Extracto
Los informes recientes han sugerido que varios factores como la genética del huésped, el medio ambiente y la dieta pueden promover la progresión de la mucosa sana hacia el carcinoma colorrectal esporádico. La evidencia acumulada ha asociado, además, las bacterias intestinales con la enfermedad de iniciación y progresión. Con el fin de examinar y analizar la composición de la microbiota intestinal en ausencia de influencias de confusión, hemos establecido un modelo animal de 1, 2-dimetilhidrazina (DMH) inducida por el cáncer de colon. Utilizando este modelo, hemos realizado pirosecuenciación de la región V3 de los genes 16S rRNA en este estudio para determinar la diversidad y la amplitud de las especies microbianas intestinales. Nuestros resultados indican que la composición microbiana de la luz intestinal difiere significativamente entre los grupos de control y tumorales. La abundancia de Firmicutes fue elevado mientras que la abundancia de Bacteroidetes y espiroquetas se redujo en el lumen de las ratas de CRC. Fusobacteria no se detectó en ninguna de las ratas sanas y no hubo diferencia significativa en las especies Proteobacteria observados al comparar las comunidades bacterianas entre los dos grupos. Curiosamente, la abundancia de Proteobacteria fue mayor en las ratas de CRC. A nivel de género,
Bacteroides
mostraron una abundancia relativamente mayor en las ratas CRC en comparación con los controles (14,92% frente a 9,22%,
p Hotel & lt; 0,001). Mientras tanto,
Prevotella gratis (55,22% frente a 26,19%),
Lactobacillus gratis (3,71% vs. 2,32%) y
Treponema gratis (3,04% vs. 2,43%), se encontró que eran significativamente más abundantes en las ratas sanas que las ratas de CRC (
p
& lt; 0,001, respectivamente). También demuestran una reducción significativa de las bacterias productoras de butirato como
Roseburia
y
Eubacterium Hoteles en la microbiota intestinal de ratas CRC. Por otra parte, un aumento significativo en
Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae
y
Fusobacterium
también se observó en el grupo del tumor. Una disminución de las especies probióticas tales como
La cepa de R.
y
Lactobacillus
se observó también en el grupo del tumor. En conjunto, se puede concluir que existe una diferencia significativa en la flora bacteriana intestinal entre las ratas sanas y ratas CRC
Visto:. Zhu Q, Z Jin, Wu W, R Gao, Guo B, Gao Z, et al. (2014) Análisis de la Intestinal Lumen Microbiota en un modelo animal de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10.1371 /journal.pone.0090849
Editor: Georgina L. Hold, Universidad de Aberdeen, Reino Unido
Recibido: Diciembre 10, 2013; Aceptado 30 de enero de 2014; Publicado: 6 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia natural de China (Nº 81230057). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, aproximadamente 1,2 millones de personas son diagnosticadas con cáncer colorrectal (CCR) en todo el mundo [1]. CRC es el tercer cáncer más común en hombres y la segunda más común en las mujeres con la mayoría de los casos se producen en el mundo desarrollado. Existe una comunidad celular complejo dentro de un tumor maligno. Esta comunidad estaba constituido por células oncogénicamente transformadas, células no neoplásicas como estromales y células del sistema inmune, y los microbios tales como bacterias y virus en algunos casos [2]. Muchos tipos de cáncer están asociados con agentes infecciosos y estos tipos de cáncer tienden a ocurrir en los tejidos de las mucosas que tienen alto nivel de exposición a los microbios. Algunos creen que hasta una quinta parte de todos los cánceres son causados o promovido por agentes infecciosos [3]. Por ejemplo, el cáncer de cuello uterino y cáncer gástrico pueden ser causadas por los virus del papiloma humanos y la bacteria,
Helicobacter pylori
, respectivamente [4].
