Extracto
Las células tumorales circulantes Electroactivos micropocillos Array (CTC), cobertizo de tumores primarios y difundido en sangre periférica, están jugando un papel importante en metástasis. Incluso después del aislamiento de los CTC de la sangre, las células diana se mezclan con una población de otros tipos de células. En este caso, se propone un nuevo método para el análisis de la mezcla de células a nivel de células individuales utilizando un dispositivo de microfluidos que contiene micropocillos electroactivos vestida. Dielectroforéticas (DEP) fuerza, inducida por los electrodos estampados en la superficie inferior de los pocillos, permite la captura eficiente y posicionamiento estable de células individuales para análisis bioquímicos de alto rendimiento. Hemos demostrado que diferentes en el chip incluidos los análisis de inmunotinción, la viabilidad de ensayo /apoptosis y la hibridación fluorescente in situ (FISH) a nivel de una sola célula podría ser llevado a cabo simplemente mediante la aplicación de reactivos específicos para cada ensayo. Nuestro método simple debería ayudar en gran medida la discriminación y el análisis de las células cancerosas raras en una población de células de la sangre
Visto:. Kobayashi M, Kim SH, Nakamura H, Kaneda S, T Fujii (2015) Los análisis célula cancerígena en el única célula nivel empleando Electroactivos microplacas de dispositivos de matriz. PLoS ONE 10 (11): e0139980. doi: 10.1371 /journal.pone.0139980
Editor: Arum Han, Texas A & amp; M University, Estados Unidos |
Recibido: 6 Septiembre, 2015; Aceptado: 18 Septiembre 2015; Publicado: 11 de noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Kobayashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos son incluidas dentro del manuscrito
Financiación:.. Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón por núcleo de Investigación para Evolutional Ciencia y Tecnología (CREST) y para el Programa Estratégico de Investigación Cooperativa Internacional (SICP)
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células tumorales circulantes (CTC), cobertizo de tumores primarios y metastásicos y fluye en la sangre, son considerados. como una causa importante de la metástasis del cáncer [1]. Contando el número de CTC en sangre periférica hace posible el seguimiento de efecto terapéutico y el pronóstico [2]. Un reto en la detección de las CTC en una muestra de sangre es que la existencia de las CTC es extremadamente rara y se mezcla con componentes de la sangre normales (1 en 10
9 células de la sangre). Los dispositivos microfluídicos son adecuados para la clasificación y análisis de células raras ya que se puede manejar de manera eficiente fluidos celulares complejas con un daño mínimo a las células en suspensión [3, 4]. Además, ya se ha demostrado la capacidad de los dispositivos de microfluidos para manejar el gran volumen de muestras de sangre entera [5]. Recientemente, varios grupos han estado desarrollando dispositivos de microfluidos para aislar CTC a partir de componentes normales de la sangre, por ejemplo, mediante el uso de microposts recubiertas de anticuerpos, dielectroforesis, separación basada en el tamaño por un microfiltro o acoustophoresis, etc. [6-11]. Aunque los métodos anteriores que utilizan dispositivos de microfluidos demostraron con éxito la separación de los CTC, las células separadas se tienen que recoger y preferiblemente ser analizada a nivel de una sola célula.
Una cuestión práctica en el análisis CTC es que las células cancerosas se mezclan con las células sanguíneas normales incluso después del aislamiento de los CTC de la sangre. Los anteriores métodos de aislamiento CTC muestran equilibrio entre la recuperación de los CTC y el agotamiento de las células blancas de la sangre (glóbulos blancos) [9-11]; la mayor tasa de recuperación de los CTC, la tasa de agotamiento más baja de glóbulos blancos. Estos resultados indican que las células cancerosas aisladas todavía se mezclan con gran número de glóbulos blancos. Por ejemplo, un método de microfluidos usando agotamiento WBC magnetoforético permite el agotamiento de 3,8-log de glóbulos blancos y un rendimiento de 97% de las células del cáncer [12]. Si una muestra de sangre original contiene células cancerosas 10 y 10
6-glóbulos blancos, una muestra purificada contiene células cancerosas y 10-156-WBC después del aislamiento con el método de agotamiento del CMB magnetoforético. Por lo tanto, después del aislamiento de las células diana a partir de sangre, la discriminación entre las células cancerosas y glóbulos blancos es muy necesario para detectar o analizar las células diana.
