Extracto
El cáncer se desarrolla a través de un proceso de múltiples pasos en el que las células normales progresan a tumores malignos a través de la evolución de su genomas como resultado de la adquisición de mutaciones en genes de controlador cáncer. El número, la identidad y modo de acción de los genes del cáncer de controladores, y cómo contribuyen a la evolución del tumor es en gran parte desconocida. En este estudio se desplegó el virus del tumor mamario de ratón (MMTV) como un mutágeno de inserción para encontrar los genes tanto del conductor y las redes en que funcionan. El uso de la secuenciación del sitio de inserción profunda se identificaron alrededor de 31000 sitios de integración retroviral en 604 tumores mamarios inducidos por MMTV de ratones con deleción específica de la glándula mamaria de
Trp53
,
PTEN
ratones knockout heterocigotos, o cepas de tipo salvaje . Se identificaron 18 sitios conocidos comunes de integración (CISS) y 12 CISS marcado nuevos genes del cáncer candidato hasta ahora desconocidas. Los miembros de la
Wnt
,
FGF
,
FGFR
,
RSPO
y
PDGFR
familias de genes mutados fueron comúnmente en un mutuo de manera exclusiva. La secuencia de datos que generamos dio también información sobre la clonalidad de las inserciones en los tumores individuales, que nos permite desarrollar un modelo basado en datos del desarrollo de tumores inducidos por MMTV. inserción mutaciones cerca de
Wnt
y
FGF
genes marcan los primeros "iniciadores" eventos en la tumorigénesis MMTV inducida, mientras que
FGFR
genes están dirigidos más tarde durante la progresión tumoral. Nuestros datos muestran que la mutagénesis de inserción se puede utilizar para descubrir las redes mutacionales, el momento de mutaciones, y los genes que inician y conducir la evolución del tumor
Visto:. Klijn C, Koudijs MJ, Kool J, ten Hoeve J , Boer M, de Moes J, et al. (2013) Análisis de la heterogeneidad del tumor y el gen del cáncer de redes que utilizan secuenciación profunda de MMTV-inducidas por tumores mamarios de ratón. PLoS ONE 8 (5): e62113. doi: 10.1371 /journal.pone.0062113
Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Febrero 2013; Aceptado: February 25, 2013; Publicado: 14 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Klijn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Sociedad holandesa del cáncer (2001-2489 subvención a JH), la Asociación Internacional para la Investigación del cáncer (AICR conceder 07-585 a JJ), la Iniciativa /Organización Países Bajos Países Bajos Genómica para la Investigación Científica (subvención del Programa IGN /NOM 050 -10 a 008 de MVL; IGN /NOM Horizonte concesión de penetración y 40-41009-98-9109 IGN /NOM Horizonte Zenith otorgan 40-41009-98-11097 a JJ), el Consorcio de los Países Bajos para la Biología de Sistemas (NCSB), el cáncer Centro de genómica (CGC), y el Centro de Biología de Sistemas del cáncer (CSBC). D.J.A. es financiado por el Cancer Research del Reino Unido y el Wellcome Trust (76943). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de ADN de próxima generación del paisaje mutacional de varios tipos de tumores se ha definido revelando que existen numerosas rutas genéticas a la malignidad [1]. la heterogeneidad del tumor contribuye aún más a esta complejidad [2], [3], lo que complica nuestra capacidad para distinguir mutaciones del conductor de los pasajeros. modelos tumorales de ratón presentan una limpia, reproducible
in vivo
sistema para estudiar la contribución de los genes del controlador en la tumorigénesis y definir sus mecanismos biológicos subyacentes de la acción [4].
mutagénesis por inserción (IM) retrovirus o transposones que emplean ha sido una de las principales herramientas para la inducción de tumores en ratones [5] - [8]. Mamario de Ratón virus de tumor (MMTV) es un retrovirus lento de transformación que se ha utilizado para estudiar la tumorigénesis mamaria en ratones. Este virus causa tumores mamarios por la integración de su ADN proviral en o cerca de los genes del cáncer. Los ciclos repetidos de mutación por inserción y expansión clonal da lugar a tumores de mama que llevan múltiples integraciones MMTV clonales y sub-clonal, incluyendo mutaciones ligadas a los dos genes conductor, así como mutaciones de pasajeros.
