Extracto
Antecedentes
El cáncer gástrico sigue siendo uno de los cánceres más mortales en el mundo y por lo tanto la identificación de nuevos fármacos dirigidos a este tipo de cáncer es tanto una importancia significativa. El propósito de este estudio fue identificar y validar un agente terapéutico que podría mejorar los resultados para los pacientes con cáncer gástrico en el futuro.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de la tecnología de microarrays, hemos generado un gen perfil de expresión de genes específicos de cáncer gástrico humano a partir de muestras de tejido de cáncer gástrico humano. Se utilizó este perfil en el análisis de conectividad Mapa del Broad Institute para identificar compuestos terapéuticos candidatos para el cáncer gástrico. Encontramos el vorinostat inhibidor de la histona desacetilasa como el compuesto de plomo y por lo tanto un fármaco terapéutico potencial para el cáncer gástrico. Vorinostat induce tanto la apoptosis y la autofagia en las líneas celulares de cáncer gástrico. La inhibición farmacológica y genética de la autofagia sin embargo, el aumento de la eficacia terapéutica de vorinostat, lo que indica que una combinación de vorinostat con inhibidores de la autofagia puede terapéuticamente más beneficioso. Por otra parte, el análisis de la expresión génica del cáncer gástrico identificado un conjunto de genes (
ITGB5, TYMS, MYB, APOC1, cbx5, PLA2G2A, España y
KIF20A
) cuya expresión fue elevado en el tejido tumoral gástrico y downregulated más de 2 veces por tratamiento vorinostat en líneas celulares de cáncer gástrico. Por el contrario,
SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1, España y
NQO1
manifiesta un patrón invertido.
Conclusiones /Importancia
Hemos demostrado que el análisis de gen firma la expresión puede representar un nuevo enfoque para descubrir agentes terapéuticos para el cáncer gástrico, como vorinostat. La observación de la expresión de genes alterados después del tratamiento vorinostat puede proporcionar la clave para identificar el mecanismo molecular de vorinostat y aquellos pacientes susceptibles de beneficiarse de un tratamiento vorinostat
Visto:. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Parque YY, Kim K, Kim SB, et al. Análisis (2011) Expresión Génica Firma Identifica vorinostat como una terapia candidato para el cáncer gástrico. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10.1371 /journal.pone.0024662
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Marzo, 2011; Aceptado: August 16, 2011; Publicado: 9 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Claerhout et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación para SC como un compañero Odyssey fue apoyada por el Programa de Odyssey y el Theodore N. Ley de Dotación para el Logro Científico de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center. Este trabajo también fue apoyado por fondos del Fondo de Investigación 2009 de Medicina Interna Académico y Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (Nº 2010-0.024.248). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en el mundo [1], con una supervivencia global de 10 meses [2] - [4]. Tratamiento para el cáncer gástrico puede incluir quimioterapia, cirugía y terapia de radiación. Desafortunadamente, los tratamientos basados en quimioterapia actuales para el cáncer gástrico avanzado demuestran resultados decepcionantes [2] - [4]. De hecho, remisiones completas son raras o sólo duran muy poco.
Varios agentes dirigidos que confieren ventajas de supervivencia en otros tipos de cáncer han sido objeto de investigación en el cáncer gástrico. Mientras que algunos estudios clínicos tempranos usando receptor de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGFR) y epitelial del receptor del factor de crecimiento (EGFR) -1 inhibidores, como cetuximab y bevacizumab, han mostrado un poco la actividad, rara vez hay un beneficio real de supervivencia para los pacientes [5] , [6]. Una de las razones puede ser que estos estudios no seleccionaron los pacientes de acuerdo a la presencia de biomarcadores. Recientemente, el trastuzumab para el juicio Cáncer gástrico (TOGA) observó que la adición de trastuzumab a la quimioterapia condujo a una mejora estadísticamente significativa en la supervivencia libre de progresión (SLP) y supervivencia global (OS) de aproximadamente el 20% de los pacientes con diseminada gástrico y tumores de la unión gastroesofágica (GE) que sobreexpresan HER2 [7]. Esto pone de relieve la necesidad de una terapia biológica específica y la búsqueda de biomarcadores para seleccionar a los pacientes para los ensayos clínicos que se pueden beneficiar de supervivencia. A pesar de cierta evidencia de objetivos potenciales, incluyendo HER2 [8], [9], la eficacia de estas terapias biológicamente dirigidas no se conoce y hay una falta de una terapia dirigida estándar para el cáncer gástrico. Debido a la heterogeneidad biológica de los cánceres gástricos, es poco probable que exista una única cura 'bala mágica'. Los marcadores moleculares serán por lo tanto importante en el futuro para predecir los resultados de los pacientes y los tratamientos de costura de acuerdo con la biología individual.
