Extracto
En nuestros estudios de células de cáncer de ovario que hemos identificado subpoblaciones de células que están en una etapa transitoria híbrido E /M, es decir, células que expresan de forma simultánea marcadores epiteliales y mesenquimales. Las células E /M no son homogéneas, pero,
in vitro
y
in vivo
, contienen subconjuntos que se pueden distinguir sobre la base de una serie de características fenotípicas, incluyendo la localización subcelular de E-cadherina, y los niveles de expresión de Tie2, CD133 y CD44. Un subconjunto celular (E /M-MP) (membrana de E-cadherina
baja /citoplasmática E-cadherina
alta /CD133
alta, CD44
alta, Tie2
baja) está altamente enriquecido de células y muestra las características que forman tumores que generalmente se asocian con las células madre del cáncer. Nuestros datos sugieren que las células E /M-MP son capaces de diferenciarse en diferentes linajes, en determinadas condiciones, y tienen la capacidad de auto-renovación, es decir, para mantener un subconjunto de células indiferenciadas E /M-MP durante la diferenciación. Trans-diferenciación de las células E /M-MP en células mesenquimales o epiteliales se asocia con una pérdida de marcadores de células madre y la tumorigenicidad.
In vivo
el crecimiento del tumor de xenoinjerto es impulsado por las células E /M-MP, que dan lugar a las células epiteliales de cáncer de ovario. Por el contrario,
in vitro
, encontramos que las células E /M-MP se diferencian en células mesenquimales, en un proceso que involucra vías asociadas con una transición epitelio-mesenquimal. También se detectó la plasticidad fenotípica que era dependiente de factores externos como el estrés creado por el hambre o el contacto con cualquiera de las células epiteliales o mesenquimales en co-cultivos. Nuestro estudio proporciona una mejor comprensión de la complejidad fenotípica de cáncer de ovario y tiene implicaciones para el tratamiento del cáncer de ovario
Visto:. Strauss I, Li Z-Y, Liu Y, Beyer I, Persson J, Sova P, et al. (2011) Análisis de marcadores epiteliales y mesenquimales en cáncer de ovario revela heterogeneidad fenotípica y plasticidad. PLoS ONE 6 (1): e16186. doi: 10.1371 /journal.pone.0016186
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 27 Agosto, 2010; Aceptado: 13 de diciembre de 2010; Publicado: 14 Enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Strauss et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo con el apoyo de NIH subvenciones R01 CA080192, R01 HLA078836, y el Pacífico de Investigación del cáncer de ovario Consorcio /Programa Especializado de Excelencia en la Investigación en cáncer de Ovario de subvención CA83636 P50. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se ha sugerido que el tumor vuelva a crecimiento, así como resistencia a la quimioterapia y la metástasis, dependen de una pequeña subpoblación de células cancerosas dentro del tumor que se cree que representan células madre del cáncer (CSC). Una característica definitoria de las células madre, tanto en tejidos normales y malignos, es la capacidad de auto-renovación pero a la vez dar lugar a células hijas que están comprometidas con la diferenciación en fenotipos que los linajes menudo cruzan. Para lograr esto, las células madre pueden someterse a una división celular asimétrica por el que segregan factores determinantes del destino celular en sólo una de las dos células hijas [1]. En los mamíferos adultos, las células madre se han caracterizado por un número de tejidos, incluyendo el sistema de la sangre, sistema nervioso central, el músculo, colon, mama, y el hueso /cartílago.
Para las células madre de cáncer de tumores sólidos, tanto se puede aprender de los estudios de células madre hematopoyéticas (HSC) para los que se ha demostrado que el trasplante de una sola célula en un receptor mieloablación puede reconstruir todo el sistema sanguíneo. Este HSC definitiva da lugar a una jerarquía de progenitores pluripotentes que se restringen progresivamente en su potencial de diferenciación. La leucemia se cree que proceden tanto de las CMH que adquirieron los cambios genéticos o epigenéticos y se convirtieron en parte diferenciada y tumorigénico, o de progenitores que adquirieron la capacidad de auto-renovación [2]. La existencia de células madre para ciertos tipos de leucemia está fuertemente apoyado por el etiquetado lentiviral de células de leucemia mielógena aguda humana y la observación de los clones individuales presentes en los ratones NOD-SCID después del trasplante en serie de las células etiquetadas [3]. Los estudios de células madre de la leucemia también indicaron gran plasticidad fenotípica dependiendo de la etapa de crecimiento del tumor, microambiente del tumor, y los factores externos como el estrés creado por radio o quimioterapia [2].