La clonación molecular de las inserciones proviral en MMTV- tumores mamarios inducidos llevaron al descubrimiento de la primera inserción del sitio Común MMTV (CIS) y el gen asociado
Wnt1 gratis (originalmente llamado
Int 1
) en 1982 [9]. Se encontró que MMTV inserciones cerca de la
Wnt1
gen promueven el desarrollo del tumor de mama a través de la activación de Wnt1, el miembro fundador de la vía de señalización de Wnt. Poco después del descubrimiento de los
Wnt1
otro oncogén,
Fgf3 gratis (originalmente llamado
Int2
) fue identificado. La investigación adicional mostró que este miembro de la familia de genes del factor de crecimiento de fibroblastos colabora eficazmente con
Wnt1
en la formación de tumores [10]. Después de la promesa de estos primeros estudios, la creciente popularidad de MMTV como un sistema de detección dio como resultado el descubrimiento de varios genes adicionales implicados en el desarrollo del cáncer [11] - [17]
La heterogeneidad y la progresión de MMTV-. tumores inducidos se pueden evaluar mediante el análisis de la abundancia relativa ( "clonalidad") de las inserciones individuales en una muestra dada. Muy abundantes inserciones indican temprano, iniciando eventos de inserción y las inserciones abundantes humilde indican eventos que se producen más tarde durante el desarrollo del tumor, análogos a los últimos estudios de mutaciones de un solo nucleótido en tumores humanos [2], [3]. enfoques basados en la PCR utilizados anteriormente no son capaces de cuantificar de manera fiable la clonalidad de los sitios de inserción debido a sesgos de amplificación de secuencias. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para la identificación simultánea y evaluación cuantitativa de la clonalidad de inserción mutaciones llamada Shear-Splink [18]. Hemos aplicado este método para analizar un gran conjunto de tumores inducidos por MMTV a partir de dos cepas de tipo salvaje ratones (Balb /c y FVB /N) y dos modelos de cáncer de mama de ratón genéticamente modificado (GEM): el
PTEN
+/-
cepa [19] y el
K14Cre; Trp53
modelo [20]. Se utilizó el conjunto de datos resultante para hacer frente a cuatro preguntas fundamentales: En primer lugar, podemos identificar nuevos MMTV IIC y de este modo ampliar el repertorio de genes del cáncer de candidatos asociados con estos modelos? En segundo lugar, podemos identificar los genes específicos del controlador de genotipo en cada una de las bases genéticas? En tercer lugar, podemos identificar concurrentes o mutuamente excluyentes relaciones entre IIC y por lo tanto definir las relaciones funcionales entre los genes asociados conductor? Finalmente, podemos generar un modelo de progresión del tumor a partir de la información clonalidad derivada de la secuencia lee de las inserciones individuales? Dicho modelo especificar el orden de los acontecimientos en función del perfil de inserción y arrojar luz sobre las relaciones funcionales entre los genes implicados en la tumorigénesis mamaria inducida por MMTV.
Materiales y Métodos
Los modelos de ratón utilizan para MMTV infección
recién nacido BALB /c /He /a (denotado BALB /c) los ratones fueron infectados con MMTV por enfermería de crianza en C3H /a las hembras que albergan el leche transmitida MMTV [21]. Infectados /c ratones hembra BALB desarrollan tumores mamarios con alta incidencia (& gt; 95% antes de la edad de 1 año). Los animales infectados por el virus se designan BALB /c
+ ratones. En este estudio se utilizaron dos líneas de ratones transgénicos y sus controles de tipo salvaje: una cepa deficiente en forma condicional para
Trp53 Hoteles en tejido epitelial mamaria en un fondo BALB /c (Balb /c
K14Cre; Trp53
F /F
) y un nocaut heterocigotos de la línea germinal para
PTEN
en un fondo FVB /N
El BALB /c
K14Cre;. Trp53
F /F
cepa de ratón se generó mediante nueve retrocruzamientos consecutivos de
K14Cre; Trp53
F /F
animales en un entorno mixto de 129P2 /Ola y FVB /N de fondo [22] a ratones BALB /c. El resultado Balb /c
K14Cre; Trp53
F /F
cepa mostró sólo una baja incidencia del tumor de mama antes de los 300 días. Estos condicional
Trp53
nocaut ratones fueron infectados por MMTV a través de enfermería estimular por BALB /c
+ hembras
.