Immunostaning o hibridación in situ fluorescente (FISH) es método ampliamente utilizado para la discriminación de Células cancerígenas. Sin embargo, los protocolos convencionales que utilizan un tubo de ensayo o una placa de microlitro requieren gran volumen de reactivos, incluyendo anticuerpos o sondas para la hibridación. Por otra parte, centrifugaciones, requerido para el cambio de los reactivos de cada ensayo, posiblemente causan pérdida crítica de las muestras originales, o daños en la viabilidad celular así como la función celular debido a las fuertes fuerzas centrífugas que actúan sobre una célula [13-15]. Un método sencillo y eficaz para ensayo bioquímico tanto, es altamente deseable disminuir los posibles riesgos de los métodos convencionales.
A continuación, se propone un nuevo método para el chip de células de cáncer solo análisis usando matriz de micropocillos electroactivos (EMA) dispositivo. El EMA contiene modelado electrodos de película fina en la parte inferior de cada pocillo para una sola célula atrapando con dielectroforesis (DEP) [16, 17]. Desde DEP vigente prevé la captura rápida, activa y estable, podríamos eficiente atrapar las células cancerosas en suspensión en solución de la muestra. células atrapadas pueden mantenerse de forma estable en un chip de DEP, lo que permite un rápido intercambio de reactivos con un volumen de muestra extremadamente pequeña. Por lo tanto, de alto rendimiento ensayos bioquímicos de las células individuales vistió son facilitadas. Hemos demostrado la viabilidad de nuestros enfoques con una mezcla de diferentes tipos de células mediante la realización de tres tipos de ensayos; la discriminación de células de cáncer por inmunotinción, la viabilidad de ensayo /apoptosis y fluorescente en análisis de hibridación in situ (FISH). Todo el proceso para los ensayos requiere sólo la inyección secuencial de suspensión de células y los reactivos para los análisis sin sistemas de válvulas o tubos complicados. Esperamos que nuestro método simple facilita alto rendimiento y una sola célula paralelo analiza, al tiempo que elimina las manipulaciones celulares adicionales fuera del dispositivo.
Electroactivos micropocillos matriz
diseño em
El dispositivo consta de un canal microfluídico hecho de polidimetilsiloxano (PDMS), y un sustrato de vidrio que contiene un gran número de micropocillos fabricados en electrodos de óxido de indio y estaño interdigitados (ITO) (Fig 1A). La distancia entre los electrodos es de aproximadamente 6 micras y el diámetro de los pocillos es 30 m, que es más grande que el diámetro de las células diana (20 m). Y la altura de la estructura de micropocillos, que estaba hecha de resina epoxi, es de 25 micras. Los micropocillos están alineados con los electrodos ITO interdigitados con el fin de localizar un par de electrodos (ánodo y cátodo) en cada uno de los pocillos. Un dispositivo contiene 3168 pocillos. campo eléctrico aplicado es muy localizada en el interior de cada pocillo, ya que los electrodos interdigitados se encuentran en la parte inferior de los micropocillos. Figura 1B muestra el procedimiento de análisis de células individuales. En primer lugar, se introducen las células en el microcanal y atrapados en los pocillos utilizando DEP positiva inducida por el voltaje aplicado a los electrodos alterna. A continuación, los reactivos para los análisis se introducen en el canal fluídico. La figura 1C muestra la imagen de las células atrapadas en las cúpulas.
