Extracto
matriz extracelular (ECM) de remodelación es un componente clave de la migración celular y la metástasis del tumor, y se ha asociado con la progresión del cáncer. A pesar de la importancia de la remodelación de la matriz, los estudios sistemáticos y cuantitativos sobre el proceso en gran medida han sido insuficientes. Además, no queda claro si la característica homeostasis tensional interrumpido de malignidad es debido a alterado inicialmente ECM y tejidos propiedades, o a la alteración del tejido por las células tumorales. Para explorar estas preguntas, hemos realizado un estudio remodelación de la matriz por dos líneas celulares de cáncer de próstata diferentes en un sistema de colágeno tridimensional. Durante una semana, que supervisó los cambios estructurales en geles de diferente contenido de colágeno mediante microscopía confocal de reflexión y análisis cuantitativo de imágenes, el seguimiento de las métricas de la fracción de fibrillas, tamaño de poro, y la longitud de la fibra y diámetro. Los geles que se sembraron sin células (control), las células LNCaP y células DU-145 se compararon cuantitativamente. Los geles con mayor contenido de colágeno inicialmente tenían más pequeños tamaños de poro y las fracciones de fibrillas más altas, como se esperaba. Sin embargo, con el tiempo, LNCaP- y matrices DU-145 pobladas mostraron diferentes propiedades estructurales compararon tanto entre sí y a los geles de control, con las células LNCaP que aparece a favorecer microambientes con fracciones de fibra de colágeno más bajas y poros más grandes que las células DU-145. Postulamos que la preferencia de las células DU-145 'para matrices densas es debido a su mayor capacidad de invasión y capacidades proteolíticas. La inhibición de las proteasas de la matriz por resultado una disminución fracciones de fibrillas de geles de concentración altos sembradas con el tipo celular, ya sea, el apoyo a nuestra hipótesis. Nuestros nuevos resultados cuantitativos sondean la dinámica de remodelación gel en tres dimensiones y sugieren que las células de cáncer de próstata remodelar su ECM de una manera sinérgica que depende de las propiedades iniciales de la matriz, así como su capacidad de invasión
Visto:. Harjanto D , Maffei JS, Zaman MH (2011) Análisis cuantitativo del efecto del cáncer de invasión y la concentración de colágeno en la matriz Remodelación 3D. PLoS ONE 6 (9): e24891. doi: 10.1371 /journal.pone.0024891
Editor: Mario A. Barbosa, Instituto de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Oporto, Portugal
Recibido: 28 de abril de 2011; Aceptado: 23 Agosto 2011; Publicado: 27 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Harjanto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores reconocer el apoyo de los Institutos nacionales de Salud (1R01CA132633). DH es apoyado por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los cánceres, incluyendo el cáncer de próstata, sólo se hacen fatal una vez que las células cancerosas se han diseminado a sitios distantes [1]. metástasis del cáncer implica la migración de las células de la masa tumoral original a través de la membrana basal y el tejido conectivo laxo en la sangre o el sistema linfático. Las células tumorales se extravasan desde el sistema circulatorio para encontrar su camino a nuevos tejidos. Durante la metástasis, las células interactúan con la matriz extracelular (ECM), una red compleja de glicosaminoglicanos, proteínas de adhesión, y fibras estructurales, tales como el colágeno. Muchas de las propiedades de la ECM, incluyendo la estructura de la matriz [2], la mecánica [3], y dimensionalidad [4], se han demostrado su impacto en el comportamiento celular. Células in vivo suelen estar rodeados por todos lados por ECM, que muestra propiedades mecánicas y estructurales específicos de tejido. En consecuencia, es importante para estudiar las células en los sistemas sintonizables tridimensionales (3D), que imitan las condiciones fisiológicas mejor que los sustratos planos, altamente rígidos.