Se evalúa que el número total de células de diferentes especies de bacterias en el tracto gastrointestinal humano es 10
14, que es más de 10 veces el número de células humanas eucariotas [5] y tal vez hasta 10 veces más virus. En un intestino sano, la flora bacteriana normal mantiene la homeostasis con la acogida [6]. Sin embargo, los cambios en las poblaciones de bacterias y sus productos metabólicos se han relacionado con varias enfermedades, incluyendo colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y la CRC [7] - [9]. Y cada vez hay más informes de que la microbiota intestinal juega un papel importante en el desarrollo de la carcinogénesis de colon [10]. Por ejemplo, en estudios de modelos animales, se encontró que los ratones mutantes que son genéticamente susceptibles a la CRC para desarrollar significativamente menos tumores cuando se mantiene en ambientes libres de gérmenes [11]. Wei y sus colegas determinaron los cambios en la estructura de la microbiota intestinal de ratas en desarrollo precancerosas lesiones de la mucosa inducida por carcinógeno tratamiento DMH, y demostraron que la abundancia de
La cepa de R.
-como y
Allobaculum
-como bacterias eran aumento en las heces de las ratas tratadas con DMH [12]. Moore y sus compañeros de trabajo también informaron que 15 especies bacterianas de la flora fecal humanos se asociaron significativamente con un alto riesgo de cáncer de colon y 5 se asociaron con bajo riesgo de cáncer de colon [13]. Además, Bacteroides y Bifidobacterium fueron más fuertemente asociados con un mayor riesgo en su estudio de los caucásicos, japoneses, de Hawai, y los pacientes africanos. Estos estudios demostraron de manera preliminar que había una estrecha relación entre la microbiota intestinal y el desarrollo de CCR [13]. Sin embargo, ninguna de las especies bacterianas individuales claras fueron identificados como factores de riesgo para CRC ya que aproximadamente 80% de las bacterias humanos se consideraron no cultivable [14]. Para superar este problema e investigar la diversidad microbiana, los investigadores han recurrido al campo de la metagenómica [15]. En 2011, había cuatro mapas de alta resolución hace referencia a la relación entre la disbiosis colon humano y el CRC surgieron en la serie, que informó por tres grupos independientes [2], [8], [16], y se encontraron varias especies bacterianas ser preferentemente habitar cualquiera de los tejidos tumorales o tejidos no tumorales circundantes. El enriquecimiento de
Fusobacterium spp.
En las muestras tumorales fue sorprendentemente similar con esos microbioma CRC documentados. En particular, un aislado de Fusobacteria (CC53), fue demostrado que tiene capacidad de invasión de (2-Caco) células [16] cultivaron colon adenocarcinoma-2. Estos estudios también reportaron una abundancia relativa de
Bacteroidaceae
,
Streptococcaceae
,
Fusobacteriaceae
,
Peptostreptococcaceae
,
Veillonellaceae
, y
Pasteurellaceae Hoteles en tejidos cancerosos en comparación con el lumen intestinal normal [17]. Además, con el fin de establecer disbiosis relacionada con el cáncer colorrectal, Sobhani
et al
. investigó la microbiota fecal de pacientes normales y el cáncer de colon mediante pirosecuenciación y posterior análisis de componentes principales (PCA) [18]. Y ellos detectan un cambio en la composición de la microbiota intestinal de los pacientes con CCR. En particular,
Bacteroides
y
Prevotella
especies resultaron ser más abundante en los pacientes con cáncer que en los sujetos de control. Tomados en conjunto, estos estudios demostraron que la microbiota intestinal podría desempeñar un papel importante en el desarrollo de CRC
genética del huésped, el medio ambiente y la dieta tienen un efecto dramático en la microbiota gran cantidad de personas de diferentes países [19] -. [20 ]. Por lo tanto, se puede observar que existe una variación en la composición de la microbiota intestinal que conducen a asociaciones clínicas entre infección bacteriana y CRC. En este estudio hemos establecido un modelo animal de 1,2-dimetilhidrazina (DMH) cáncer de colon inducida y realizado pirosecuenciación de genes 16S rRNA para comparar la microbiota en el lumen intestinal de ratas CRC y controles sanos. Hemos identificado adicionalmente filotipos bacterianas que pueden servir como biomarcadores potenciales en el desarrollo de CCR.