(a) Configuración del dispositivo y las dimensiones del pocillo y los electrodos interdigitados. (B) la captura de la célula y el reactivo de intercambio para el análisis de una sola célula. La suspensión celular se introduce en el canal microfluídico en el dispositivo y las células se encuentran atrapados en los pocillos por DEP positivo. Después de la captura de células, los análisis de las células atrapadas se llevan a cabo mediante la introducción de reactivos necesarios en el microcanal. (C) Imagen de las células DU145 atrapadas (indicado por flechas) en los pocillos.
Fabricación
La figura 2 muestra el proceso de fabricación del presente dispositivo. La forma de los electrodos se modeló usando resina fotosensible (AZP1350, AZ Electronic Materials) sobre un sustrato de vidrio revestido de ITO (TOA tecnologías ópticas, LTD.), Seguido por ataque químico de ITO por 0,2 M FeCl solución
3 + M HCl 6 para 30 min a temperatura ambiente. Después de eso, el sustrato se limpió y se enjuagó para eliminar la resina fotosensible AZP1350 restante en el ITO. La matriz de micro pozos se fabrica con resina fotosensible (KMPR1005, NIPPON KAYAKU CO.) En la parte superior de los electrodos estampados. El fotorresistente se aplicó por rotación sobre los electrodos, y un cromo foto-máscara modelada para la matriz de micropocillos se alineó con los electrodos ITO estampadas. El fotoprotector se expone a la luz ultravioleta a través de la foto-máscara, seguido por el desarrollo y el enjuague.
(a) matriz de microplacas. Los electrodos interdigitados se fabrican mediante un proceso de modelado convencional de ITO y micropocillos hechas de KMPR están alineados con el electrodo. (B) PDMS chip de fluidos. El chip fluídico se fabrica mediante el proceso de soft-litografía. (C) Completado dispositivo de microfluidos hecha por unión de dos partes juntas.
Los PDMS chip de fluido se fabrica por el proceso de moldeo réplica estándar como se muestra en la figura 2B. Fotorresistente (SU-8 2100, MicroChem Co.), que sirve como un molde, fue modelada sobre una oblea de silicio. El molde se limpia a fondo con isopropanol y agua desionizada. PDMS (. Silpot 184, Dow Corning Toray, CO Ltd.) se mezclaron con agente de curado (10: 1 relación de masa) y se vierte sobre el molde. A continuación, el PDMS se calentó a 75 ° C durante 1 hora seguido por despegando de las PDMS polimerizadas del molde. Agujeros como puertos de acceso al canal de flujo se perforaron.
Con el fin de unir la matriz de micro pozos y PDMS chip de fluidos, que fueron expuestos a O
2 de plasma para activar las superficies utilizando la máquina de grabado por iones reactivos opuestas ( RIE-10NR, Samco CO.). También O
2 de tratamiento de plasma hace que los pocillos KMPR y el canal hidrofílico PDMS, lo que garantiza fácil inyección de reactivos acuosos en el canal y los pocillos.
Cell reventado El uso de la fuerza DEP
este estudio, las células introducidas en el microcanal se encuentran atrapados activamente en microplacas equipado con electrodos interdigitados por la fuerza DEP. DEP es un fenómeno en el que las partículas neutras se mueven cuando se aplica a campo eléctrico no uniforme. La fuerza DEP promediada en el tiempo se puede aproximar en términos de efectos como dipolo (1) donde
ε
m
es permisividad absoluta del medio,
r
es el radio de la partícula, Re (
f
CM) es la parte real del factor de Clausius-Mossotti (
f
CM) en relación con el momento dipolar inducido y e es el valor RMS del campo eléctrico aplicado. El
f
CM es (2) (3) (4) donde
ε
p
es permisividad absoluta del medio. La partícula se mueve a un máximo del campo (DEP positivo) o un mínimo de campo (DEP negativo) dependiendo de la Re (
f
CM), que representa la diferencia entre las propiedades dieléctricas de la partícula y de su medio de suspensión (Fig 3) [18-20]. Re (
f
CM) se puede controlar mediante el ajuste de la conductividad del medio de suspensión y la frecuencia de campo eléctrico aplicado. Por lo tanto las células se encuentran atrapados en micropocillos por DEP positiva en el caso del dispositivo EMA [16].
partículas son atraídas a los electrodos debido a la fuerza DEP positivo y repelidos de los electrodos debido a la fuerza DEP negativo .