Un paso crítico in vivo durante la migración celular, invasión y metástasis es remodelación de la matriz. proteólisis Matrix es especialmente importante para las células sembradas en 3D, ya que son más propensos a ser obstruido estéricamente de movimiento de células sobre sustratos planos. En consecuencia, se ha demostrado que la inhibición de metaloproteasas de la matriz (MMPs) reduce la velocidad de la célula y la persistencia en matrices en 3D, pero puede no alterar significativamente el movimiento de células tumorales en sustratos 2D [5], [6]. la expresión de MMP también a menudo aumenta durante la progresión del cáncer [7], lo que sugiere que las células tumorales avanzados remodelar más activamente el ECM para facilitar la metástasis. MMP-2 y MMP-9 se han identificado como MMPs importantes involucrados en el cáncer de próstata metastásico [8]. Las células también pueden utilizar su maquinaria actomyosin a tirar de la matriz para alinear las fibras [9] - [11]
Mientras remodelación de la matriz es un proceso importante, pocos estudios han tratado de estudiar directamente.. De particular interés es la comprensión de cómo la remodelación dinámica altera la estructura de ECM. Una herramienta que se ha utilizado para estudiar la estructura ECM es microscopía confocal de reflexión (CRM). CRM recoge la luz que es reflejada por las fibras de ECM, lo que permite la reconstrucción estructural en 3D de la matriz. Si bien el trabajo reciente muestra que el CRM es ciego a las fibras orientadas en la dirección de la luz incidente, lo que resulta en un tamaño de malla de red sobreestimación [12], CRM es todavía una técnica ampliamente utilizada, proporcionando datos informativos que pueden formar la base de estudios comparativos. CRM se ha utilizado anteriormente para estudiar la estructura de colágeno [13] - [16], la fibrilogénesis [17], y cómo las células interactuar con el ECM [18], [19]. Por desgracia, muchos de los estudios sobre las interacciones célula-matriz han sido bastante cualitativa, y aún tienen que proporcionar una comparación directa entre la capacidad de invasión de las células, la concentración inicial de colágeno, y /o los cambios en la estructura con el tiempo
.
en este trabajo, nuestro objetivo es responder a todas estas preguntas cuantitativamente. Exploramos cómo las propiedades estructurales de la matriz, tal como se cuantifica por análisis de imagen de los datos de CRM, el cambio en el tiempo para evaluar la remodelación de ECM por las células de cáncer de próstata en un sistema de gel de colágeno 3D, variando la concentración de colágeno para determinar el efecto de la estructura de ECM inicial y la mecánica . El comportamiento de remodelación de líneas celulares de cáncer de próstata, dos LNCaP y DU-145, se comparan. células LNCaP son una línea celular relativamente lento crecimiento, sensible a andrógenos derivada de una lesión metastásica de hueso [20]. DU-145 células se crecen más rápido, andrógenos insensible, y se derivan de una lesión metastásica en el cerebro [21]. Un número de estudios han demostrado que DU-145 células son más activamente invasiva que las células LNCaP [22] - [25]. A partir de este trabajo, que son capaces de obtener una visión cuantitativa de cómo dos líneas celulares tumorales diferentes de diferente capacidad invasora remodelar la matriz en entornos 3D. Nuestros resultados proporcionan una nueva comprensión de la dinámica de las interacciones célula-matriz desde la perspectiva de la matriz.
Resultados
Los geles de colágeno variando la concentración muestran diferentes propiedades mecánicas y estructurales
Para obtener una línea de base para la comparación, se estudiaron 3D geles de diferente concentración de colágeno (2, 3, o 4 mg /ml) que no se sembraron con células (identificado como el "no celular" condición). La reometría se realizó para evaluar la rigidez inicial de los geles. Como era de esperar, el módulo de corte aumenta con la concentración de colágeno, que van desde ~ 200 a 550 Pa durante 2 a 4 mg /ml geles (Figura 1A), obteniéndose resultados comparables a los descritos por otros grupos utilizando una técnica de gelificación similar [26].
