Extracto
Introducción
Orientación de la activación de mutaciones oncogénicas conductor en el adenocarcinoma de pulmón ha dado lugar a una supervivencia prolongada en pacientes albergar estas alteraciones genéticas específicas. El valor pronóstico de estas mutaciones aún no se ha dilucidado. La prevalencia de la mutación somática no codificante descubierto recientemente en la región promotora de
de TERT
gen es también para ser validado en el cáncer de pulmón. El propósito de este estudio es mostrar la prevalencia, la asociación con características clínica como valor pronóstico de estos factores.
Métodos
En una cohorte de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (n = 174, incluyendo adenocarcinoma de pulmón y 107 carcinoma de células escamosas de pulmón 67),
EGFR
,
KRAS
,
HER2
y
BRAF
eran directamente secuenciado en adeoncarcinoma de pulmón, ALK fusiones fueron seleccionados utilizando fluorescencia (FISH
la hibridación in situ
).
de TERT
región promotora se secuenció en todas las 174 muestras de NSCLC. Se evaluaron las asociaciones de estas mutaciones somáticas y las características clínico-patológicas, así como factores pronósticos.
Resultados
EGFR
,
KRAS
,
HER2
,
BRAF
mutación y
ALK sobre fusion se encuentra mutado en el 25,2%, 6,5%, 1,9%, 0,9% y el 3,7% de los adenocarcinomas de pulmón. No
de TERT
mutación promotor fue validado por secuenciación inversa unilateral. adenocarcinoma de pulmón con
EGFR
y
KRAS
mutaciones no mostraron diferencias significativas en la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y supervivencia global (OS). Cox multivariable análisis reveló que sólo el estadio N y
HER2
mutación fueron predictores independientes de peor supervivencia global (HR = 1,653; IC del 95%: 1,219 a 2,241,
P = 0,001;
HR = 12.344, 95% IC 2,615 a 58,275,
P
= 0,002).
Conclusiones
Hemos confirmado además que
de TERT promotor de mutación pueden existir solamente en una fracción muy pequeña de NSCLC. Estos resultados indican que la división de adenocarcinoma de pulmón en subtipos moleculares de acuerdo con mutaciones oncogénicas conductor no predice diferencia en la supervivencia de la enfermedad
Visto:. Li C, Hao L, Li Y, Wang S, Chen H, Zhang L , et al. (2014) Análisis de Valor pronóstico de mutacional y factores Clinicopathological en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (9): e107276. doi: 10.1371 /journal.pone.0107276
Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2014; Aceptado: August 8, 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. La hoja de datos original de los resultados de nuestro experimento se puede encontrar en la información de apoyo
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81.302.001 a 81.201.649 CG Li y Sun BS, http: //www.nsfc.gov.cn), Science Foundation Postdoctoral china (2014M550147 de CG Li, http://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), Programa clave para la investigación anti-cáncer de la Ciencia Municipal de Tianjin y Tecnología de la Comisión (12ZCDZSY15400 a la CL Wang, http://www.tstc.gov.cn/) y el Programa clave de Application Foundation, Tianjin Ciencia y Tecnología de la Comisión Municipal (12JCYBJC17800 a la CL Wang, http://www.tstc.gov .cn /). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las enfermedades más devastadoras y la causa principal de las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), lo que representa alrededor del 85% de los casos de cáncer de pulmón, se divide a su vez a los subtipos histológicos de adenocarcinoma (ADC), el carcinoma de células escamosas (SCC) y carcinoma de células grandes. Adenocarcinoma se ha convertido en el subtipo más común de cáncer de pulmón [2]. La tasa de supervivencia a 5 años del NSCLC sigue siendo baja como 15-16%, a pesar de la mejora del tratamiento en las últimas décadas [1], [3]. Una mejor comprensión de la tumorigénesis NSCLC y los factores asociados con el pronóstico se necesita.