Materiales y Métodos
Preparación de muestras
células U937 (monocitos leucémica línea celular de linfoma, obtenidos del Centro de recursos Bio RIKEN, Japón), células DU145 ( línea celular de cáncer de próstata, obtenido del Centro RIKEN Bio recursos, Japón) y células PC3 (línea celular de cáncer de próstata, obtenido del Centro de recursos RIKEN Bio, Japón) se cultivaron en un incubador humidificado (37 ° C en una atmósfera de 5% CO
2). El medio de cultivo para todas las células era RPMI 1640 (Invitrogen Corp.) suplementado con suero bovino fetal (10%, Gemini Bio-productos) y solución de penicilina-estreptomicina (1%, Sigma Chemical Co). El diámetro medio de las células U937, las células DU145 y PC3 células era 10 micras, 20 micras y 22 micras, respectivamente. Las células se dispersan en un tampón DEP (mM HEPES 10, CaCl 0,01 mM
2, 59 mM D-glucosa y sacarosa 236 mM; pH7.35) para ajustar la conductividad del medio de suspensión de células (21,4 mSm
-1) para DEP positivo [21]. El tampón DEP contenía albúmina de suero bovino (1% peso /vol) para bloquear la adhesión celular no específica. Las células en el medio de cultivo se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min. Hemos eliminado suavemente el medio de cultivo y añadió tampón DEP.
Configuración Experimental
El dispositivo de microfluidos se montó en la etapa de traslación x-y situado en microscopio invertido (IX71, Olympus). Las células fueron monitorizados con una cámara (DP73, OLYMPUS), que fue instalado en el microscopio. El potencial eléctrico de DEP se aplica a los electrodos ITO intercalados con el generador de funciones (WF1974; NF Corp.) a través de un amplificador. (HSA4101; NF Corp.): perfil
La inmunotinción
Atrapado en células micropocillos se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) durante 10 minutos y se lavaron con PBS durante 5 minutos. Posteriormente, se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 5 minutos y se lavaron con PBS durante 5 minutos. Las células se inmunotiñeron con Hoechst33342 (DOJINDO) para el contenido de DNA, conjugados con FITC anticuerpos anti-citoqueratina (BD) para células epiteliales y anticuerpos conjugados PE anti-CD45 (Life Technology) para células de leucocitos durante 30 minutos. Finalmente se enjuagaron las células con PBS durante 10 minutos. Los procesos enteros se llevaron a cabo a un caudal de 3 min l
-1.
Viabilidad y Apoptosis Ensayo
células atrapadas fueron expuestos a Anexina V Alexa Fluor 488 (Invitrogen) en la sala de temperatura de la habitación oscura durante 30 minutos, seguido por el intercambio de los reactivos en los reactivos mezclados de tampón de unión Anexina (Invitrogen), yoduro de propidio (Invitrogen) y azul de calceína (Invitrogen) durante 10 minutos. Todo el proceso se realizó a una velocidad de flujo de 3 min l
-1.
hibridación in situ fluorescente (FISH)
HFIS se realizó en las células atrapadas en los pocillos de acuerdo con el protocolo estándar con las siguientes modificaciones. Brevemente, las células atrapadas se fijaron con solución de Carnoy. El dispositivo se lavó con 2 x tampón de Saline-citrato de sodio (SSC, Abbott), se deshidrataron en una serie ascendente de alcohol, y se seca al aire. Se añadió la mezcla de sondas (5'BCL-6 sonda marcada en rojo y la sonda 3'BCL-6 marcada en verde) para la hibridación. ADN se desnaturalizó a 73 ° C durante 5 min y después se hibridó a 37 ° C durante 16 horas en el termociclador (Beckman Coulter). Después de la incubación con 0,4 x SSC /0,3% Nonidet P-40 (NP-40) a 73 ° C, el dispositivo fue transferido a 2 x SSC /0,1% NP-40 a temperatura ambiente, que estaba en el cuarto oscuro se secó al aire . Los ADN se counterstained con DAPI (DOJINDO), sellado con cubierta de vidrio.