Para la comparación de la tumorigénesis MMTV inducida entre el tipo silvestre y
PTEN
+/- ratones, el condicional
PTEN
knockout alelo [23] se utilizó para generar
ratones PTEN
+/- FVB /N.
PTEN
+/- ratones fueron cruzadas con ratones de tipo salvaje FVB /N. Los compañeros de camada de hembras en la progenie, tanto de tipo salvaje y heterocigotos para
PTEN
, se infectaron con el MMTV por la enfermería de crianza en ratones BALB /c
+ hembras que albergan la leche transmitida MMTV.
todos los animales infectados por el MMTV fueron controlados por el desarrollo de tumores de mama que fueron aislados cuando aproximadamente 1 cm de diámetro. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con el Código de Prácticas Holandés para la Investigación con Animales de Laboratorio de Investigación del Cáncer. El protocolo fue aprobado por el Comité local de experimentación animal de la ética (DEC) (los números de permisos: 04065, 08061, 03008) y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Todos los ratones fueron sacrificados cuando el tumor alcanza 1 cm
3 (punto final) de dióxido de carbono. gráficos de Kaplan-Meier de la duración de la vida del ratón se representaron y log-rank pruebas se calcularon utilizando el paquete de supervivencia como se aplica en el lenguaje de programación estadística R.
Cre mediada por la supresión de los
Trp53
alelos floxed en los tumores de
K14Cre; Trp53
F /F
ratones se evaluó mediante análisis de transferencia Southern como se ha descrito anteriormente de 2001 [24]. Brevemente, el ADN genómico de alto peso molecular de tumores MMTV inducida fue digerido con BglII. Los fragmentos de ADN se separaron en geles de agarosa 0,6% y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Un fragmento de PCR marcados 700 nt XbaI correspondiente al exón 11 del
Trp53
se utilizó como sonda para detectar alelos eliminados y no borrados. Cre mediada por la supresión del exón 2-10 de la floxed
Trp53
alelo puede ser evaluada sobre la base de un cambio de movilidad de la
Bgl II
fragmento de ADN. Aproximadamente el 50% de los tumores mostró pérdida bi-alélica de los exones floxed. Sólo aquellos tumores se utilizaron para el análisis de mensajería instantánea.
método Shear-Splink para la zona de inserción de mapeo
Para secuenciar los sitios de inserción en tumores que utilizamos el protocolo Shear-Splink como se describe anteriormente [18]. Brevemente, el ADN fue esquilada de 100-1000 bp fragmentos, que fueron romos y se ligó a adaptadores splinkerette. Una PCR primaria se realizó para amplificar específicamente fragmentos de unión-virales a-host. Una segunda PCR se realizó para introducir las secuencias de códigos de barras y los adaptadores necesarios para 454 secuenciación. Estos productos de PCR se agruparon y se secuenciaron por secuenciación 454. Los datos de secuenciación prima se ha depositado en el Archivo Lee secuencia con el número de ERP002483.
Análisis de los datos
métodos de análisis de datos se detallan en los métodos de apoyo (Texto S1).