La presencia de células madre cancerosas en tumores sólidos se ha propuesto para los cánceres humanos incluyendo cáncer de mama [4], el cerebro [5], colon [6], cabeza y cuello [7], de páncreas [8], de próstata [9], de ovario [10], [11], [12 ], y cáncer de piel [13]. Las células madre tumorales sólidos se han definido como "un pequeño subconjunto de células cancerosas dentro de un cáncer que constituyen una reserva de células autosostenibles con la capacidad exclusiva de auto-renovación y para hacer que los linajes heterogéneas de células cancerosas que componen el tumor" [ ,,,0],14]. Varios marcadores de la superficie celular, incluyendo CD24, CD44, CD133, CD166, EpCAM, o tinte ensayos de eflujo se han utilizado para clasificar poblaciones de células madre de cáncer putativo a partir de cultivos de tumor primario o suspensiones celulares obtenidas a partir de biopsias tumorales. Después del trasplante en ratones inmunodeficientes, los tumores se forman a partir de varios cientos de células de marcador positivo, mientras que para las células de marcador negativo se necesitan órdenes de magnitud mayor número para lograr la misma frecuencia de la formación de tumores (para una revisión: ver [15] Recientemente, usando. una técnica mejorada xenotrasplante, un estudio con células de melanoma humano mostró la formación de tumores después de la inoculación se hizo de una célula tumoral [16] y por lo tanto un paso importante hacia la prueba de la existencia de CSC.
Para la mayoría de los carcinomas, la progresión hacia la malignidad se acompaña de pérdida de diferenciación epitelial y un cambio hacia un fenotipo mesenquimal (EMT) [17]. EMT exacerba la motilidad e invasividad de muchos tipos de células y, a menudo se considera un requisito previo para la infiltración de tumor y la metástasis. EMT se caracteriza por el aumento de expresión de mesenquimales marcadores (vimentina, trombospondina, N-cadherina, vitronectina), aumento de la expresión de compuestos de matriz extracelular (colágeno IV y fibronectina), disminución de la expresión de marcadores epiteliales (e-cadherina, ocludina, desmoplakina, y Mucin1), la ubicación alterado de factores de transcripción ( β-catenina, Snail, Slug, Twist, Medias, 10 y NFkB) y la activación de quinasas (ERK1, ERK2, y PI3K /AKT) [17]. También hay numerosos ejemplos de carcinomas avanzados que muestran que las células mesenquimales pueden recuperar características de las células epiteliales, un proceso llamado mesenquimales del epitelio de transición (MET) [18]. Aparentemente, el fenotipo epitelial de las células cancerosas y la capacidad de formar barreras físicas representan un mecanismo que limita el acceso de los fármacos, anticuerpos, o las células inmunes a los sitios de tumores. Se ha especulado que tanto EMT y MET implican células en un estado metaestable híbrido, por ejemplo, células con características de ambas células epiteliales y mesenquimales [19].