Resultados y Discusión
Viabilidad del dispositivo para On-Chip Inmunoticción
La viabilidad del presente dispositivo para el análisis de células de cáncer único en el chip se demostró mediante la realización de inmunotinción después de atrapar una mezcla de dos líneas celulares diferentes, incluyendo células U937 (un modelo de glóbulo blanco) y células DU145 (una línea celular de cáncer). La suspensión celular se introduce en el dispositivo con una velocidad de flujo de 3 l min
-1. Para el DEP positivo, 10 Vp-p y el potencial eléctrico sinusoidal a 8 MHz, se aplica a los electrodos de ITO interdigitados. Después de la captura de células con DEP, se llevó a cabo la inmunotinción para identificar las células atrapadas. Se fijaron las células atrapadas, permeabilizaron y se tiñeron mediante inyección secuencial de los reactivos en el dispositivo a través del puerto de acceso. Las células se tiñeron con Hoechst33342 (azul) los ADN de la tinción, conjugados con FITC anticuerpos anti-citoqueratina (verde) para las células epiteliales y los anticuerpos anti-CD45 conjugados R-PE (rojo) para las células de leucocitos (Fig 4). células citoqueratina-positivas fueron consideradas como una célula de cáncer, mientras que las células CD45-positivas fueron consideradas como WBC. La figura 4 muestra atrapado 11 células (en 10 pozos, incluyendo 1 bien con 2 células atrapadas en la parte superior izquierda), 3 células teñidas con el anticuerpo anti-CK (verde) que corresponden a células de cáncer y 8 células teñidas con anti-CD45 anticuerpo (rojo) que corresponde al CMB. De esta manera, la identificación de las células cancerosas y CMB sólo puede hacerse mediante inyección secuencial de reactivos necesarios en el dispositivo sin sistema de válvulas complejo o equipo adicional
.
células DU145 Atrapado y células U937 teñidas con Hoechst33342 (azul), El anticuerpo anti-citoqueratina (verde) y anticuerpo anti-CD45 (rojo). imagen fusionada identifica células DU145 como modelo de CTC (azul + verde).
La captura rendimiento en las diferentes líneas celulares se investigó mediante el recuento del número de células atrapadas en los pocillos después de immunostaning. La figura 5A muestra el patrón de captura de cada uno de los tipos de células, donde la imagen representa a toda la matriz en el dispositivo y cada píxel representa cada micropocillo. células DU145 tienden a ser atrapado en la corriente arriba de la matriz de micropocillos mientras que las células U937 distribuidos al azar en la matriz de micropocillos. La razón sería que el diámetro mayor de células DU145 que la de las células U937, la generación de mayor fuerza DEP como se muestra en la ecuación (1). Puesto que la fuerza inducida por DEP es proporcional a la cúbico de radio de la célula, célula DU145 recibe una fuerza más grande que las células U937. El número total de células DU145 atrapados y células U937 fueron 763 y 801, respectivamente. 39% de las células introducidas quedaron atrapados en los pocillos, y el 33% de los pocillos fueron ocupados por una sola célula. Puesto que la presente micropocillos electroactivos fueron diseñados para atrapar eficazmente sola célula DU145, cuyo diámetro es más grande que la de las células U937, el dispositivo muestra un buen rendimiento con sencillo en el atrapamiento de células DU145, donde 728-pozos fueron ocupados por las células DU145 individuales (598 pozos eran ocupada por las células DU145 individuales, y 130 pozos fueron ocupados por las células DU145 individuales y las células U937 individuales). Sólo 15 pozos fueron ocupadas por dos o tres células DU145. Sin embargo, múltiples células U937 pueden ser atrapados fácilmente en un mismo micropocillo desde células U937 (11 micras de diámetro) es menor que la de las células DU145
.
imagen de píxeles de micropocillos en el dispositivo (a). Cada píxel corresponde a cada pocillo en el dispositivo y (b) Distribución del contenido de las células atrapadas en microplaca. Colores muestran contenidos de células atrapadas en microplaca.