(
un
) módulo de corte en función de la concentración de colágeno para geles sin células. Las barras de error: desviación estándar. imágenes CRM para geles sin células para (
B Opiniones) 2 mg /ml; (
C
) 3 mg /ml; y (
D
) 4 mg /ml. (
E
) CFM y la superposición de CRM DU-145 células (verde) en 3 mg /ml de colágeno (blanco) 5 días después de la siembra. La barra de escala para las imágenes de CRM: 30 micras
Para el análisis estructural, pilas de imágenes de CRM fueron adquiridas por los distintos geles de colágeno 1, 3, 5 y 7 días después de la siembra.. imágenes CRM representativos de los tres tipos de geles se muestran en la Figura 1B-D. En este estudio, los parámetros estructurales de interés son la fracción de fibras de colágeno en la zona de ocupar (referido como "fracción de fibrilla"), tamaño de poro, y diámetro de la fibra y la longitud. Estos parámetros fueron seleccionados como métricas rastreables, fisiológicas importantes de la remodelación de la matriz. Cualitativamente, es evidente que los resultados de colágeno mayor de concentración en geles que son más densamente pobladas con fibras, dando como resultado tamaños de poro más pequeños. análisis de imagen cuantitativo corrobora estas observaciones, como una mayor fracción de fibrillas (Figura 2A) y menor tamaño de poro (Figura 2B) que se ve con concentraciones de colágeno más altas. En general, no hay ningún cambio significativo en el tiempo para el tamaño de la densidad de fibrillas y de poro (Figura S1) para los geles de cada concentración de colágeno específico, como sería de esperar en ausencia de remodelación de la matriz.
(
Un
) fracción de fibrillas; y (
B Opiniones) tamaño de poro, una semana después de la siembra. Para geles sembrado de células, se presentan datos de regiones celulares.
células LNCaP y células DU-145 remodelar la matriz de maneras distintas depende de la concentración inicial de colágeno
Los geles de diferente concentración de colágeno (2, 3, 4 mg /ml) se siembran a continuación con células de cáncer de próstata teñido con fluorescencia. Para visualizar las células teñidas, microscopía de fluorescencia confocal (CFM) se llevó a cabo en conjunción con CRM. Una imagen representativa se muestra en la Figura 1E, que muestra que las células cancerosas se adhieren claramente a una red en 3D de fibras de colágeno.
Al igual que con los geles de control, geles sembrado de células se obtuvieron imágenes de 1, 3, 5, y 7 días después de la siembra para dar una idea de la dinámica de la remodelación de la matriz. Para entender la medida en que remodelación de la matriz se produce a nivel mundial frente inmediatamente local para las células, las regiones del gel que en un punto de tiempo dado células (identificado como "regiones celulares"), así como regiones que no fueron ocupados por células contenidas (identificado como "acelular regiones "), se obtuvieron imágenes. Las diferentes regiones se muestrearon entre puntos de tiempo por lo que no se puede concluir que una región determinada fue (o no fue) ocupada por las células durante el transcurso del experimento como células son móviles. No obstante, es interesante observar que mientras que los geles de control muestran diferentes propiedades estructurales en comparación con los geles de cabezas de serie, no hay diferencia significativa en la fracción de fibrillas y tamaño de poro de las regiones acelulares y celulares en geles sembrada con células LNCaP en 2 mg /ml de colágeno concentración con el tiempo (Figura 3). Este es el caso para las dos líneas celulares y para todas las concentraciones de gel en cualquier punto de tiempo dado (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la remodelación de la matriz se produce a escala mundial, especialmente cuando la matriz se siembra con una densidad relativamente alta de las células, como es el caso aquí
(
Un
) fracción de fibrillas.; y (
B Opiniones) tamaño de poro, a través del tiempo. regiones celulares de geles sembradas contienen células; regiones acelulares no lo hacen.