ARN secuenciación
se extrajo ARN de tumores que llevan 4
HBEGF
inserciones y 4 casos que lleva un
Myb
inserción. Se determinó FPKMs tanto para
HBEGF
y
Myb
usando Gemelos [25] después de la alineación utilizando BWA [26]
Resultados
MMTV mutagénesis de inserción en el medio silvestre -type y ratones mutantes Trp53 o PTEN
con el fin de evaluar la heterogeneidad tumoral e identificar las redes de genes en el cáncer de MMTV inducida por tumores mamarios de ratón, se les practicó un alto rendimiento a gran escala estudio por inserción mutagénesis en combinación con profunda la secuenciación en una gran cohorte de ratones de 4 fondos genéticos diferentes. Una visión esquemática de nuestro enfoque se ilustra en la Figura S1. Se analizaron las cohortes de ratones de dos fondos genéticos diferentes: FVB /N (en lo sucesivo, FVB) y BALB /c. Para cada fondo genético adquirimos tumores tanto de la cepa de tipo salvaje, así como de los modelos específicos de ratón genéticamente modificado (GEM). En el fondo FVB, tumores mamarios fueron cosechadas de los ratones de tipo salvaje infectados por el MMTV y
PTEN
+/-
ratones knockout heterocigotos. En el fondo BALB /c inducida por tumores de MMTV fueron obtenidas de animales de tipo salvaje y
K14cre; Trp53
F /F
ratones con deleción-epitelio específico de p53. Como puede verse en la figura 1a, hay una diferencia entre la vida útil de los controles de tipo salvaje y los modelos de GEM coincidentes, lo que indica una interacción entre la tumorigénesis inducida por MMTV y la mutación por ingeniería genética. Curiosamente, la latencia media de desarrollo de tumores inducidos por MMTV se redujo en el
PTEN
+/-
cohorte, pero aumentó en el
K14cre; Trp53
F /F
cohorte en comparación con sus controles de tipo salvaje. Esta observación nos llevó a la hipótesis de que las inserciones de MMTV pueden golpear a los genes que colaboran con
PTEN
haploinsuficiencia en
+/-
ratones. En contraste, la infección por MMTV podría influir negativamente en la transformación maligna de
Trp53
- /-
células epiteliales mamarias o viceversa. También hay una gran diferencia en el tiempo de vida entre infectada por el MMTV de tipo salvaje FVB /N y los ratones BALB /c (Figura 1b). Esto podría simplemente indicar que el virus tiene la replicación más lenta en la cepa FVB comparación con la cepa BALB /c, o podría indicar la presencia de alelos BALB /c que promueven la tumorigénesis inducida por MMTV. En apoyo de esta última, BALB /c ratones contienen un alelo hypomorphic de la
Cdk2na
gen supresor de tumores [27].
Cada gráfico representa una comparación entre dos cohortes. Se realizó una prueba de log-rank por parejas para todos los gráficos para determinar si existen diferencias significativas entre las cohortes de vida útil representados en cada gráfico. P-valores se muestran en la esquina superior derecha. A. Dentro de cada cepa de ratón específico fondo (FVB o BALB /c +) se comparó la cohorte de tipo salvaje infectados por el MMTV con la línea infectados por ingeniería genética (ya sea
PTEN
heterocigóticos para la cohorte FVB o
Trp53
deficiente para la BALB /c + cohorte). B. La diferencia en la esperanza de vida entre las dos cepas de tipo salvaje se muestra aquí.
Para asignar los sitios de inserción de MMTV utilizamos nuestro protocolo Shear-Splink [18] para extraer y amplificar el ADN del virus-huésped fragmentos de unión que contienen el MMTV LTR 5 ', así como la secuencia genómica de ratón adyacente. Nos BarCoded los fragmentos que nos permiten la piscina en hasta 48 tumores individuales y la secuencia de ellos en el sistema Genome Sequencer FLX 454. secuencias en bruto fueron tratados previamente con scripts de Perl. Hemos identificado la secuencia genómica de la lectura y les asigna a la referencia del genoma C57BL /6J (MGSC37). Para cada leemos que confirmó la presencia del extremo 5 'de la secuencia viral, así como la presencia del código de barras de ADN para de-convolución las piscinas en datos individuales del tumor. Uno de los aspectos únicos de nuestro enfoque es que somos capaces de cuantificar la clonalidad de las inserciones contando el número de fragmentos de unión de ADN tumor-huésped únicas marcadas por puntos de ligadura únicos (LPs) entre la secuencia genómica del ratón y el adaptador splinkerette. Como el número de LPs únicas corresponde al número de células que llevan la inserción MMTV correspondiente, el recuento de LP se puede utilizar como una medida de la clonalidad relativa de las inserciones individuales MMTV dentro de cada tumor [18].