Viabilidad y Ensayo de apóptosis
Hemos investigado la viabilidad de las células cancerosas atrapadas para detectar y analizar selectivamente CTC viables que podrían estar involucrados en la metástasis. Dado que casi todas las células cancerosas en la sangre son matados por células citotóxicas tales como células T, etc., y muertos debido a los anoikis o el daño causado por la tensión de cizallamiento [22], es muy necesario para identificar las células cancerosas viables entre una población de células para su posterior análisis. Para comprobar la viabilidad de las células cancerosas, las células DU145 estaban atrapados en los pocillos y se cultivaron en el dispositivo mediante la introducción de medio de cultivo. Después de 6 horas, las células atrapadas se tiñeron con calceína (azul) para células viables, la anexina V (verde) para las células de la apoptosis o la PI (rojo) para las células muertas. Casi todas las células atrapadas (85%) emiten fluorescencia azul, lo que indica que las células son viables incluso después de 6 horas de incubación en el dispositivo (Fig 6).
Anexina V (verde) tiñe las células apoptóticas, PI (rojo) tiñe las células muertas y calceína (azul) tiñe las células viables. imagen fusionada a identificar tanto las células apoptóticas y muerta (verde + rojo). Imágenes de células atrapadas en los pocillos después de 6 horas de incubación.
hibridación in situ fluorescente (FISH)
Hemos llevado a cabo FISH en el chip de la EMA para localizar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas ya que las células cancerosas a menudo inducen reordenamiento cromosómico para la resistencia a los medicamentos. Para la demostración de células B Lymphoma6 (BCL6; gen para la inhibición de la apoptosis [23]) reordenamiento del gen se evaluó para las células PC3 cultivadas mediante FISH en el chip. El FISH-negativa muestra las proximidades de los puntos rojos (parte aguas arriba del gen BCL6) y los puntos verdes (parte aguas abajo del gen BCL6). Mientras que muestra FISH-positivos sonda de ruptura, aparte de dos colores. Fig 7 muestra el resultado del ensayo FISH para una célula PC3 en la matriz de micropocillos. La translocación del gen de apoptosis en células PC3 con éxito se puede comprobar por FISH-chip en, y el cromosoma 3q27 de la célula no causa la translocación porque manchas rojas y verdes aparecen en la misma ubicación.
Las flechas indican la señal de BCL6 sonda. señal verde muestra parte aguas abajo del gen BCL6 y la señal roja muestra parte aguas arriba del gen BCL6. Combinar la imagen muestra la señal de color amarillo debido a las señales rojas y verdes están en la misma ubicación. Esto significa 3q27 del cromosoma no causa la translocación.
Conclusiones
En este estudio, hemos propuesto un nuevo método para la célula cancerosa sola análisis utilizando el dispositivo EMA. El dispositivo nos permitió llevar a cabo la captura de una sola célula eficiente y tres tipos de ensayos bioquímicos; inmunotinción, la viabilidad de ensayo /apoptosis y FISH a nivel de una sola célula. Dado que las células individuales podrían ser atrapados de manera estable a cabo dentro de los pocillos, se llevó a cabo todo el proceso de los ensayos mediante la inyección de reactivos secuencialmente y sin sistemas de válvulas o tubos complicados. Nuestra sencilla dispositivo EMA combinado con ensayos analíticos altamente sensibles promete de alto rendimiento y análisis paralelizados de células cancerosas raras en una población de otros tipos de células. También se puede aplicar esta técnica a la detección de un fármaco candidato para el tratamiento del tumor mediante el control de la respuesta de las células diana a través de on-chip ensayos.