Nuestros estudios se han centrado en el cáncer de ovario. El cáncer de ovario es el cuarto cáncer más común en las mujeres y tiene la mayor tasa de mortalidad de todos los cánceres del sistema reproductivo femenino. Aproximadamente el 90% de cáncer de ovario humano surge del epitelio superficial del ovario (OSE). El OSE normal de mesodermo derivado muestra características epiteliales y mesenquimales, que se caracteriza por la expresión tanto de la queratina y vimentina [20]. Curiosamente, sólo bajos niveles de E-cadherina son prominentes en OSE células [21] y su expresión está restringida a los quistes de inclusión y hendiduras profundas, notablemente a las zonas donde se cree que los eventos malignos que se produzca principios [22]. La integridad de las capas de OSE se mantiene principalmente por la N-cadherina, que destaca aún más el fenotipo epitelial /mesenquimales en este tejido [23], [24]. Se cree que las células de OSE adaptarse a los cambios en el microambiente celular por las transiciones entre epiteliales y mesenquimales etapas [20]. Tales habilidades son generalmente restringidos a inmadura, regeneración, o el epitelio neoplásico y por lo tanto hacen una plasticidad fenotípica única. Se cree que esta plasticidad está en el origen del cáncer de ovario. En particular, los carcinomas de ovario muestran una característica única en comparación con otros cánceres epiteliales derivada. Mientras que estos últimos se caracterizan por la pérdida de propiedades epiteliales durante la progresión tumoral, la expresión elevada de E-cadherina se observa para el epitelio ovárico neoplásica primaria [25]. Sin embargo, este cambio inicial hacia un fenotipo más diferenciado temprana en la progresión tumoral aparece a continuación, para ser seguido por una readquisición de características mesenquimales en los tumores de ovario más avanzados, que implica una pérdida secundaria de E-cadherina [26], [27], [28] . Curiosamente, el epitelio /fenotipo mesenquimal aparente en OSE células [29] también se encuentra en el frente invasivo de cáncer de colon [30] y el cáncer de mama [31], y en el tejido epidérmico normal durante la reparación de heridas [32].
En este estudio, hemos facilitar información de apoyo para una de las características clave de CSC, mediante la demostración de la pluripotencia, es decir, la capacidad de dar lugar a células hijas fenotípicamente heterogéneas. Nuestros datos sugieren que en células de cáncer de ovario estas características están íntimamente ligadas a los fenómenos de la EMT y MET.
Resultados
culturas de cáncer de ovario primarios contienen células madre cancerosas putativas
establecieron 51 culturas cáncer de ovario a partir de biopsias /ascitis de grado III y IV carcinomas (Tabla S1). Después de la digestión de las biopsias tumorales con colagenasa y tripsina, las suspensiones de células se cultivaron en Mamaria epiteliales basales medio suplementado con EGF, insulina, hidrocortisona, extracto de pituitaria bovina (MEGM) y 1-2% de FBS durante un máximo de 5 días. Con el fin de confirmar su potencial tumorigénico y para eliminar los fibroblastos y leucocitos, se inyectaron células primarias en la almohadilla de grasa mamaria de ratones inmunodeficientes SCID-beige (C.B-Igh-1b /GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7). Nueve cultivos primarios formados xenoinjertos de tumores después del trasplante de 1 × 10
6 células (véase el cuadro S1). Los xenoinjertos fueron luego extirpados, se digiere con proteasas y se cultivaron en MEGM con 10% de FBS. Para una cultura, se realizó xenoinjertos secundaria y terciaria. Secciones y suspensiones de biopsias originales fueron nombrados OVC-biopsia, ovc805-biopsia, etc; cultivos primarios derivados de biopsias de pacientes fueron nombrados ovc316-PC, ovc805-PC, etc; secciones o suspensiones tumorales de xenoinjertos de tumores derivados de cultivos primarios fueron nombrados ovc316-X, X-ovc805, etc; fueron nombrados cultivos derivados de xenoinjertos ovc316-XC, ovc805-XC, etc.
Los cultivos contenían diferentes tipos de células, con subconjuntos claramente diferenciados expresan diferentes marcadores de cáncer (por ejemplo, CA-125 o CEA), que era una reminiscencia de la la heterogeneidad de las células tumorales visto a partir del análisis de las secciones del tumor original o el xenoinjerto de tumor (Figura 1A, izquierda tres paneles). En particular, la heterogeneidad de las células tumorales fue menos pronunciado en líneas celulares de cáncer de ovario establecidos, como SKOV3-IP1 (Figura 1, panel derecho).