Cuando las células LNCaP y las células DU-145 se sembraron en colágeno, existe un claro cambio en la fracción de fibrillas y tamaño de los poros en comparación con la no condición celular (Figura 2). Una semana después de la siembra, en comparación con los geles de control, ambas líneas celulares muestran mayor contenido de fibrillas de colágeno en 2 mg /ml y geles de poros más pequeños. (datos comparativos para el cambio en las propiedades de la matriz para geles sembradas con el tiempo se puede ver en la Figura S2.) DU-145 células parecen depositar considerablemente más colágeno que las células LNCaP en 2 mg /ml geles. En los geles de concentración de colágeno más altas, el comportamiento de las dos líneas celulares diverge más. En comparación con los geles de control, no aparecen las células DU-145 para cambiar significativamente su entorno, mientras que los 3 mg /ml y 4 mg /ml geles LNCaP cabeza de serie, muestran significativamente más bajas fracciones de fibrillas y poros correspondientemente mayores. Los perfiles de longitud de fibra y diámetro para ambas líneas celulares son muy comparable a lo que se observa en la condición de la celda no (Figura 4). Hay que señalar sin embargo que en los 2 mg /ml de geles, se observó más de una diferencia en estas propiedades de la fibra que en las densidades de colágeno más altas, con geles de LNCaP cabeza de serie, que muestran ligeramente más estrecho, fibrillas más cortas. células LNCaP parecen favorecer ambientes con ocupación de colágeno de aproximadamente ~ 20%, mientras que las células DU-145 a favor de microambientes más densas con una ocupación de fibrillas de ~25-30% como las fracciones de fibrillas de las tres concentraciones de colágeno probados parecen converger en torno a estos valores a lo largo el curso de los experimentos
diámetros de las fibras para (
Un
) 2 mg /ml.; (
C
) 3 mg /ml; y (
E
) 4 mg /ml. para longitudes de fibra (
B Opiniones) 2 mg /ml; (
D
) 3 mg /ml; y (
F
) 4 mg /ml. El eje Y indica la fracción decimal de fibras con un diámetro o longitud dada, como es el caso de los otros gráficos de perfil de fibra (véase también la figura S1C-F).
células LNCaP y DU- 145 células demuestran diferentes niveles de actividad proteolítica, y la inhibición de esta actividad altera el comportamiento de remodelación de la matriz observó
Para evaluar directamente la actividad proteolítica y la invasividad de las dos líneas celulares diferentes de forma más directa, se realizó zimografía en gel. Como era de esperar a partir de estudios anteriores [22] - [25], DU-145 células parece ser mucho más invasivo, que muestra los niveles más altos de la proteolisis por activa MMP-2 y MMP-9 activa de las células LNCaP (Figura 5). El aumento de la capacidad de invasión de las células DU-145 puede dar cuenta de su tolerancia de microambientes de colágeno más densamente fibrosos
(
Un
) zymogram gelatina.; y (
B
) cuantifica de datos, con el número de píxeles de la zona de la actividad proteolítica en el gel normalizado por la densidad celular usada en el experimento. Las barras de error representan el error estándar.
Para probar esta hipótesis, un inhibidor de MMP de amplio espectro, Marimastat, que bloquea la actividad de MMP-1, 2, 3, 7, 9, y 12 [27 ], se utilizó para el tratamiento de las células sembradas en geles de colágeno de diferente concentración. Una vez que la actividad de MMP se inhibió en ambas líneas celulares, las fracciones de fibrillas de los 4 mg geles /ml fueron mucho menores de lo que se ve en los geles sembrados con células no tratadas (Figura 6), incluso cayendo por debajo de lo observado en los geles de control. Este resultado apoya la hipótesis de que el aumento de la actividad de MMP puede permitir que las células continúan creciendo y prosperar en microambientes altamente fibrosas. En ausencia de dicha actividad, las células remodelar la matriz para acomodar mejor sus necesidades modificadas.
fracciones fibrillas de regiones celulares de geles medidos de 3 días después de la siembra para geles sembrados con (
Un
) LNCaP Células; y (
B Opiniones) DU-145 células.
Discusión
remodelación de la matriz es un paso clave en la migración celular, invasión y metástasis. Una comprensión cuantitativa de cómo las células tumorales en diferentes etapas de progresión de la enfermedad alteran sus microambientes es fundamental para una comprensión global de progresión de la enfermedad y la intervención terapéutica. Aquí hemos examinado cómo la estructura de la matriz evoluciona con el tiempo el uso de CRM cuantitativa, el estudio de las matrices de colágeno en 3D de concentración variable se sembró con líneas celulares de cáncer de próstata dos de diferente capacidad invasora.