Materiales y Métodos
Animales y Reactivos
Cuatro semanas de edad ratas Wistar machos (180 -200 g) adquirido de Shanghai chillido del animal de laboratorio Corporation (Shanghai, china) se utilizaron para este estudio. Todos los animales fueron alojados en jaulas de plástico (con cuatro o cinco ratas /jaula) en condiciones controladas de humedad (44 ± 5%), luz (12 h luz /oscuridad ciclo) y temperatura (22 ± 2 ° C). 1, 2-dimetilhidrazina (DMH) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). DMH estaba preparado fresco antes de su uso en 1 mM EDTA-solución salina y el pH se ajustó a 7,0 usando NaOH diluido solución.
Procedimientos experimentales
Cuarenta 4 semanas de edad, ratas Wistar machos se dividieron en dos grupos : un grupo-tumor inducida DMH (TG, n = 30) y un grupo de tumores no inducido por DMH (grupo de control, CG, n = 10). Los animales se aclimataron a la dieta para roedores y agua
ad libitum
durante 1 semana. Después de la aclimatación, las ratas de TG fueron por vía intraperitoneal (i.p.) inyectados con DMH (40 mg /kg) una vez a la semana durante 10 semanas consecutivas. Las 10 ratas restantes fueron inyectados por vía intraperitoneal con EDTA - solución salina normal como controles. Los pesos de los animales se registraron una vez a la semana durante todo el período experimental. Comenzando en la semana 12 del protocolo, tres ratas se sacrificaron cada 2 semanas con el fin de examinar la formación de tumores de colon. Los animales se anestesiaron con ketamina 100 mg /kg y xilazina 15 mg /kg de peso corporal i.p. bajo condiciones asépticas. todo el colon se extirpó quirúrgicamente y se abrió longitudinalmente. Las muestras de heces se recogieron y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras de heces se transfirieron después a -80 ° C hasta que se realizó la extracción de ADN. El colon fue fotografiado y se contó el número total de tumores. Para el análisis histológico, los tumores de colon fueron extirpados por separado y se fijaron en formalina al 10% tamponada con fosfato neutro.
Examen histológico
En el examen histológico, los tejidos fijados se incrustaron y seccionaron a 5 micras intervalos. El tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina estándar para su examen al microscopio óptico. Las secciones de tejido fueron revisados por dos patólogos independientes de una manera ciega. Cualquier discrepancia entre estos dos investigadores se resolvió a través de la reevaluación por el tercer patólogo hasta que se alcanzó un consenso de opinión.
ADN bacteriano de extracción
Los ácidos nucleicos se extrajeron de cada muestra de heces utilizando un método modificado de las directrices del fabricante para el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La cantidad de ADN se determinó por Synergy 2 Multi-Mode lector de microplacas (BioTek, US). La integridad y el tamaño del ADN se determinó mediante 1% (w /v) de electroforesis en gel de agarosa. Todas las muestras de ADN se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Tubos que contienen sólo las heces Mini Kit controles de extracción de ADN QIAamp se incluyeron en todos los pasos de lisis y PCR para servir como controles negativos
PCR y 454 Pyrosequencing