En la búsqueda de biomarcadores, análisis de la expresión génica firma se ha utilizado en diversas aplicaciones, como por aclarar la mecanismos de vías biológicas [10], la clasificación de los subtipos de una enfermedad [11], que predicen el pronóstico del cáncer [12] y de perfiles de expresión génica en respuesta a determinados fármacos [13], [14]. Gen análisis de firmas de expresión se puede hacer mediante el uso del Broad Institute Mapa de Conectividad (http://www.broadinstitute.org/cmap). El Mapa de Conectividad tiene como objetivo generar un mapa que une los patrones de expresión de genes asociados con la enfermedad a los patrones correspondientes producidas por fármacos candidatos y manipulaciones genéticas [15], [16]. Este enfoque permite a los sistemas compuestos de firmas para impedir la entrada de la enfermedad en todo el genoma, en lugar de un conjunto preseleccionado de los genes diana. Los fármacos se combinan con enfermedades utilizando métodos de comparación de patrones sofisticados con un alto nivel de resolución y especificidad. A pesar de que deja muchas preguntas abiertas, el Mapa de Conectividad ha demostrado que el análisis firma genómica puede ser utilizado para reconocer los fármacos con mecanismos de acción comunes, descubrir los mecanismos de acción desconocido e identificar potenciales nuevas terapias [15], [16].
el propósito de este estudio fue identificar potenciales nuevas terapias para el tratamiento del cáncer gástrico. Para ello, se analizaron en primer lugar la firma genómica del cáncer gástrico humano. A continuación se utilizó el gen del cáncer gástrico firma resultante
in silico
mediante el empleo de análisis Mapa de Conectividad para identificar agentes terapéuticos que podrían ser eficaces contra este tipo de cáncer. Hemos validado aún más la parte superior de dirección de fármaco por su eficacia en líneas celulares de cáncer gástrico. Se encontró que el vorinostat, como un nuevo fármaco potencial, tanto la apoptosis y la autofagia inducida en células de cáncer gástrico. En conjunto, este estudio demuestra que el análisis de la conectividad del mapa puede ser utilizado para la identificación de agentes terapéuticos que pueden tener éxito en el tratamiento de un subconjunto de los cánceres gástricos.
Métodos
Análisis de datos de microarrays
Para el análisis Mapa de Conectividad, se utilizaron los datos de microarrays de 65 pacientes con cáncer gástrico, incluyendo 65 tipos de cáncer y 19 tejidos gástricos normales, que se obtiene a partir de nuestro trabajo anterior, los datos de Yonsei [17]. las muestras de tumor se obtuvieron de pacientes con cáncer gástrico sometidos a gastrectomía como un tratamiento primario. Las muestras de tejido fueron examinados por los patólogos en el momento de la recogida y se almacenan en -80 ° C en el banco de tejidos hasta el inicio del experimento. ARN total fue extraído de los tejidos recién congelados mediante el uso de un kit de marcaje de aislamiento de ARN mirVana (Ambion, Inc.). microarrays de datos primario está disponible en la expresión de genes de Omnibus NCBI base de datos pública (plataforma de microarrays, GPL6884; datos de microarrays, GSE 13861). Otro perfil de expresión génica se obtuvo a partir de 69 muestras de tejido gástrico, incluyendo 38 y 31 de cáncer de estroma no cáncer, de la base de datos de Stanford Microarray (http://smd.stanford.edu, GSE13911), los datos de Stanford. gástricos genes específicos de cáncer fueron seleccionados por BRB-ArrayTools versión 3.6.1 (Sección de Investigación Biométrica, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD). Comparación de clase utilizando dos muestras t-test (significancia & lt; 0,001, 10,000 permutación aleatoria) identificó genes específicos de cáncer gástrico y genes cuya expresión significa intensidades fueron alterados por al menos dos veces en comparación a significar la expresión génica del tejido normal fueron seleccionados
.