Hemos encontrado que los geles de colágeno sin células muestran un mayor módulo de cizallamiento y exhibió menor tamaño de poro y una mayor fracción de fibrillas con el aumento de la concentración de colágeno como se esperaba. El tamaño de la fracción de fibrillas y poro de estos geles de control no cambió significativamente con el tiempo. También pudimos demostrar que las células LNCaP y células DU-145 está remodelando activamente su entorno. Después de una semana, ambos tipos de células aumentó la fracción de fibrillas y reducen el tamaño de poro de los geles 2 mg /ml en comparación con el control. Mientras tanto, en 4 mg /ml geles, las células modificadas las matrices para reducir la fracción de fibrillas y aumentar el tamaño del poro. Los cambios estructurales observados fueron detectables sobre una escala de tiempo de varios días y se encontró que producirse de manera relativamente uniforme a través de las matrices, ya que no había diferencia entre acelular y regiones celulares de LNCaP- o geles de DU-145 de semilla.
también se demostró que las células LNCaP y las células DU-145 remodelar la matriz de distintas maneras, lo que implica que los diferentes tipos de células favorecen diferentes tipos de microambientes y remodelará en consecuencia para que coincida con sus necesidades. Por término medio, las células LNCaP parecieron favorecer un menor contenido de colágeno y tamaños de poro mayor que las células DU-145. 2 mg /ml de colágeno geles sembrados con células LNCaP muestran fibras más cortas, más estrechas en promedio que su control y DU-145 contrapartes. En concentraciones más altas, los perfiles de fibra para cada concentración de colágeno para las tres condiciones (control, LNCaP y DU-145) fueron menos distinguibles, lo que sugiere que es la organización de la matriz en lugar de la estructura del colágeno individuo fibrillas sí mismos que son diferente entre las diferentes condiciones de gel.
Upregulated remodelación de la matriz es una característica clave de los tumores. Remodelación incluye la deposición de nuevo ECM, la degradación de componentes de la matriz existentes, y la alineación de la fibra. La deposición de nuevo ECM no puede esperarse en microambientes tumorales como uno podría suponer que las células en 3D matrices prefieren tratar con un menor número de obstáculos estéricos a la invasión. Sin embargo, concentraciones de ligando ECM intermedios en vez de muy bajos han demostrado ser óptimo para el movimiento celular debido a la necesidad de equilibrar las fuerzas de tracción y de adhesión [28]. Los estudios histológicos han indicado que los tejidos malignos también muestran una mayor deposición de colágeno [29]. Recientemente se ha demostrado que líneas celulares de cáncer invasivos, incluyendo las células LNCaP, producen un colágeno de tipo I que es resistente a la degradación de MMP-y facilita la proliferación y migración [30]. En los geles de colágeno 2 mg /ml, especialmente entonces, la deposición de ECM puede ser importante para la adhesión celular y el movimiento, lo que explica el contenido de colágeno aumentado observada en presencia de las células.
A la inversa, cuando las células cancerosas se encuentran con densas redes de ECM tales como la membrana basal, el aumento de la proteolisis de la matriz y alineación de las fibras se vuelve crítico para el movimiento celular. biopsias de cáncer de próstata presentan mayores niveles de MMP que los tejidos normales [29]. Es posible que DU-145 células no se remodelan los relativamente densas 3 y 4 mg /collagen matrices ml a tan gran medida que las células LNCaP ya que las células DU-145 son más invasivas [22] - [24] y expresar niveles más altos de MMPs, incluyendo MT1-MMP [23], y son por consiguiente más capaz de moverse a través de este tipo de entornos densos. células LNCaP necesitan para organizar la matriz mediante la degradación selectiva o la alineación de fibras usando su maquinaria actomyosin para alcanzar mayores tamaños de poro. Dado que el colágeno puede, además de ser un obstáculo para la migración, facilitar la invasión y la proliferación [30], DU-145, como la línea de células más invasiva, se adapta mejor a un gel más fuertemente fibrosa.