Los siguientes cebadores universales 16S ARN ribosomal:. ( 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ', 533R: 5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3') corresponden a las posiciones V3 del gen 16S rRNA, con una secuencia de muestra de código de barras y los adaptadores FLX Tianium fueron utilizados para amplificar la región V3 de cada muestra fecal por reacción en cadena de la polimerasa. PCR se realizó con la plantilla 10 ng, 0,4 l FastPfu polimerasa (transgén Biotech, China), 4 l 5 x tampón de FastPfu, 2 dNTPs mu l (2,5 mM cada uno, Takara Bio, Japón), 0,4 l cebadores directos (5 mM) y 0,4 l atrás primers (5 mM) en un ABI GeneAmp® 9700 termociclador. Los parámetros de ciclación fueron los siguientes: 5 min de desnaturalización a 95 ° C seguido de 25 ciclos de 30 segundos a 95 ° C (desnaturalización), 30 segundos para la hibridación a 55 ° C y 30 segundos a 72 ° C (alargamiento), con una extensión final a 72 ° C durante 5 min. reacciones de PCR se realizaron por triplicado en cada muestra. Los productos amplificados a partir de muestras de heces se verificaron mediante electroforesis en gel con 5 l de la mezcla de reacción PCR en un gel de agarosa al 2,0%. Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción de AxyPrepDNA Gel (Axygen, US) y se cuantificaron en QuantiFluor ™ -ST fluorómetro (Promega, EE.UU.). Los productos de diferentes muestras se mezclaron en proporciones iguales para pirosecuenciación usando el Roche GS FLX 454 secuenciador de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Todo pirosecuenciación lee entonces fueron retirados de sus imprimaciones, códigos de barras, y secuencias adaptadoras, y se seleccionan más y se filtra de acuerdo con las normas de control de calidad de la siguiente manera: la eliminación de secuencias que no coincida perfectamente con el cebador de PCR proximal (más de dos desajustes a los cebadores), aquellos con una longitud de la secuencia corta (menos de 200 nt) secuencias que contenía repeticiones de mononucleótidos de 6 nt, secuencias con personajes ambiguos, o secuencias con una calidad de lectura score & lt; 25. Por último, se produjeron un total de 197,911 secuencias de mayor calidad de las veinte muestras, lo que representó el 62,9% de las secuencias válidas de acuerdo con el filtrado barcode- y el cebador de secuencia.
Análisis bioinformático de los datos en secuencia
Las secuencias fueron alineadas utilizando la base de datos SILVA (http://www.arb-silva.de/), y la delimitación de las unidades taxonómicas operacionales (Otus) se llevó a cabo con Mothur al 97% de corte de acuerdo a sus distancias por parejas. A continuación, se realizó el análisis de la cobertura de la Buena, estimadores de diversidad (Shannon y Simpson), estimadores de riqueza (Chao1 y ACE), y la curva de rarefacción utilizando el paquete de software Mothur (http://www.mothur.org/wiki/Main_Page) a el nivel de confianza del 80% [21]. El mapa de calor se construyó en la información del género con la función de mapa de calor 2 en el paquete R vegetariana. Además, las similitudes Bray-Curtis se utilizaron para construir un dendrograma clúster. También se realizó el análisis de métricas de distancia sin ponderar UniFrac usando UOT de cada muestra, y se realizó el análisis de componentes principales en términos de la matriz de distancia. Un enfoque de descubrimiento de biomarcadores metagenómica se empleó con lefse [análisis discriminante lineal (LDA) junto con la medición del tamaño del efecto], que lleva a cabo una prueba no paramétrica de Wilcoxon suma de rangos LDA seguido de un análisis utilizando el software en línea (http://huttenhower.sph.harvard.edu /Galaxy /) para evaluar la magnitud del efecto de cada taxón diferencialmente abundante [22].
Análisis estadístico
el
t
prueba de Mann-Whitney-test y se llevaron a cabo utilizando SPSS versión 19.0 para Windows.
Declaración de Ética
el protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales y el Comité de Ética de la sexta Personas hospital afiliado a la Universidad de Shanghai Jiao Tong.
Acceso a datos
la información de la secuencia 16S generada en este estudio ha sido presentado a la Leer archivo de secuencias NCBI bajo el número de SRA098098.