Varios adicional se llevaron a cabo medidas de filtrado como se describe en la sección Métodos y representado en la figura S1 antes de que se introduzcan los datos en la base de datos en la inserción del Mutagénesis (iMDB; http://imdb.nki.nl). Después de filtrar nos quedamos con 30942 integraciones en 604 tumores. Cualquier inserciones que tienen
n
LPs únicas se garantiza que han estado presentes en al menos
n
células independientes. Para enriquecer para las inserciones que se habían integrado en más de una célula tumoral, no tuvimos en cuenta inserciones con sólo un LP. El uso de este filtro redujimos los datos para 6605 inserciones únicas en 600 tumores (4 tumores realizadas sólo con inserciones 1 LP). Esta es una reducción de 78% en el número total de sitios de inserción, pero sólo constituye una reducción de 21% en el número total de lecturas, lo que sugiere que el filtrado contra inserciones con LPS solo reduce eficazmente el número de mutaciones de fondo en nuestros datos.
análisis del CIS de los sitios de integración MMTV
Se determinó IIC global para todos los tumores en el conjunto de datos. Para determinar significativa IIC se utilizó el marco de Gauss semilla de convolución [28] aplicado en el iMDB. La mayoría de los tumores de los ratones de tipo salvaje contribuyeron al menos una inserción de un CIS (Tabla 1). Este porcentaje es más bajo para los fondos predispuestos. Esto se debe probablemente al hecho de que algunos de los
K14Cre; Trp53
F /F
y
PTEN
+/-
ratones desarrollan tumores de mama que no son impulsados por MMTV mutagénesis de inserción. En total, encontramos 30 significativa IIC, de los cuales 18 eran ya conocidas y 12 eran novela (Tabla 2). Todas las inserciones asociadas con un CIS son accesibles a través del iMDB. Se asignaron de forma manual los posibles genes diana a estas IIC. Como ilustración se muestra los dos más frecuentes novela CISS y el mapeo de las inserciones de MMTV en estos CIS con respecto al gen diana en la Figura 2. Tanto
HBEGF
y
Myb ¿Cuáles son muy plausible genes candidatos objetivo como las integraciones MMTV son muy probable para mejorar la expresión (integraciones aguas arriba y aguas abajo) o estabilizar el ARNm por terminación de la transcripción prematuro y la eliminación concomitante de mRNA motivos de desestabilización debido a las integraciones en el 3 'UTR (en el caso de
HBEGF
). Por otra parte, tanto
HBEGF
[29], [30] y
Myb
[31] han sido previamente implicadas en el cáncer. Por último, la expresión de ambos HBEGF y Myb es alta en muestras que llevan la integración, que muestra que estos genes son objetivos directos de la integración viral (Figura S2).
El objetivo putativo se muestra gen, con la flecha indicando la dirección de la transcripción. Las puntas de flecha indican la localización genómica de las integraciones víricas, con la dirección de la flecha que indica la dirección de transcripción viral. Los colores indican la cohorte de donde se recuperaron las integraciones.
Muchas de las IIC que recuperamos son canónica CIS para MMTV mutagénesis de inserción. En los tumores de mama inducidos por MMTV, inserciones proviral se encuentran a menudo cerca de
Wnt Buscar miembros de la familia de genes (
Wnt1
,
Wnt3
y
Wnt3a
), el crecimiento genes relacionados con el factor (
FGF
y
FGFR
genes,
PDGFR
genes y
Igf2
), miembros de la familia de genes R-espondina (
Rspo1
,
Rspo2
y
Rspo3
) y la señalización mitógenos genes de la ruta (
Eras Opiniones y
Map3k8
) [11]. Se identificaron varios novela IIC en estas familias que no fueron identificadas anteriormente:
HBEGF
,
Rspo1
y
Fgfr3
. Estos nuevos objetivos sólo pueden ser recuperados en un estudio a gran escala, ya que se presentan con menos frecuencia en comparación con los miembros de la familia previamente identificados. También recuperamos varias IIC raro que es probable que sea cierto MMTV golpea porque los genes candidatos objetivo pertenecen a familias de genes que también incluyen a los miembros que son blancos frecuentes de MMTV. Este hallazgo apoya la validez de otra rara, pero significativo novela IIC que hemos identificado en nuestra pantalla, como
Sfi1
,
Dock5
y
Fezf1
. De hecho, el homólogo humano de
Fezf1
(conocido como
ZNF312B
) ha sido descrito como un oncogén en el cáncer gástrico [32]. Además, se encontraron varios genes diana conocidos y nuevos que se amplifica de forma recurrente en un panel de más de 700 líneas celulares de cáncer humano (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi ) o enumerado como dianas de mutación en la base de datos cósmicos (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Esto demuestra que los genes asociados con la IIC en los tumores mamarios inducidos por MMTV también pueden ser relevantes en el cáncer humano.