Cuando MMPs eran inhibida en ambas líneas celulares, encontramos que la preferencia de las células de matrices densas se redujo de forma concomitante, como las fracciones de fibrillas en 4 mg /ml geles sembradas con células tratadas con Marimastat eran mucho más bajos que en los geles de siembra con las células no tratadas. La caída fue especialmente dramático para geles sembrados con células DU-145, la línea de células más invasiva. Esto sugiere que las MMP activas son un jugador importante en la determinación de cómo las células remodelar la matriz, y que el aumento de la actividad de MMP no puede llevar simplemente a contenido ECM reducida como era de esperar. Por el contrario, nuestros datos indican que las MMP en realidad puede resultar en microambientes más fibrosos. Esto sugiere que las MMP pueden afectar remodelación de la matriz a través de vías alternativas, además de sólo degradan la matriz. De hecho, las MMP se han implicado en gel contracción [31], con la inhibición de MMP que resulta en la reducción de la contracción de gel de colágeno [32]. Además, se ha demostrado que la MMP de inhibición de los resultados en la síntesis de colágeno disminuida [33], [34], que también puede explicar la reducción general de fracciones de fibrillas visto en nuestros experimentos de tratamiento marimastat.
La preferencia de los no tratados DU-145 células para entornos más ricos en colágeno es también coherente con la observación de que los tejidos se endurecen durante la progresión del cáncer [35], [36]. En este estudio se demostró que el contenido de colágeno se correlaciona bien con el módulo de cizallamiento. Por lo tanto, observamos que los ambientes modificados-DU-145, que mostraban fracciones de fibrillas promedio más altos, son más rígidos que el promedio de las matrices LNCaP-modificado. Sin embargo, no queda claro si el aumento de la rigidez es una causa del desarrollo del cáncer o es en cambio un efecto de la progresión del cáncer. Nuestros datos aquí apunta hacia este último. Este trabajo apoya la teoría predominante de la perturbación de la homeostasis tensional como una de las principales características del fenotipo maligno [35], [37]. Cabe señalar sin embargo, que en nuestro estudio, se compararon los efectos de remodelación de sólo dos líneas celulares diferentes. Mucho más trabajo que compara los efectos de remodelación de un amplio espectro de líneas celulares de cáncer es necesario ser capaz de hacer la declaración general de que más altamente invasiva cánceres prefieren microambientes de mayor densidad. También sería interesante ver si y cómo las células no cancerosas (es decir, las células madre o fibroblastos para aplicaciones de ingeniería de tejidos) demuestran diferente actividad de remodelación.
En general, nuestros resultados proporcionan una imagen cuantitativa novela de la evolución y la remodelación de la matriz dinámica y proporcionan una comparación directa de la remodelación de la matriz de dos líneas celulares de cáncer de próstata distinta. Esperamos que nuestros resultados darán lugar a nuevas líneas de investigación sobre la dinámica de la remodelación de la matriz y los experimentos futuros continuará comparando tanto cómo las propiedades estructurales y mecánicas de los geles de colágeno sembrada con células evolucionan con el tiempo el uso de tipos de células cancerosas y no cancerosas. Dicha investigación proporcionará información adicional y necesita desesperadamente en la comprensión, la administración y la metástasis lucha contra.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Dos líneas celulares de cáncer de próstata, LNCaP y DU-145 (ambos de ATCC, Manassas, VA), se estudiaron. células LNCaP se cultivaron en RPMI-1640 y DU-145 células se cultivaron en medio F12K. Ambos tipos de medios se complementaron con 10% v /v de suero bovino fetal (FBS) y 1% v /v de penicilina-estreptomicina (10.000 IU /ml de penicilina; 10.000 g /ml de estreptomicina) (todos los reactivos de cultivo de células a partir de ATCC). Las células se mantuvieron a 37 ° C, 5% de CO
2 en una incubadora. Las células se tiñeron con 5 micras CellTracker ™ Naranja CMRA (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante para las células en suspensión antes de la siembra de colágeno. Una vez sembradas en colágeno, las células se mantuvieron en medios libres de antibióticos suplementado con 10% de SFB.