Mapa de Conectividad análisis
Para identificar posibles fármacos dirigidos cáncer gástrico, las listas de genes de la parte superior 500 hasta la parte superior regulados y 500 genes regulados hacia abajo de los genes específicos de cáncer gástrico fueron utilizados (Tabla S1). El análisis Mapa de Conectividad se llevó a cabo a través de la interfaz web (http://www.broadinstitute.org/cmap) utilizando la versión, construir 02, que contiene más de 7.000 perfiles de expresión que representan 1.309 efectos de los compuestos sobre varios cultivos de células humanas [15], [dieciséis]. El mapa de conectividad muestra las conexiones funcionales entre las drogas, los genes y las enfermedades. Los fármacos que producen firmas de genes que imitan la enfermedad pueden ayudar a identificar las vías que representan potenciales dianas terapéuticas para esta enfermedad. Por el contrario, los fármacos que inducen una firma «inversa», es decir, cambios en la expresión génica en una dirección opuesta a la observada en el estado de la enfermedad, pueden representar nuevos agentes terapéuticos. Los agentes candidatos contra una enfermedad específica pueden ser reconocidos por la aplicación específica de la enfermedad perfil de expresión génica para el análisis de conectividad Map. Se seleccionaron los fármacos candidatos para la validación
in vitro
sobre la base de la puntuación de la conectividad, la correlación, y P-valor.
Química y cultivo de células
El vorinostat se obtuvo de Merck y preparado como una solución madre en dimetilsulfóxido (DMSO). La cloroquina y la bafilomicina A1 (Sigma) se disolvieron en agua respectivamente y DMSO. líneas celulares de cáncer gástrico humano AGS, NCI-N87, y KATO-III se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se mantuvieron de acuerdo a sus recomendaciones. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U de penicilina, y 100 mg de estreptomicina /ml a 37 ° C en 5% de CO
2.
El crecimiento celular, la viabilidad y del ciclo celular ensayos
Para el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil ensayo de tetrazolio bromuro (MTT), MTT se disolvieron en PBS a 5 mg /ml. Acerca de 5 × 10
3 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contenía las concentraciones indicadas de vorinostat o DMSO. Después de 72 h, se añadieron 20 l de solución de MTT y las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Después de la incubación, se añadieron 100 l de DMSO para disolver el formazan, y la absorbancia se leyó a 570 nm usando un lector espectrofotométrico de microplacas (lector de microplacas cinético Vmax, Molecular Devices). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Para la tinción de cristal violeta, las células se trataron durante 12 h, se retiró el medio, y las células se lavaron con PBS y después se incubaron durante 30 min con 0,5% de cristal violeta (en 20% de metanol y 80% de agua bidestilada). Después, las células se lavaron tres veces con PBS. El violeta cristal restante se extrajo en ácido acético durante 5 min, y la absorbancia se midió a 595 nm usando un lector de microplacas espectrofotométrico.
Para determinar la viabilidad celular, las células se incubaron con vorinostat para 72 h. Las células adherentes fueron luego separados de placas de cultivo por tripsinización y se combinan con las células flotantes, se centrifugaron y se suspendieron en 500 l de yoduro de propidio (PI) de solución -EXCLUSIVO (no penetrantes de células de membrana) durante 15 min a 4 ° C. Las células teñidas se controlaron mediante citometría de flujo (Beckman Coulter Cytomics FC 500)
.