genotipo específico IIC
Además de encontrar nuevos MMTV IIC que estaban interesados en la búsqueda de genotipo específico inserciones. MMTV infectado
PTEN
+/- ratones desarrollan tumores mamarios más rápido que sus controles de tipo salvaje, lo que sugiere que las inserciones de MMTV podrían mutar los genes del cáncer relevantes que colaboran con PTEN haploinsuficiencia en la tumorigénesis mamaria. Si este es el caso esperaríamos encontrar enriquecimiento para IIC específica en MMTV inducida por
PTEN
+/-
tumores de mama, en comparación con el control de los tumores. Sin embargo, no se encontró ninguna asociación significativa con el fondo o bien en nuestro estudio (Tabla 2). Esto sugiere que las integraciones MMTV ocurren en o cerca de los mismos genes controladores del cáncer, independientemente de
Trp53
o
PTEN
de estado. También hubo una gran diferencia en la duración de vida entre la FVB infectada por MMTV y de tipo salvaje ratones BALB /c (Figura 1b). También en este caso, no se encontró ninguna asociación significativa entre IIC y el fondo de cepa. Aunque se observaron inserciones cerca de
HBEGF
sólo en el fondo FVB (Figura 2), esta diferencia no fue estadísticamente significativa, probablemente debido a la baja incidencia de inserciones cerca de este gen. Lo hace sin embargo alusión a la posibilidad de que la activación de los
HBEGF
puede ser oncogénico en ratones FVB, pero no los ratones Balb /c.
Co-ocurrencia y la exclusividad mutua entre IIC
nuestro análisis de los sitios de inserción comunes produjo varias novedades, pero rara vez etiquetada loci. Se analizaron los patrones de inserción para todos IIC a través de todos los tumores para establecer relaciones entre los patrones de inserción en estos IIC. Las inserciones pueden exhibir un patrón de integración mutuamente excluyentes, lo que podría significar la redundancia funcional entre los genes diana como se ha demostrado por
Myc
y su paralog
N-myc
[33]. Por el contrario, las inserciones concurrentes se pueden observar en los casos en que el efecto oncogénico de ambas inserciones es sinérgica. Para identificar este tipo de relaciones funcionales, se determinó la co-ocurrencia y la exclusividad mutua entre la IIC estadísticamente significativa en nuestro estudio como se describe en la sección Métodos (Figura 3).
IIC se indican por su gen diana mano curada. bordes rojos indican una relación de co-ocurrencia, mientras que los bordes verdes indican una relación mutuamente excluyentes. El número en paréntesis y el tamaño de los nodos indican el número de tumores con una inserción viral en la CEI pertinentes. El espesor de los bordes es una medida de la importancia de la relación entre los nodos.
Varias observaciones se pueden hacer de este análisis. En primer lugar, co-ocurrencia significativa se produce principalmente entre las inserciones poco frecuentes y la exclusividad mutua principalmente entre las inserciones altamente frecuentes. Este sesgo es más probablemente debido a la forma de las pruebas, que es de poca potencia para las frecuencias de inserción baja. Infrecuentes, inserciones mutuamente excluyentes necesitan un tamaño de muestra más grande para llegar a ser significativo, mientras que, inserciones concurrentes poco frecuentes pueden convertirse rápidamente significativa.
En segundo lugar, se encontraron relaciones interesantes entre los miembros de la
FGF
familia de ligandos y sus receptores, los
FGFR
genes. Por ejemplo, el FGFR ligandos FGF8 y FGF3 parecen tener una preferencia recíproca para el receptor FGFR1, ya que
Fgf3
inserciones son mutuamente excluyentes con
FGFR1
inserciones, mientras que
Fgf8
inserciones significativamente co-ocurrir con
FGFR1
inserciones. Esto podría indicar socios preferenciales de unión para los diferentes ligandos y una ventaja selectiva para la regulación tanto del ligando y su receptor emparejado.