resultados
Animal los modelos y la formación de tumores
de acuerdo con el protocolo experimental (Figura 1A), se practicó la eutanasia tres ratas tratadas con DMH cada dos semanas a partir de la semana 12. Adenoma se encontró por primera vez en la semana 12 en uno de los tres animales sacrificados. La mayoría de los adenomas, sin embargo, se encontró que entre el 14 y 18 semanas (7/9). Por desgracia, dos ratas tratadas con DMH murieron en la semana 19 de la obstrucción de colon y la caquexia. En las muestras de la semana 20, se encontró que dos ratas demostraron adenocarcinoma (2/3) con adenoma de vez en cuando en el tejido. Como resultado, decidimos eutanasia el resto de las ratas tratadas con DMH así como aquellos pertenecen al grupo de control en la semana 22 con el fin de mantener el ciclo de vida de las ratas en concordancia. En la necropsia, se encontró patológicamente confirmado adenocarcinoma de colon inducida con éxito en once ratas tratadas con DMH (11/13) sin evidencia de metástasis de órganos. Las dos ratas restantes muestran ningún signo de formación de tumores. Sin embargo, uno de los animales se encontró que tenía una obstrucción de colon incompleta, por lo tanto, sólo diez ratas tratadas con DMH se incluyeron en nuestro grupo de estudio final. Mientras tanto, todas las ratas del grupo de control sobrevivieron a la semana 22. El peso corporal promedio de los diez ratas tratadas con DMH seleccionados fue 343,5 ± 10,74 gy 359,3 ± 7,61 g en los animales de control sin significación estadística (
p = 0,59
). Los detalles de los tumores inducidos por DMH se resumen en la Tabla 1 y se muestran en la Figura 1B-G.
(A) Los procedimientos experimentales. (B) de colon normal. (C) Adenoma (flecha blanca). (D) Adencarcinoma (flecha amarilla). La mancha de sangre alrededor del tumor fue causado por la úlcera tumor en lugar de nuestra disección. fotomicrografías representativas que muestran la mucosa normal (E), adenoma (F) y el adenocarcinoma (G) se magnifican en 40 × (izquierda), y cada uno de los micrografía derecha (400x) destacaron el distrito del rectángulo verde correspondiente.
Características de los 454 pirosecuenciación
En total, 314,880 secuencias válidas se obtuvieron a partir de las 20 muestras, con un promedio de 15.744 secuencias por muestra. Las secuencias resultantes se procesaron utilizando Seqcln (http://sourceforge.net/projects/seqclean/) y Mothor [23]. Después de la eliminación de secuencias de baja calidad (& lt; Q25) y secuencias más cortas de 200 pb, con homopolímeros de más de seis nucleótidos, y que contiene base de las llamadas ambiguas o secuencias de cebadores incorrectos, un total de 197,911 secuencias de alta calidad se produce con una longitud media de 481 pe por secuencia. Las secuencias fueron alineadas contra la base de datos Silva (versión SSU111: http://www.arb-silva.de/) usando la búsqueda k-mer (http://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Potencialmente se detectaron secuencias quiméricas usando UCHIME (http://drive5.com/uchime) y eliminado. El restante lecturas fueron pre-clúster (http://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) y luego se agrupan por parejas utilizando el algoritmo sin corregir. Las características detalladas de cada muestra se encuentran en la Tabla 2. Además, las unidades taxonómicas operacionales se definieron como el intercambio de & gt; 97% de identidad de secuencia utilizando el método de vecino más lejano (http://www.mothur.org/wiki/Cluster). El número total de UOT a nivel de similitud del 97% era de 41.923, con un promedio de 2.096 UOT por muestra.
El valor medio de la cobertura es bueno para cada grupo fue de más del 80%, lo que indica que el 16S rRNA secuencias identificadas en los dos grupos representan la mayoría de las bacterias presentes en las muestras de estudio. Mientras que no se observó la meseta de la curva de refracción (Figura S1 A) con la secuencia actual, las estimaciones de diversidad de Shannon de todas las muestras ya habían alcanzado valores estables a esta profundidad secuenciación, lo que sugiere que, si bien se espera que la identificación de nuevos filotipos a partir de la secuenciación adicional, la gama de diversidad dentro de las muestras había sido capturado (Figura S1 B, C, D). Se observaron diferencias estadísticamente significativas en los índices de Shannon entre el grupo del tumor y el grupo control (5,92 ± 0,30 vs. 6,17 ± 0,20,
p = 0,042
, figura S1E). Las diferencias demuestran que la diversidad más alta se pudo encontrar en el lumen intestinal no cancerosas de las ratas del grupo de control que se confirma por el índice de diversidad de Simpson (0,024 ± 0,013 vs 0,013 ± 0,007,
p = 0,037
, figura S1F). Los estimadores de riqueza de la comunidad (Chao1 y ACE) y las características detalladas de cada muestra se muestran en la Tabla S1.