Preparación de geles de colágeno
Las células se suspendieron en 3D de tipo I colágeno (BD Biosciences, San Jose, CA) a una densidad final de 200.000 células /ml. Para geles con células, la solución de matriz de colágeno consistía en LNCaP o células DU-145 se suspende en los medios de comunicación adecuados complementados con 10% v /v FBS, y un volumen igual de colágeno y la solución de neutralización (tampón HEPES 100 mM (Fisher Scientific, Pittsburgh , PA) en 2 x tampón fosfato salino (PBS), pH 7,3), como se describe anteriormente [38]. Los geles sin ningún tipo de células se prepararon de la misma manera excepto que el volumen de la suspensión de células se reemplazó con medio. la concentración final de colágeno se varió de 2, 3, y 4 mg /mL. El volumen total de cada solución de gel fue de 1 mL. La solución matriz se dejó gelificar en un plato con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, Ashland, MA) a 37 ° C y 5% de CO
2 en una incubadora durante 2 horas antes de 2 ml de 10% v /v de FBS se añadió medio -supplemented. Se reemplazó el medio cada dos o tres días. Los geles se preparan por triplicado para cada condición.
reometría
Las propiedades mecánicas de los geles de diferente contenido de colágeno (2, 3, 4 mg /ml) se evaluaron usando reometría. Brevemente, soluciones de colágeno sin células (composición como se ha descrito anteriormente) fueron gelificadas directamente en el reómetro (TA Instruments AR2000 reómetro) a 37 ° C durante 30 minutos. Inmediatamente después de la gelificación, se realizaron mediciones usando una geometría en forma de cono, oscilando desde 0,1 hasta 10 Hz en un momento de torsión de 0,1 μN * m. Se midieron tres muestras para cada condición. Un ajuste de ley de potencia se aplicó a los datos para obtener un valor para el almacenamiento a granel y módulo elástico a 10 Hz.
microscopía confocal
Para evaluar la microestructura de los geles, CRM se realizó utilizando un microscopio confocal de barrido (Olympus FV1000) con una lente de inmersión en agua NA 60 × 1.2. El colágeno en placas con fondo de vidrio se excitaron con una intensidad de 488 nm láser de baja y la luz se recogió entre 485-495 nm de luz. Las imágenes fueron adquiridas al menos 100 micras en el gel para evitar los efectos de borde. Para los geles de control que no se sembraron con células, tres 30 micras pilas con 0,5 rebanadas micras de espesor se obtuvieron de regiones seleccionadas al azar en el gel 1, 3, 5, y 7 días después de la siembra. En cada punto de tiempo, para cada gel que se sembró con células, se tomaron tres pilas en las regiones que contienen se tomaron células y tres pilas en las regiones que no contenían células (es decir, no tenían células dentro de 10 micras por encima, debajo o lateralmente). Regiones con y sin células se identificaron mediante la realización de microscopía de fluorescencia confocal (CFM) simultáneamente con CRM. Para CFM, un láser de 543 nm se utilizó con la configuración de los espectros de excitación /emisión de Alexa Fluor 546. En las regiones celulares, se obtuvo una imagen CFM de las células en paralelo la imagen CRM de la estructura de colágeno con. Los mismos ajustes del microscopio se utilizaron para cada adquisición para asegurar que los resultados fueron comparables.
Análisis de imágenes
datos
Raw CRM se analizó para obtener los parámetros estructurales de colágeno. Los mismos ajustes de procesamiento se utilizan de imagen en imagen para garantizar la coherencia. fracción de fibrillas y tamaño de poro se obtuvieron con ImageJ (NIH, Bethesda, MD). En pocas palabras, imágenes 2D de cada pila se binarizados, con fibras de colágeno indicadas por píxeles negros. Las imágenes binarizadas luego se utilizaron para calcular la fracción ocupada por colágeno, similar a lo que se ha informado anteriormente [39]. tamaño de los poros se midió mediante la elaboración de tres líneas (horizontales, verticales y diagonales, evitando las células cuando estaban presentes) a través de la imagen binarizada en el centro de cada pila, y el uso de la función de perfil plano en ImageJ. Un guión fue escrito en Matlab (The MathWorks, Natick, MA) para calcular la distancia entre las fibras de colágeno a partir de estos datos de perfil. De nuevo, esto es similar a lo que se ha realizado antes [40].
diámetro de la fibra y la longitud se determinó utilizando Imaris (Bitplane, St. Paul, MN). Una máscara de superficie rugosa se hizo inicialmente a partir de los datos de CRM en bruto, a partir de los que se generó una superficie lisa. Los objetos creados con la superficie lisa resultante representados cada uno una fibrilla de colágeno y estadísticas sobre el radio y la longitud media de cada fibrilla eran de salida.