Por último, se observó la exclusividad mutua entre los miembros de las familias de genes individuales (por ejemplo,
Wnt
genes y
FGF-HBEGF
genes). Trazado de patrones de inserción acumulados durante cinco familias distintas de los genes de la CEI (
Wnt
,
FGF /EGF
,
FGFR
,
RSPO
y
PDGFR
) reveló un patrón de integración mutuamente excluyentes típico de genes dentro de cada familia (Figura 4), lo que demuestra que las células infectadas MMTV obtienen poca o ninguna ventaja selectiva de MMTV inserciones cerca de múltiples miembros de la misma familia de genes. Sobre la base de estos resultados, decidimos buscar relaciones entre las familias de genes CIS en lugar de genes individuales de la CEI.
Para cada una de las cinco familias columnas indican qué tumores contenían una inserción de ese miembro específico de una familia. Las filas indican tumores específicos.
Modelo de MMTV progresión tumoral
Nuestros datos muestran que MMTV se dirige preferentemente un grupo bastante limitado de genes y familias de genes. Si nos limitamos a los genes de la CEI y las familias de la CEI que se ven afectados por las inserciones de MMTV en diez o más tumores, nos quedamos con sólo 11 grupos de genes de la CEI (Tabla 2). Estábamos interesados en ver si podíamos encontrar una diferencia en la clonalidad entre estos grupos de genes. Al comparar las inserciones cerca de dos miembros de estos grupos dentro de un tumor, el que tiene más inserciones clonales también tendrá una puntuación más alta clonalidad basado en los recuentos de LPs únicas. Esto podría indicar un evento anterior y /o un golpe más potente que resulta en la selección positiva más fuerte. Pusimos a prueba de los 11 grupos de genes de la CEI todos los pares de inserciones que se produjeron en el mismo tumor con el fin de comprobar si los miembros de un grupo tienen una forma consistente las puntuaciones más altas de clonalidad que los miembros de otro grupo, cuando se co-mutado en el mismo tumor (ver métodos para más detalles).
la figura 5a muestra un mapa de calor con los pares de genes /de la familia de la CEI que tenían una relación clonalidad significativa según la prueba binominal. Este análisis revela relaciones significativas entre el
Wnt /FGF
familias de genes (mayor de clonalidad) y
RSPO
,
Sfmbt2
,
PDGFR
,
FGFR
,
IRS4
,
Eras Opiniones y
Map3k8 gratis (menor clonalidad). En la Figura 5b visualizamos sólo estas relaciones significativas, junto con su direccionalidad. A partir de este modelo impulsado por los datos que podemos formular un modelo de progresión simple para ratón inducida por MMTV tumorigénesis mamaria. integraciones MMTV tumorales iniciadoras son más probable que ocurra cerca de un
FGF
o
Wnt
gen, mientras que las inserciones cerca de otros genes de la CEI son eventos secundarios. Para probar todas las otras relaciones o bien no hay relación clara clonalidad o no hay tumores en los que se co-mutado. En los 47 tumores que mostraron co-mutación de
FGF
y su receptor
FGFR
, el
FGF
inserción fue más clonal, lo que demuestra que el ligando FGF siempre se activa antes que el receptor de FGF durante la progresión tumoral MMTV.
A. Un mapa de calor de todas las combinaciones de las familias de genes y los genes individuales no asignado a ninguna familia. diferencia significativa en la clonalidad para cada familia se calcula utilizando una prueba binominal para todas las muestras que son co-insertan en ese gen específico (familia) par. cuadrados azules indican una relación clonal significativa del grupo indicado en el eje Y al grupo indicado en el eje X. cuadrados amarillas indican una relación clonal significativa desde el eje X al eje Y. Los cuadrados negros indican ninguna relación significativa. B. Una vista de red del mapa de calor en A. mostrando sólo significativa (P & lt; 0,05) las relaciones de clonalidad. Una puntos del borde del gen más clonal (familia) con el gen clonal menor (familia). El espesor de un borde es una medida de la importancia de la relación clonalidad. Para la fracción que aparece en los bordes, el numerador representa el número de veces que el nodo padre tuvo una puntuación clonalidad superior, mientras que el denominador representa el número de veces que el nodo hijo tenía una puntuación clonalidad superior, en un tumor que contenía inserciones en ambos nodos.