Para el análisis del ciclo celular, las células se incubaron con vorinostat durante 24 h, se recogen y se suspenden en 500 l de solución hipotónica (citrato de sodio 0,1%, 0,1% de Triton X-100, 100 g /ml de RNasa y 50 mg /ml PI) durante 15 min a 4 ° C. células PI-manchado fueron controlados por citometría de flujo. ciclo celular se analizó mediante el software multiciclo AV.
aislamiento de ARN y de microarrays experimentos
El aislamiento de ARN y los experimentos de microarrays se realizaron de acuerdo con el protocolo que se describió anteriormente [17]. ARN total fue extraído a partir de líneas celulares de cáncer gástrico con o sin tratamiento vorinostat utilizando un kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion, TX, EE.UU.). Se determinó la integridad de la fracción de ARN grande con un Bioanalyzer Experion (Bio-Rad, CA, EE.UU.) como un sustituto para el control de calidad de ARNm. El ARN total se marcó y se hibridó con HT12 humano BeadChips expresión v.3 acuerdo con los protocolos del fabricante (Illumina, CA, EE.UU.). Después de los BeadChips fueron escaneados con un lector de BeadArray Illumina, los datos de microarrays se normalizaron usando el método de normalización cuantil en los modelos lineales para el paquete de datos de microarrays en el entorno de lenguaje R [18]. El nivel de expresión de cada gen se transformó en un registro
2 base antes de su posterior análisis. El análisis de agrupamiento se realizó con Cluster y Treeview [19].
Western blot
Las células se raspó en medio y se centrifugan, y las proteínas se aislaron utilizando tampón de lisis (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, EGTA 1 mM y 10 mM de pirofosfato de sodio (pH 7,4)) que contiene mM NaF 100, 10% de glicerol, MgCl 1,5 mM
2, 1% de Triton X-100 y el inhibidor de la proteasa (Roche). Los extractos se incubaron en hielo durante 20 min y se centrifugaron a 20.800 g durante 20 min. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de ensayo de proteína BCA (Pierce). Cantidades iguales de proteína de cada muestra se separaron por electroforesis a través de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana Hybond-C de Super (Amersham Pharmacia Biotech). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente en solución salina tamponada con Tris que contenía leche en polvo 0,1% de Tween-20 y 5% sin grasa. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario diluido en leche en polvo desnatada al 5% o 5% de BSA en 1 x solución salina más un 0,1% de Tween-20 Tris-tamponada. Se han usado anticuerpos frente a LC3 (Novus Biologicals), activa la caspasa-3 (Epitomics) y p62 (BD Biosciences). Los anticuerpos de alfa-tubulina y beclin-1 eran de tecnología de señalización celular; anticuerpo de beta-actina fue de Sigma. a continuación, las membranas se lavaron y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Cell Signaling Technology). Las bandas de proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada como se describe por el fabricante (GE Healthcare).
siRNA transfección
La secuencia diana de ARNip beclin-1, nontargeting siRNA (Risc libre) y Dharmafect 1 eran comprado de Dharmacon. Las células se sembraron en placas de 10 cm y se transfectaron con ARNsi 24 h más tarde de acuerdo con el protocolo del fabricante. El día siguiente, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de 6 cm o de 96 pocillos para obtener la misma eficacia de transfección. los niveles de expresión de proteína se determinaron por análisis de transferencia Western.
Transmisión microscopía electrónica
Las muestras se fijaron con una solución que contiene 3% de glutaraldehído, más 2% de paraformaldehído en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 hora. Después de la fijación, las muestras se lavaron y se trataron con 0,1% de cacodilato filtrada Millipore tamponada ácido tánico, se fijaron posteriormente con 1% de tetróxido de osmio tamponada durante 30 min, y se tiñeron en bloque con acetato de uranilo filtrada Millipore 1%. Las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se infiltró, y se embebieron en medio LX-112. Las muestras se polimerizan en un horno de 70 ° C durante 2 días. Ultrathin secciones fueron cortadas en un microtomo Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo en un centro de tinción Leica EM, y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEM 1010 (JEOL, EE.UU., Inc., Peabody, MA ) a un voltaje de aceleración de 80 kV. Las imágenes digitales se obtuvieron utilizando Imaging System (AMT Microscopía Avanzada Técnicas Corp, Danvers, MA).