Comparación de la microbiota intestinal entre el grupo control y el grupo del tumor
La microflora y las composiciones de dos se analizaron los grupos y se comparan a través de la abundancia relativa de UOT mediante el uso de la matriz no ponderado distancia UniFrac para cada grupo. Los resultados posteriores de la ACP mostraron que no había diferencias significativas en la composición de la comunidad bacteriana entre las ratas sanas y ratas CRC utilizando los primeros dos principales puntuaciones de los componentes de PC1 y PC2 (31.32% y el 20,4% de la varianza explicada, respectivamente) (Figura 2). Además, lefse se realizó para obtener la representación cladograma y las bacterias predominantes de la microbiota dentro de los dos grupos, que se muestra en la Figura 3A. También puso de manifiesto las mayores diferencias en los taxones entre las dos comunidades en la figura 3B.
Peptostreptococcaceae
,
Erysipelotrichales
,
coriobacteriaceae
y
Porphyromonadaceae
se enriquece en ratas CRC, mientras que
Roseburia
y
Prevotella
fueron enriquecidos en ratas sanas, todos los cuales eran filotipos clave que participan en la segregación de la microbiota intestinal en ratas sanas CRC y de acuerdo con el análisis de Lefse.
Cada símbolo representa una muestra. Los círculos rojos representan ratas sanas; círculos azules representan ratas CRC.
(A) Representación taxonómica de estadística y biológicamente diferencias consistentes entre ratas sanas y ratas CRC. Las diferencias están representados por el color de la clase más abundante (rojo indicando grupo control, grupo tumor verde y amarillo no significativa). El diámetro del diámetro de cada círculo es proporcional a la abundancia del taxón. (B) Histograma de las puntuaciones de LDA diferencialmente abundantes géneros. Cladograma se calcula lefse, y se muestra de acuerdo con la magnitud del efecto.
Las comparaciones de microbiota intestinal a diferentes niveles entre ratas sanas y ratas CRC
Se estudiaron las comunidades bacterianas en las heces de la lumen intestinal de ratas con o sin CRC. La diferente phyla y géneros fueron evaluados por asignación taxonómica de todas las secuencias y la composición microbiana global de cada grupo en el nivel de phylum se muestra en la Figura 4A, B. De acuerdo con los resultados taxonómicos, hemos demostrado que Bacteroidetes, representando el 79,26% y 63,95 % de la microbiota intestinal en ratas sanas y de CRC, respectivamente, fue el phylum más predominante en nuestro estudio. Y Firmicutes eran el filo secundario con la proporción de 15,14% y 29,55%, respectivamente. Por último, espiroquetas y Proteobacteria constituían la tercera filos más abundante, contribuyendo 3,04% y 1,06% en las ratas sanas, y el 2,44% y el 2,95% en ratas CRC, respectivamente. La composición de los filos desequilibrante se muestra en la Tabla S2. Nos encontramos con que la composición microbiana muestra una gran variabilidad interindividual (Figura 4C). Firmicutes representaron el 3,39% -48,35%, y Bacteroidetes 43,24% -95,79% entre todos los animales individuales (Tabla 3). Excepto que, la abundancia de Bacteroidetes y cianobacterias fueron mayores en la microbiota intestinal de ratas sanas que en las ratas de CRC, y la diferencia mostró significación estadística (
p
= 0,044 y 0,003, respectivamente) (Figura S2A, B ). Considerando que, Firmicutes y Actinobacteria fueron significativamente menos abundantes de la microbiota en ratas sanas (
p = 0,01
y 0,035, respectivamente) (Figura S2C, D). A partir de nuestros datos no Fusobacteria se detectó en ninguna de las ratas sanas (Figura S2E) y no hubo ninguna diferencia significativa en Proteobacteria (
p
= 0,175) (Figura S2F) al comparar las comunidades bacterianas de los dos grupos, aunque su abundancia fue mayor en las ratas de CRC. También se realizaron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo del tumor y el grupo control en el ámbito familiar en nuestro estudio. Diferencia en la abundancia relativa de Bacteroidetes (11,6% frente a 4,6%,
p = 0,0029
), Rikenellaceae (3,71% frente a 1,47%,
p = 0,0008
), y Peptostreptococcaceae (9,18 % frente a 1,61%,
p = 0,046
) fueron significativas entre las ratas CRC y ratas sanas, mientras que hubo un nivel extremadamente bajo de Prevotellaceae (31,91% frente a 62,88%,
p =
0,0027) y cianobacterias (0,3% frente a 0,82%,
p
= 0,003) en comparación con las ratas CRC ratas sanas.