Discusión
los estudios recientes han profundizado en la heterogénea composición de tumores humanos [2], [3] que muestran que una constante acumulación de mutaciones fondo cubre el hecho de que sólo una puñado de mutaciones de conducción provoca la diferenciación oncogénico. Utilizando el sistema de ratón, hemos sido capaces de definir claramente los genes controlador para tumores mamarios inducidos-MMTV y el orden en que se consiguen desregulados.
MMTV mutagénesis de inserción
En este estudio se analizó una gran cohorte de ratones que desarrollaron tumores a través de MMTV mutagénesis de inserción. Dentro de un conjunto de datos de 6600 no MMTV fondo inserciones de 600 tumores, se identificaron 30 sitios de inserción comunes que abarcan 1.271 de las 6.600 inserciones (19,3%). Se utilizó este conjunto de datos para hacer frente a varias preguntas relacionadas con el MMTV inducida por la tumorigénesis mamaria de ratón. En primer lugar, queríamos ver si podíamos identificar nuevos MMTV IIC en este gran conjunto de datos utilizando nuestro enfoque de alto rendimiento Shear-Splink. Se encontró que el 30 MMTV IIC se dirigen a un número limitado de familias de genes bien definidos y muy pocos otros genes. En total, 53 MMTV IIC han sido identificados previamente (Tabla S1). El solapamiento entre esta lista de MMTV conocido CISS y nuestra lista es sólo el 18 IIC. Esto significa que el 66% de la CISS encontrado previamente no pudo ser confirmada en este estudio. Aunque es posible que los CIS con inserciones muy subclonales no son detectados por nuestro método Shear-Splink, creemos que nuestro estudio es a la vez menos sesgada (mediante el uso de ADN cizallamiento en lugar de escisión por enzimas de restricción) y más robusto (ya que medimos muchos lee de la misma inserción) que los estudios más antiguos basados en el aislamiento y secuenciación de Sanger de sitios de inserción individuales MMTV. Además, el uso de la puntuación del LP para filtrar las inserciones de fondo de los datos es un poderoso método para limitar los resultados positivos falsos. Si bien es posible que nuestro método genera falsos negativos, es quizás más probable que una parte de la CISS previamente identificados son pasajeros o de los sitios de integración al azar. Nuestros datos sugieren que inducida por MMTV tumorigénesis mamaria es una enfermedad muy específica que implica un número limitado de genes diana celular que pueden promover la proliferación, la supervivencia y /o auto-renovación de las células epiteliales mamarias infectadas con el MMTV. Como tal, MMTV no es un sistema de mutagénesis de inserción muy flexible y por lo tanto probablemente no es el mejor enfoque para identificar nuevos genes de cáncer de candidato de mama en ratones de tipo salvaje o modelos GEM predispuesto-tumorales. Esta idea es apoyada por el hecho de que no podemos encontrar inserciones específicas en ratones MMTV-tumoral mamaria propensos a heterocigóticos
PTEN
supresión o específico de tejido pérdida de
Trp53
, a pesar de que infectaron-MMTV
PTEN
ratones heterocigotos desarrollado tumores mamarios más rápido que sus homólogos de tipo salvaje. tumorigénesis inducida por MMTV aparentemente beneficia de haploinsuficiencia para
PTEN
pero la mutación de colaboradores específicos no se requerirá para esta condición. Nuestros resultados no descartan que MMTV podría mostrar un patrón de inserción diferente en ratones con la glándula específica sobreexpresión de un oncogén fuerte mamaria.
A pesar de la fuerte tendencia de MMTV hacia la activación de miembros de la familia Wnt /FGF, aún pudimos identificar varias novedades CIS para MMTV, debido al gran número de muestras que incluimos en nuestro análisis. Algunas de las nuevas IIC caen dentro de las familias de genes diana establecidos, mostrando que nuestro método es capaz de identificar los verdaderos positivos, incluso si sólo se producen en & lt; 1% de las muestras, como es el caso de
Fgfr3
.