gelatina cuantitativa zimografía
Gelatina zymography se utilizó para comparar la actividad de MMP entre las líneas de células. Tanto LNCaP y las células DU-145 se sembraron y se hicieron crecer hasta casi confluencia antes de la incubación con medio libre de suero durante 24 horas. El medio se extrae a partir de cultivos, y se concentró a través de ultracentrifugación durante 30 minutos (10 kDa de corte). Las muestras se mezclaron entonces con tampón de Laemmli de carga sin un agente reductor y se sometieron a la gelatina zimografía como se describe anteriormente [41]. Brevemente, las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida co-polimerizado con 0,1% de gelatina y se sometieron a electroforesis. Los geles se transfirieron a continuación a una solución acuosa que contiene 2,5% de Triton-X100 para renaturalizar las proteínas, seguido de equilibrado en un tampón de desarrollo (50 mM Tris, pH 7,8, NaCl 200 mM, CaCl mM 5
2, 0,02% Brij- 35) y posterior incubación a 37 ° C durante 20 horas. Los geles se tiñeron y finalmente destained con azul de Coomassie. Después de decoloración, los geles se secaron durante la noche usando un kit de secado de gel (Promega, Madison, WI). Áreas de actividad proteolítica se expresan como bandas claras contra un fondo manchado. Gel imágenes se procesaron con ImageJ y thresholded para adquirir valores de píxeles apropiados tanto para MMP-2 y MMP-9 siguieron con la normalización de las concentraciones de células originales. El experimento se realizó por triplicado.
estudios de inhibición de MMP
Las células se sembraron en geles de diferente contenido de colágeno (2, 3, y 4 mg /ml) en placas de 12 con fondo de vidrio así ( MatTek). El volumen total de cada uno de estos geles más pequeñas fue de 0,5 ml. Cada gel se trató con 50 mM Marimastat (Tocris, Ellisville, MO) en 1 ml de 10% de medios suplementados con FBS 2 horas después de la gelificación inicial y se coloca en la incubadora. A continuación, el medio se reemplazó con 100 mM Marimastat en 10% FBS medio suplementado-cada 24 horas. Los geles se prepararon por triplicado. CFM y CRM se llevó a cabo de 1 y 3 días después de la siembra. El procesamiento de imágenes se realizó como se describió anteriormente.
El análisis estadístico
Dado que ninguno de los datos estructurales CRM siguió una distribución normal según la evaluación de parcelas qq, los intervalos de confianza del 95% se construyeron usando bootstrapping de al menos 5.000 simulaciones. Se utilizó el algoritmo acelerado sesgo corregido. El análisis se realizó con Matlab. Las barras de error en todos los gráficos son intervalos de confianza del 95% a menos que se indique lo contrario.
Apoyo a la Información
Figura S1.
parámetros estructurales para geles sin células. (
Un
) y fracción de fibrillas (
B Opiniones) tamaño de poro a través del tiempo para las tres concentraciones de gel. (
C
) y diámetros de las fibras (
D
) longitudes de fibra de 2 mg /ml de colágeno en el tiempo. (
E
) y diámetros de las fibras (
F
) longitudes de las fibras en el día 7 para todas las concentraciones de gel
doi:. 10.1371 /journal.pone.0024891.s001 gratis (TIF )
figura S2.
parámetros estructurales para las regiones celulares de DU-145 células y las células LNCaP en comparación con la condición de no células en el tiempo. fracción de fibrillas de (
Un
) 2 mg /ml; (
C
) 3 mg /ml; y (
E
) 4 mg /ml. tamaño de poro de (
B Opiniones) 2 mg /ml; (
D
) 3 mg /ml; y (
F
) 4 mg /ml
doi: 10.1371. /journal.pone.0024891.s002 gratis (TIF): perfil
Reconocimientos
Los autores le gustaría reconocer la ayuda de Phil Allen, PhD, por experiencia microscopia, y Kaethe Beck, con el desarrollo de la rutina de tratamiento de imágenes Imaris. Agradecemos también a los miembros de nuestro laboratorio para perspicaces comentarios y sugerencias a lo largo de este estudio.