El descubrimiento de la activación de mutaciones en el dominio tirosina quinasa del
EGFR
ha llevado al desarrollo y uso generalizado de gefetinib y erlotinib, que tiene demostrado ser eficaz en el tratamiento de parte de
EGFR
adenocarcinomas de pulmón mutadas [2], [4]. De acuerdo con las mutaciones oncogénicas específicas del controlador, adenocarcinoma de pulmón se divide a los subtipos moleculares, tales como
EGFR
,
KRAS
,
ALK
,
HER2
,
BRAF
y así sucesivamente [5], [6]. La mayoría de estos genes tienen controladores fármacos dirigidos específicos en uso o ensayos clínicos. En comparación con el adenocarcinoma, el conocimiento de las alteraciones genéticas del carcinoma de células escamosas de pulmón es limitado. frecuentes mutaciones, la amplificación o la pérdida de
FGFR1
,
PTEN
,
PIK3CA
,
NFE2L2
,
NRF
se han identificado en estudio genómico global en el pulmón carcinoma de células escamosas [7]. Debido a que el espectro mutacional gran medida sin definir y bajas frecuencias de estos genes, las terapias dirigidas en el pulmón carcinoma de células escamosas se está quedando atrás y limitado a los ensayos clínicos
.
Recientemente, los estudios de secuenciación del genoma de cáncer humano han revelado mutaitons somáticas en el núcleo promotor de la telomerasa transcriptasa inversa humana (
hTERT
)
gene, que codifica la subunidad catalítica de la telomerasa [8] -. [10]. De cualquier C228T o C250T de
hTERT
actividad transcripcional del promotor mutaciones elevado de
hTERT
de genes en los ensayos de reportero luciferasa [8]. Los tipos de tumores con frecuentes
hTERT
melanoma mutaciones promotoras incluido (71%), glioma (51%), liposarcoma mixoide (79%), carcinoma urotelial de vejiga (66%) [8], [9]. Evidencias en estudios anteriores sugirieron que
hTERT
mutaciones promotoras potencialmente actuar como un gen controlador en el melanoma. Sin embargo, la prevalencia de
hTERT promotor
mutación en muestras clínicas de cáncer de pulmón está ausente en estos estudios. Es necesario demostrar la prevalencia de
hTERT promotor
mutación en muestras de NSCLC como acciones de cáncer de pulmón controlador genes con el melanoma, como
BRAF mutado Opiniones y
ANR
[8], [9], [11].
en este estudio, que tuvo como objetivo mostrar las características moleculares y clínico-patológicas completas en CPNM, así como el valor pronóstico de estas características.
pacientes y tejidos
muestras de tumores primarios se obtuvieron de 174 pacientes sometidos a resección pulmonar potencialmente curativa en el hospital de cáncer de la Universidad médica de Tianjin de ene de 2004 hasta enero de 2008. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto de cáncer de la Universidad médica de Tianjin y el hospital. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. Los pacientes se inscribieron en este estudio específico sobre la base de los siguientes criterios: tenían un diagnóstico patológico de adenocarcinoma de pulmón o carcinoma de células escamosas, su muestra de tumor contenía un mínimo de células tumorales 50% según lo determinado por los patólogos del estudio, que no recibieron quimioterapia neoadyuvante, y tenían suficiente tejido para el análisis molecular. Se recogieron características clinicopatológicas y la información pronóstico.
aislamiento del ADN y análisis mutacional
ADN genómico fueron aisladas de muestras incluidas en parafina (FFPE) fijado con formalina de acuerdo con protocolos estándar (TIANquick FFPE Kit DNA, Tiangen Inc, china).
EGFR gratis (exones 18-22),
HER2 gratis (exón 20),
KRAS gratis (exones 2 a 3),
BRAF gratis (exón 15 ) y
de TERT
región promotora fueron amplificados mediante PCR de ADN y directamente secuenciados. análisis PCR Multiplex se hizo con ADN polimerasa rTaq (Toyobo, Osaka, Japón). Los cebadores utilizados en estos experimentos se listan en la Tabla S1. fusiones ALK fueron seleccionados utilizando FISH con diapositivas FFPE.
El análisis estadístico
Las asociaciones entre mutaciones y las características clínicas y biológicas fueron analizados por
χ
2
o la prueba exacta de Fisher . Las curvas de supervivencia fueron dibujadas por el método de Kaplan-Meier. Se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox (avance razón de verosimilitud del modelo) para los análisis de supervivencia multivariante. Todos los datos fueron analizados utilizando el paquete estadístico para Ciencias Sociales Software versión 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). El nivel de significación bilateral se fijó en
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Características de los pacientes
Ciento siete ADC de pulmón y 67 SCC pacientes fueron incluidos en este estudio, incluyendo 105 hombres y 69 mujeres (media 58 años, rango 39-77 años). Había 109 fumadores y 65 no fumadores, que representan el 63% y 37%, respectivamente. El número de pacientes en estadios I-III fue del 57, 46, y 69, respectivamente. Dos muestras fueron con la etapa indefinida. La información detallada se muestra en la Tabla 1.