(a), ratas sanas (ratas B) CRC. Histograma representa la abundancia relativa de phyla bacteriana en microbiota de cada muestra (C). "Otros" representa las bacterias no clasificados, Actinobacteria, cianobacterias, Deferribacteres, elusimicrobia, Fusobacterias y Tenericutes.
A nivel de género, se estudió la composición microbiana de cada muestra (Figura S3) y parecieron ser significativamente diferente entre los dos grupos. Los diez géneros más abundantes en el grupo de control fueron
Prevotella
,
Bacteroides
,
Lactobacillus
,
Treponema
,
Parabacteroides
,
Anaerovibrio
,
La cepa de R.
,
Roseburia
,
Oscillospira
y
Sutterella
. Sin embargo,
Prevotella
,
Bacteroides
,
Allobaculum
,
Treponema
,
Lactobacillus
,
Blautia
,
Parabacteroides
,
Paenibacillus
,
Anaerovibrio
y
Paraprevotella
fueron los diez géneros más abundantes en el grupo del tumor, de manera correspondiente (figura S4). Curiosamente, a pesar de
Prevotella
fue el género más abundante en ambos grupos, la abundancia de que era mucho mayor en las ratas sanas. Estadísticamente,
Bacteroides
, con más del 1% del total de bacterias en las heces, eran relativamente abundantes en ratas CRC. Destacan, géneros
Bacteroides. fragilis
se encuentra principalmente en ratas CRC. Mientras tanto,
Prevotella
,
Lactobacillus
y
Treponema
resultaron ser significativamente mayor en las ratas sanas que las ratas CRC (Figura 5). Géneros
Desulfovibrio
,
Clostridium
,
Actinobacillus
,
Succinatimonas
,
Dorea
,
Phascolarctobacterium
,
Parabacteroides
,
Bilophila
,
Paraprevotella
,
Helicobacter
y
Paenibacillus
baja abundancia exhibido; sin embargo, se enriquecieron todos estadísticamente en las heces de las ratas de CRC en comparación con las ratas sanas. Por otra parte, géneros
Roseburia, Eubacterium
y
La cepa de R.
se enriquece en el grupo de control, y
Fusobacterium
estuvo ausente de las ratas sanas. El mapa de calor del nivel de género bacteriano también demostró el mismo fenómeno (Figura S5). Las diferencias adicionales entre los dos grupos se pueden encontrar en la Tabla S3.
Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para evaluar la importancia de las comparaciones entre los grupos indicados.
Discusión
la población microbiana en el intestino es heterogéneo y complejo. roedores de laboratorio han sido fundamentales para ayudar a los investigadores a desentrañar las complejas interacciones que los mamíferos, incluidos los humanos, tienen con sus comensales microbianos [24]. Hemos utilizado un modelo animal común de CRC en este estudio para investigar la naturaleza de estructura de la comunidad microbiana en CRC en comparación con los animales sanos. Los estudios realizados en modelos animales posiblemente podrían tener implicaciones importantes relacionadas con la enfermedad humana [25].
En este estudio, se comparó la composición bacteriana de la luz intestinal de ratas entre grupo sano y el grupo CRC utilizando la plataforma de Roche 454 secuenciador. Hemos observado una diferenciación significativa de la microbiota intestinal entre las ratas sanas y ratas tratados con carcinógenos que desarrollaron carcinomas de colon. Mostramos una mayor abundancia relativa de Firmicutes, Proteobacteria y Actinobacteria en el lumen intestinal de ratas CRC, y aún más demostramos que Bacteroidetes fue menos abundante en este grupo. Este resultado está de acuerdo con hallazgos similares de Zhao
et al.