Resultados
expresión genética del cáncer gástrico
La Tabla 1 representa las características de los pacientes a partir de datos Yonsei [17]. Los cánceres gástricos se encuentran principalmente en el estómago distal y estadio III /IV. Utilizando los datos de microarrays de expresión génica de los pacientes, encontramos 3.360 genes específicos de tumores cuya expresión significa intensidades fueron alterados por al menos dos veces en comparación a significar la expresión génica del tejido normal (
P Hotel & lt; 0,001, Figura S1 ). Se utilizó este conjunto de 3.360 genes (es decir, la firma específica del cáncer gástrico) para más
in silico
detección de potenciales fármacos terapéuticos para el cáncer gástrico.
Conectividad análisis mapa identifica posibles fármacos focalización cáncer gástrico
Para identificar posibles fármacos focalización cáncer gástrico, el cáncer gástrico firma específica se utiliza como consulta de entrada al Mapa de Conectividad como se describe en la sección "Método". En especial, buscamos compuestos que tenían una firma inversamente correlacionada con la firma específica del cáncer gástrico y se identificaron varios medicamentos que se resumen en la Tabla 2. Se establece la clasificación de los agentes candidatos basado en el valor de correlación inversa y el valor p. Tabla 2 (columnas 2-4) muestra los compuestos de más alto rango de datos de Yonsei. El análisis reveló que la conectividad Mapa de la histona deacetilasa (HDAC), incluyendo inhibidores de vorinostat y tricostatina A representan los posibles candidatos para la orientación del cáncer gástrico. El LY294002 inhibidor de fosfatidilinositol-3-quinasa, la trifluoperazina fenotiazina y el choque de calor tanespimycin inhibidor de la proteína también se identificaron como agentes candidatos objetivo para el cáncer gástrico. A continuación, validamos nuestros resultados mediante el uso de un conjunto independiente de datos de perfiles de expresión génica de Stanford Microarray Base de datos (Tabla 2; datos de Stanford, columnas 5-7). Conectividad análisis Mapa de este conjunto de datos confirmó vorinostat como el candidato mejor clasificado. En conclusión, el análisis de conectividad Mapa identificó vorinostat como un potencial agente terapéutico para el cáncer gástrico.
El vorinostat muestra eficacia terapéutica
in vitro Hoteles en líneas celulares de cáncer gástrico
Para evaluar la eficacia terapéutica de vorinostat, se evaluó el crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico establecidos (AGS, KATO-III, y NCI-N87) después de 72 h de tratamiento vorinostat utilizando el ensayo de MTT. En comparación con las células no tratadas, vorinostat inhibió significativamente la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis en todas las líneas celulares de cáncer gástrico (Figura 1A). Se confirmó la reducción de la viabilidad celular mediante análisis del ciclo celular de células de cáncer de AGS y KATO-III. Hemos demostrado que el tratamiento con vorinostat (5 M) durante 24 h indujo un marcado aumento en la proporción sub-G1 de las células AGS comparación con el control (2,3 ± 0,07% vs 39,2 ± 0,99%, respectivamente;
P & lt
; 0,01), lo que indica la inducción de la muerte celular (Figura 1B). Por el contrario, la proporción sub-G1 de vorinostat células tratadas KATO-III no se vio afectada (Figura 1B), mientras que la proporción de células G2 /M aumentó significativamente (21,4 ± 1,91% vs. 29,3 ± 0,35%;
P
= 0,044), indicativo de la detención del ciclo celular. Además, la prueba de viabilidad celular utilizando PI-exclusión. Se han tratado AGS y células KATO-III con 5 M vorinostat durante 72 h y les evaluó mediante citometría de flujo (Figura 1C). La cantidad de células muertas, que tienen baja dispersión frontal y alta dispersión lateral, fue significativamente mayor en las células AGS (12,4 ± 4,3% frente a 79,4 ± 5,7%), y también en células KATO-III, en comparación con las células control (8,7 ± 0,6% vs. 46,8 ± 2,1%). finalmente se analizó la inducción de apoptosis después del tratamiento vorinostat en AGS y KATO-III líneas celulares de cáncer gástrico mediante inmunotransferencia. Vorinostat aumento de la apoptosis, según la evaluación de la caspasa-3 de escisión, en células de AGS y en menor medida en las células KATO-III (Figura 1D).