EGFR, KRAS, HER2
y
BRAF mutación
Estado y ALK fusiones
De la se encontraron 107 muestras de adenocarcinoma de pulmón, el 25,2% (27/107) de los tumores que albergan
mutaciones de EGFR
dominio quinasa. Entre estos, 17 fueron deleciones en el exón 19 y 6 eran cambios de sentido erróneo L858R. Otras alteraciones incluyen 1 exón 20 de inserción, las mutaciones del exón 20 D807N y T790A, 1 exom 18 R705K mutación. Seis muestras (5,6%) tuvieron un
KRAS
mutación, incluyendo cinco mutaciones G12V y una mutación de sentido erróneo I36M. Dos muestras albergadas
HER2
mutación exón 20, que incluye una inserción 776-779 YVMA y una mutación S789P. Sólo un
BRAF
L588F mutación sin sentido se identificó en estas muestras tumorales (Figura 1). fusiones ALK se detectaron en 4 muestras (3,7%). Debido a que las mutaciones de
EGFR, KRAS, HER2, BRAF
, así como
ALK
fusiones han sido bien establecidos que existía en el adenocarcinoma de pulmón [5], [12] - [14], estas mutaciones y la fusión de genes que adenocarcinoma de pulmón 'unidades' no se proyectaron en el pulmón carcinoma de células escamosas.
Las tasas de mutación de
EGFR, KRAS, HER2
y
BRAF eran
25.2, 5.6, 1.8 y 0.9%, respectivamente.
5 'no codificante región mutaciones de
de TERT
gen en NSCLC
ni las mutaciones C228T ni C250T fue validado en las 174 muestras de CPCNP después de la secuenciación inversa. Estos resultados indican que
de TERT promotor de mutación puede existir solamente en una fracción muy pequeña de las muestras de NSCLC primarios.
Análisis de supervivencia
Mediante análisis univariante, la estadificación clínica avanzada (
P = 0,018
), metástasis de ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,001), la estación de ≥2 de ganglios linfáticos metastásicos (
P Hotel & lt; 0,001), recibido quimioterapia adyuvante (
P
= 0,004) se asociaron recaída de la enfermedad (Tabla 2).
EGFR
y
KRAS
estado de la mutación no se asociaron con la supervivencia libre de recaída (
P = 0,600
) o la supervivencia global en el adenocarcinoma de pulmón (
P
= 0,873) (Figura 2). Cox multivariado análisis por pasos hacia adelante (el ajuste por edad, sexo, antecedentes de tabaquismo, estadio clínico, subtipos histológicos y el estado mutacional) reveló que sólo el nódulo linfático etapa (etapa N) y
HER2
mutación fue predictores independientes de peor supervivencia global ( HR 1,653, IC del 95%: 1,219-2,241;
P = 0,001
; HR 12.344; IC del 95% desde 2,615 hasta 58,275;
P
= 0,002). mutacional información detallada y la supervivencia aparece en la Tabla S2.
EGFR
y
KRAS
estado de la mutación no se asociaron con la supervivencia libre de recaída (
P
= 0,600) o la supervivencia general (
P = 0,873
) en el adenocarcinoma de pulmón; discos compactos. Lymphnode etapa (etapa N) se asoció significativamente con la supervivencia libre de recaída (
P
= 0,001) o la supervivencia general (
P
= 0,001) en el CPNM.
Discusión
NSCLC es una enfermedad heterogénea, resultado difiere incluso en pacientes con idénticas características clínico. Identificación de mutaciones del conductor oncogénica en adenocarcinoma de pulmón ha promovido en gran medida el uso clínico y el desarrollo de fármacos dirigidos [5], [6], [15], [16]. Aunque
EGFR
y
KRAS
mutaciones se han establecido como marcadores predictivos y pronósticos para los pacientes que reciben
EGFR
-TKIs [4], [17], [18], los resultados sobre el valor pronóstico de estas alteraciones a nivel genómico en los pacientes que no recibieron
EGFR
-TKIs rara vez se informa.