[26] a partir de estudios en humanos. Se ha informado de que las enfermedades inflamatorias del intestino tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se conocen factores de riesgo para el cáncer colorrectal, y se detectó una reducción significativa de los Bacteroidetes phylum en estas dos enfermedades por investigadores [27] - [28]. En estudios posteriores, también se detectaron alteraciones entre los géneros de este filo en nuestro estudio. Sobre todo, el hallazgo de que
B. fragilis
se incrementó en el lumen intestinal de ratas CRC.
Los estudios previos han sugerido que diferentes
Bacteroides
cepas pueden influir en la salud del huésped a través de su potencial colitogenic o probiótico. Waidmann y sus colegas habían descrito el aislado B. vulgates cepa con posibles propertites probióticas que fue capaz de mejorar E. coli desarrollo colitis inducida por un mecanismo aún desconocido en ratones de interleucina-2-deficiente [29]. Sin embargo, un comensal colon humano, enterotoxigénica
B. fragilis
se ha demostrado que la colonización de la misma en múltiples neoplasia intestinal ratones (min) podría dar lugar a un marcado aumento en el espesor del colon, la inflamación y tumores de colon visibles que acompañada por la activación de STAT3 y la infiltración de T
células inflamatorias H17 [30]. Estos resultados de la investigación están de acuerdo con nuestra conclusión de que
B. fragilis
sobraba en ratas CRC. Además, también se ha informado de Proteobacteria ser aumentado en la microbiota de los animales con colitis inducida experimentalmente y los pacientes que sufren de EII [31]. Puede ser que sea relevante con la interacción directa entre Proteobacteria y células intestinales a través de sistemas de secreción bacterianos tales como el sistema de secreción de tipo III (T3SS) [32]. Además, se ha informado de que Firmicutes a cabo la capacidad en la mejora de la obtención de energía de la dieta [33]. El filo Firmicutes contiene géneros relevantes, incluyendo
La cepa de R.
,
Clostridium
y los productores de butirato
Eubacterium
,
Faecalibacterium
y
Roseburia
[34]. El butirato es una importante fuente de energía para las células epiteliales del colon, a menudo se usan más que la glucosa o glutamina circulatorio. Hasta el 90% de butirato es metabolizado por colonocitos [35]. Aquí nos muestran la abundancia de la reducción de
Roseburia
y
Eubacterium Hoteles en la microbiota intestinal de ratas CRC. En dos estudios de intervención dietética, la densidad de población de
Roseburia
y
Eubacterium
fueron demostrado tener una fuerte correlación con las concentraciones de butirato fecal en respuesta a la oferta de hidratos de carbono alterado [36], lo que sugiere la importancia de
Roseburia
y
Eubacterium
en la producción de butirato en vivo. Sengupta
et al.
[37] indica que puede haber algunas pruebas de que la entrega de una cantidad adecuada de butirato a la mucosa intestinal puede proteger contra los primeros eventos tumorigénicas. Por lo tanto, el desequilibrio estructura en este documento juega un papel importante en la reducción de las bacterias productoras de butirato en el intestino de ratas de CRC.
Además, el desequilibrio estructura dentro de la microbiota intestinal de ratas CRC está significativamente relacionado con el aumento en múltiples patógenos potenciales y la disminución de las especies probióticas. Se ha demostrado que
Bacteroides
poblaciones y más concretamente los de
B. fragilis
producir una metaloproteasa conocido como fragilysin en pacientes con cáncer de colon, pero no en los controles. Este informe sugiere que esta subpoblación podría favorecer la carcinogénesis [38]. Además, el apretadas
Desulfovibrio
reduce sulfato para producir sulfuro de hidrógeno (H
2S), que se ha demostrado que es capaz de generar daños en el ADN que puede ser, en parte, responsable de la generación de la la inestabilidad genómica y las mutaciones acumuladas observadas en el cáncer colorrectal [39] - [40].