(A) ensayos de MTT se realizaron después de la incubación de AGS, KATO- III, y NCI-N87 con las concentraciones indicadas de vorinostat durante 72 horas. (B) Cambio de ciclo celular por vorinostat fue evaluada por fluorescencia de células activadas por la clasificación análisis de células teñidas PI tratados con 5 vorinostat mu M durante 24 horas (FACS). (C) Prueba de viabilidad utilizando solución exclusiva PI. células AGS y KATO-III fueron tratados con vorinostat 5 mM durante 72 horas y evaluados por FACS. En gráfico representativo, las células muertas se manifiestan en forma de puntos con baja dispersión frontal y alta dispersión lateral. (D) Análisis de transferencia Western de la caspasa-3 activa a partir de AGS y Kato-III células de cáncer gástrico con o sin 5 mM tratamiento vorinostat. Los lisados celulares se analizaron en los puntos de tiempo indicados. Actina se utilizó como control de carga. *,
P Hotel & lt; 0,05. En el gráfico de barras, los datos representan la media + SD (desviación estándar).
En resumen, estos datos indican que vorinostat tiene efecto antiproliferativo sobre líneas celulares de cáncer gástrico mediante la inducción de apoptosis en células de AGS y G2 /M la detención del ciclo celular en las células KATO-III.
análisis de la expresión génica global de líneas celulares de cáncer gástrico AGS y Kato-III después del tratamiento vorinostat
Para analizar el efecto de vorinostat en la expresión génica global, AGS y células de cáncer gástrico KATO-III fueron tratados con vorinostat 5 M durante 48 horas y se realizó el análisis de microarrays. análisis de agrupamiento no supervisado de los microarrays de datos después del tratamiento vorinostat mostró que las células AGS y Kato-III agrupadas con la misma línea celular sin tener en cuenta al tratamiento vorinostat (Figura 2A). Debido a que la autofagia se ha informado que tienen un papel en los efectos inducidos por vorinostat en otros tipos de cáncer [20], [21], se realizó un análisis supervisado del conjunto de genes relacionados con la autofagia-(80 genes y 149 sondas; Tabla S2). líneas celulares de cáncer gástrico Vorinostat tratados se agruparon juntos (Figura 2B), lo que indica que la inducción de la autofagia es una propiedad importante de vorinostat en líneas de cáncer gástrico.
(A) Agrupación jerárquica sin supervisión de los datos de expresión génica y de AGS KATO III antes y después del tratamiento vorinostat 5 M durante 48 horas. Los genes fueron seleccionados con un nivel de expresión que tiene al menos 2 veces la diferencia con respecto al valor medio a través de líneas de células en al menos 2 matrices para el análisis de agrupamiento jerárquico (3,646 características de genes). (B) Supervisado agrupación jerárquica con genes relacionados con la autofagia (149 sondas) de AGS y KATO III después del tratamiento vorinostat.
La inhibición de la autofagia mejora la eficacia vorinostat en células de cáncer gástrico
Teniendo en cuenta que autofagia puede tener un papel en la supervivencia de células de cáncer y el cáncer de la muerte celular después del tratamiento de drogas [22], [23], se evaluó aún más la contribución de este proceso para el efecto de vorinostat en las líneas celulares de cáncer gástrico. Nosotros evaluamos funcionalmente este proceso mediante análisis de inmunotransferencia de la proteína asociada a los microtúbulos 1 cadena ligera marcador de autofagia 3 (LC3). Vorinostat tratados células KATO-III, y en menor medida a las células AGS, mostró una clara acumulación de la migración más rápida forma lipidada de LC3 (LC3-II) (Figura 3A). La acumulación de LC3-II puede ser consecuencia de la regulación positiva de la formación autofagosoma o bloqueo de la degradación de la autofagia de LC3-II [24], [25]. por lo tanto, se analizaron las células vorinostat tratados para la degradación de p62, un marcador de flujo autophagic [24], y se observó una disminución en los niveles de proteína p62 en las células tratadas vorinostat en comparación con el tiempo de las células de cáncer no tratados emparejados (Figura 3A). Además, el cotratamiento de vorinostat con bafilomicina A1 (BafA1), un inhibidor de la fusión autophagosome-lisosoma, aumentó aún más la acumulación de LC3-II (Figura 3B), compatible con la inducción de flujo vorinostat autophagic en lugar de bloquear la capacidad de degradación de autophagolysomes. La microscopía electrónica (EM) es un método sensible, cuantitativa y definitivo para la detección de la autofagia [24]. Consistente con los datos de transferencia Western, el análisis de EM mostró que vorinostat marcadamente mayor formación autophagosome en células AGS (Figura 4B y B ') en comparación con las células control (Figura 4A y A').