Hemos proyectado la prevalencia de mutaciones conductor conocidas de
EGFR
,
KRAS
,
HER2, BRAF
y
ALK
en una cohorte de 107 muestras de pulmón adenocarcinoma con información pronóstica completa. El
EGFR
mutación,
KRAS
mutación y
EGFR
/
KRAS de tipo salvaje
grupos no mostraron diferencias significativas en la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global En el presente estudio. Todos los pacientes incluidos en este estudio no recibieron fármacos moleculares pequeños de orientación
EGFR
. Nuestros resultados sugieren que la mutación específica del controlador de
EGFR
o
KRAS
gen no predice la ventaja en la supervivencia o desventaja cuando estos pacientes no recibieron terapias diana específicas. En el análisis multivariado,
HER2
mutación se identificó como predictor independiente de pronóstico desfavorable. Debido a que sólo dos muestras albergaban
HER2
mutación, más estudios con mayor número de muestras son necesarios para confirmar este resultado. Sobre la base de estos hechos, se concluye que para dividir el adenocarcinoma de pulmón en subtipos moleculares sólo se predice la respuesta al tratamiento, pero no beneficio en la supervivencia en los pacientes que no recibieron estos fármacos.
El surgimiento de mutaciones somáticas de
hTERT
gen de la región 5 'del promotor en el melanoma ha proporcionado otro gen controlador candidato prometedor para el cáncer de pulmón. Varios estudios han identificado frecuentes
hTERT
5 'mutaciones del promotor en el melanoma [8], [10], gliomas, así como de tasas relativamente bajas de tejidos auto renovación como liposarcomas, carcinomas hepatocelulares, carcinomas uroteliales, células escamosas los carcinomas de la lengua y los meduloblastomas [9], [19]. Hemos examinado el
hTERT
la región 5 'del promotor en 174 muestras de NSCLC FFPE para explorar la tasa de mutación y el potencial valor pronóstico. Sólo se identificaron tres mutaciones C250T de las 174 muestras, pero ninguna de ellas se validaron mediante secuenciación inversa, lo que podría ser posiblemente causada por daño en el ADN en el proceso de fijación de formalina y la inclusión en parafina. Estos resultados confirmaron que
hTERT página 5 'del promotor mutaciones solamente pueden existir en una fracción muy pequeña de los casos de NSCLC.
La limitación del presente estudio debe ser discutido. Con el fin de explorar el significado pronóstico, se utilizaron muestras FFPE que tienen información completa supervivencia. Sin embargo, la sensibilidad de los resultados de secuenciación se ve afectada por la relativamente baja calidad de las muestras FFPE, en el que se degrada el ADN y mutado de manera artificial. La tasa de mutación de los genes conocidos conductor es menor que estudios previos utilizando snap-congelado muestras de alta calidad [20], [21], y las mutaciones artificiales apareció en
hTERT página 5 'región promotora. Aunque muestras consecutivas con los datos de supervivencia completos no están siempre disponibles, nuestro estudio proporciona el espectro de mutaciones y de asociación pronóstico de estas alteraciones genéticas con la muestra y técnicas disponibles.
En conclusión, nuestro trabajo ilustra el espectro de mutaciones de
EGFR
,
KRAS
,
HER2, BRAF
y
ALK
en el adenocarcinoma de pulmón, así como confirmado que h
de TERT página 5 'del promotor región de mutación rara vez se produjo en las muestras de NSCLC. También confirmó que estas mutaciones conductor carecen de valor pronóstico en pacientes con adenocarcinoma de pulmón que no recibieron tratamiento TKI del EGFR, y subtipos dividido por estas mutaciones oncogénicas conductor no predecimos significativa diferencia en la supervivencia.
Apoyo a la Información
Tabla S1. List de cebadores utilizados para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del gen EGFR, KRAS, BRAF HER2 y
doi:. 10.1371 /journal.pone.0107276.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
mutacional y la información de supervivencia de 174 pacientes con CPNM. Sexo, 1 macho, hembra 2; Fumar, no fumador 0, 1 fumador; camino, patología; WT, de tipo salvaje; DEL, su eliminación; INS, la inserción; NEG, negativo; . POS, positivo
doi: 10.1371 /journal.pone.0107276.s002 gratis (XLS)