enfermedad de bajo grado Ta, la supervivencia libre de progresión de 15 años es del 95%, sin mortalidad específica por cáncer [36]. Por lo tanto, se necesitan biomarcadores para predecir el riesgo de progresión de la fase de no-invasivo para invasivo o no metastásico con metástasis y predecir la capacidad de respuesta a las terapias sistémicas. El HCV29 líneas celulares humanas (epitelio normal de la vejiga), KK47 (no muscular cáncer de vejiga invasivo de bajo grado), y YTS1 (cáncer de vejiga metastásico) han sido ampliamente utilizado en estudios de los mecanismos moleculares y la señalización celular durante la progresión de cáncer de vejiga en el músculo o metastásico Unidos [37]. Sin embargo, poca atención se ha prestado a análisis proteómico cuantitativo global de estas tres líneas celulares.
El análisis cuantitativo de proteínas en diferentes etapas de la progresión de la AC es una tarea difícil pero importante para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. SILAC, una estrategia de marcaje isotópico diferencial que implica marcaje metabólico de las proteínas
in vivo
, ha sido ampliamente aplicado en biología celular y estudios de organismos modelo tales como levaduras, bacterias, nematodos, plantas y ratones [38, 39 ]. En SILAC, isótopos naturales "ligeras" de carbono, nitrógeno e hidrógeno en aminoácidos incorporados durante la traducción de proteínas son sustituidos por isótopos "pesados" como el 15N
13C,
y
2H. Ningún estudio hasta la fecha ha cuantificado diferencias en la abundancia de proteínas en diversas etapas de BC. Estudios anteriores se han centrado en los niveles de proteína comparativos en pacientes BC vs. sujetos de control, pero no en las alteraciones de los niveles de proteína durante BC progresión [8,9].
Identificación y caracterización de los niveles de proteína en diversas etapas de diferenciación son esencial para nuestra comprensión del desarrollo del tejido normal y la transformación maligna. En el presente estudio, hemos aplicado el método de análisis de SILAC HCV29, KK47, y YTS1. Esta estrategia proporcionado información proteínas para las tres líneas celulares durante un experimento MS. Tras la normalización por el método de puntuación z, se observó la regulación diferencial de 110 proteínas en KK47 vs. HCV29 y para 87 proteínas en YTS1 vs. HCV29. Estas proteínas reguladas diferencialmente, que pueden jugar un papel importante en el desarrollo de BC, incluyen SFN (14-3-3 proteína sigma), SELENBP1 (proteína de unión de selenio-1), COL6A3 (colágeno α3 (VI) de la cadena), y CD70.