AGS (A) y KATO -III se trataron con 5 mM vorinostat para los puntos de tiempo indicados. Los niveles de proteína de LC3 y p62 se analizaron mediante análisis de inmunotransferencia. Actina se utilizó como control de carga. niveles de p62 se midieron mediante análisis densitométrico de las transferencias de Western y se compararon con los niveles de actina. los niveles de p62 de AGS no tratadas y las células fueron considerados como KATOIII 1. (B) células AGS se trataron durante 12 h con 5 vorinostat mu M con o sin 50 nM bafilomicina A1 (BafA1). Los lisados celulares se analizaron mediante análisis de inmunotransferencia para LC3 y actina.
Después de 12 h de tratamiento DMSO (A, A ') o con 5 M vorinostat (B, B') (paneles de la izquierda, bajo aumento, barra de escala: 2 micras), se realizó un análisis de EM. imágenes de gran aumento de áreas enmarcadas con Av representa vacuolas autofágicos (paneles de la izquierda, la barra de escala: 500 nm; N: núcleo, M: mitocondrias).
Para investigar si la acumulación de autofagosomas protege a las células contra la estrés celular provocada por el vorinostat, que inhibe el proceso de autofagia mediante la cloroquina farmacológico inhibidor y pequeños ARN de interferencia (siRNA) contra beclin-1. Además de la cloroquina a AGS vorinostat tratadas y células KATO-III resultó en una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad (Figura 5A). La reducción de la viabilidad se confirmó en células KATO-III tratados con beclin-1 siRNA (Figura 5B). En conjunto, los datos sugieren que la inhibición de la autofagia vorinostat inducida puede mejorar la eficacia del tratamiento vorinostat de células de cáncer gástrico.
AGS (A) y KATO-III células fueron tratadas con 5 mM vorinostat y diferentes concentraciones de cloroquina (CQ). La viabilidad celular se evaluó después de 12 horas usando tinción con cristal violeta y control (Ctr) se fijó como 100%. (B) las células KATO-III fueron transfectadas con siRNA contra Beclin 1 (siBeclin1) o la no focalización Risc libre de siRNA o tratados con Dharmafect yo solo (simulacro). eficiencia siRNA se confirmó mediante análisis de transferencia Western de Beclin 1 y Risc libre como control. α-tubulina se utilizó para demostrar igualdad de la carga de proteínas. La viabilidad se midió después de 12 horas de tratamiento vorinostat utilizando tinción con cristal violeta. La viabilidad de las células de control sin tratar (CTR) se fijó como 100%. *,
P
. & Lt; 0,05
El vorinostat cambia la firma de genes en células de cáncer gástrico humano
Para entender los efectos de vorinostat sobre la expresión génica en células de cáncer gástrico líneas, se realizó el análisis de microarrays de AGS tratado vorinostat y líneas celulares de cáncer gástrico KATO-III (Fig. 2). Nuestro análisis reveló diferencias significativas genómicas entre células de cáncer gástrico no tratados y tratados vorinostat-(AGS y Kato-III). Después del tratamiento vorinostat, la expresión de los genes 1014 se incrementó y la expresión de los genes se redujo de 760 en la línea de células AGS. En la línea celular Kato-III, 164 fueron de genes y 191 genes fueron regulados hacia abajo (diferencia de dos veces;
P Hotel & lt; 0,001). Vorinostat significativamente alterada la expresión de 140 genes en ambas AGS y líneas celulares KATO-III (vorinostat firma gen específico). Los genes que fueron más alterados después del tratamiento vorinostat fueron identificados como
SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, Neu1, TXNIP, CCK gratis (& gt; 4 veces hasta -Reglamento) y
MUC1, IFITM1, ANKRD37 gratis (& gt;. 4 veces baja regulación)
a continuación, se intentó identificar biomarcadores candidatos que pueden predecir la sensibilidad vorinostat de pacientes con cáncer gástrico humano . Por lo tanto, hemos combinado el conjunto de genes alterados en líneas celulares de cáncer gástrico tratados vorinostat (vorinostat firma gen específico) y las dos firmas de cáncer gástrico humano generados a partir de los datos Yosei y Stanford usando análisis de diagrama de Venn. Se encontró que los niveles relativos de expresión de 12 genes fueron revertidos por el tratamiento vorinostat (Figura 6). De estos 12 genes, 7 genes altamente expresados en tejidos de cáncer gástrico se redujeron reguladas (
ITGB5
,
TYMS
,
MYB
,
APOC1
,
cbx5
,
PLA2G2A
,
KIF20A
) y 5 genes bajos expresó eran
SCGB2A1
,
TCN1 regulados hasta después del tratamiento vorinostat (
,
CFD
,
APLP1
,
NQO1 gratis (Tabla 3).
Diagrama de Venn de los genes seleccionados por el test univariado (dos muestras t-test) Los genes fueron seleccionados para p & lt;.. 0.001 entre los grupos comparados El círculo rojo (gen de la lista a) representa genes específicos de cáncer gástrico a partir de datos de Yonsei El círculo azul (gen de la lista B) representa los genes específicos de cáncer gástrico a partir de datos de Stanford.. el círculo amarillo (lista de genes C) representa el vorinostat firma gen específico de ambos AGS y líneas de células KATO-III (
P Hotel & lt; 0,001, 2 veces el cambio).
Discusión
Nuestros resultados indican que una firma global de genes humanos de cáncer gástrico podría ser útil para encontrar agentes terapéuticos que más bien se dirigen a la firma genómica del cáncer gástrico lugar de dirigirse a uno o dos genes específicos. Usando el Mapa de Conectividad, se encontró que los inhibidores de HDAC, tales como vorinostat y tricostatina A, tenían una firma genética inversamente correlacionado en comparación con la firma de genes específicos de cáncer gástrico y por lo tanto pueden ser candidatos terapéuticos de plomo para el cáncer gástrico.
In vitro
evaluación de la eficacia terapéutica de vorinostat reveló que este fármaco terapéutico crecimiento de diferentes líneas celulares de cáncer gástrico suprimida. Junto a su efecto antiproliferativo, vorinostat también upregulated genes autofagia específica. La inhibición de la autofagia vorinostat inducida resultó en una reducción adicional de la viabilidad. Además, el análisis combinado de las líneas celulares de cáncer gástrico tratados con vorinostat y muestras de pacientes con cáncer gástrico mostró que vorinostat alteró los niveles de expresión de un conjunto de genes específicos doce cáncer gástrico.
Nuestros resultados mostraron que los inhibidores de la HDAC, y vorinostat tricostatina a, eran los mejores candidatos terapéuticos para el cáncer gástrico, lo que está de acuerdo con el concepto de que la HDAC se sobreexpresa en tejidos de cáncer gástrico [26]. inhibidores de HDAC han sido demostrado que aumenta la acetilación de histonas, por lo tanto afectar la expresión de genes. Estos inhibidores efectos contra el cáncer se manifiestan mediante la inducción de la vía de la apoptosis intrínseca y extrínseca [27], [28], el bloqueo de la angiogénesis del tumor [29], y que inhiben las vías de respuesta al estrés intracelulares [30]. Debido a que los inhibidores de HDAC tienen efectos globales sobre la expresión génica, que pueden afectar los procesos celulares aún no revelada [31], [32]. En el ámbito clínico, los inhibidores de HDAC se han aplicado principalmente a las neoplasias malignas hematológicas, pero los ensayos clínicos en tumores sólidos están en curso. En un estudio reciente, el apoyo a nuestro
in vitro
hallazgos en demostró la eficacia terapéutica de los inhibidores de HDAC en muestras de cáncer gástrico humano utilizando el ensayo de respuesta a los fármacos histocultivo [33]. Sin embargo, sigue siendo revelada si los subgrupos moleculares específicos definidos pueden predecir la respuesta o resistencia a los inhibidores de HDAC.