A) biopsias tumorales y cultivos primarios se tiñen positivo para los marcadores de cáncer de ovario CA-125 ( verde) y CEA (rojo) y muestran una heterogeneidad mayor que la línea celular establecida SKOV3-IP1. Se muestra son ovc316-biospy, ovc316-PC, y ovc316-X. Análisis de ovc1208-biopsia, ovc1208-PC, ovc0117-biopsia, ovc0117-PC, ovc100506-biopsia y ovc100506-PC reveló la misma heterogeneidad. B) La microscopía óptica de la cultura de ovario cáncer ovc316-XC. El cultivo contiene dos poblaciones distintas con respecto a la sensibilidad de tripsina. Panel izquierdo: se retira una cultura pasaje temprana sin tratar (izquierda), después de 10 minutos de tratamiento con tripsina (centro), y después de las células sensibles a la tripsina (derecha). Panel derecho: La formación de tumores después de un trasplante de resistente a tripsina (TR) y sensible a la tripsina células (TS) en ratones SCID-beige. La formación de tumores fue evaluada 3 meses después de la inoculación. TIC TR: 1/185, TIC TS: 1/109. Chi-cuadrado = 0,0524. análisis C) La inmunofluorescencia para un marcador mitocondrial humano específico (Mx), el CEA marcador de cáncer, el marcador epitelial E-cadherina, laminina y el marcador mesenquimal en cultivos clonales derivadas de ovc316-XC. cultivos clonales contienen células de cáncer humano, ya sea con epitelial (panel superior), mesenquimales (centro) o ambos fenotipos (E /clon híbrido M, inferior). D) la capacidad de formación de tumor en el postrasplante de 10
5 células E, M o E /M en ratones SCID-beige. La formación de tumores se evaluó 4 meses después de la inoculación. E) xenoinjertos de tumores derivados de clones híbridos de E /M. El origen humano de las células tumorales se muestra mediante la tinción para un marcador de mitocondria específico humano (verde). La tinción para el antígeno epitelial AE1 /3 y el antígeno tumoral CEA revela heterogeneidad fenotípica en los tumores que se derivan de clonal E culturas /M. La laminina-expresión está restringida a regiones vascularizadas. F) H & amp; E tinción de un xenotrasplante derivado de un ovc316 XC-E /M y el clon de una biopsia del paciente (ovc316-biopsia) que muestran que se asemejan a los xenoinjertos de la histología de los tumores humanos
In situ
. La barra de escala es 40μm.
Teniendo en cuenta la heterogeneidad fenotípica de cáncer de ovario, el objetivo de nuestro estudio fue aislar diferentes subconjuntos de células de cultivos primarios de cáncer de ovario y probarlos para los parámetros que se han asociado con el cáncer células, incluyendo la proliferación, la pluripotencia, y la tumorigenicidad madre. análisis de microscopía de luz de las culturas de xenoinjerto (por ejemplo ovc316-XC) revelaron subconjuntos epiteliales característicos que contenían células polimórficas, que también expresan grandes cantidades de la proteína de la matriz extracelular laminina en la interfase para que rodea las células no epiteliales. En la cultura de los subconjuntos celulares epiteliales mostraron una mayor resistencia a tratamiento con tripsina (Figura 1B). Nos separamos las células de los pasajes tempranos. (P & lt; 6) en dos fracciones en base a la resistencia a la tripsina, y probado se observó su tumorigenicidad en ratones SCID-beige, pero no hubo diferencias en la capacidad de formación de tumores (Figura 1B, panel derecho)
Como se ha hecho previamente en un estudio anterior que analizó la resistencia celular a adenovirus oncolíticos [33], establecimos 100 cultivos celulares clonales derivadas de células ovc316-XC principios de paso. Los clones se expandieron y se analizaron para los marcadores específicos de los humanos y de cáncer (para excluir la presencia de células estromales de ratón), así como del epitelio y marcadores mesenquimales (Figura 1C). Un total de 20% de los cultivos resultantes se limita a un fenotipo epitelial (E-cadherina positivo; "clon epitelial"), mientras que el 19% eran mesenquimales (laminina positivo "clon mesenquimales"). El 61% restante de cultivos clonales contenía tanto las células epiteliales y mesenquimales, además de las células que fueron positivas para ambos marcadores epiteliales y mesenquimales (Figura 1C). Llamamos a estas células epiteliales células híbridas /mesenquimales (E /M). epiteliales y mesenquimales cultivos clonales habían limitado a largo plazo potencial proliferativo (20-25 pasajes mesenquimales, 20-40 pasajes culturas epiteliales, respectivamente). Cabe destacar que, durante los pases, las células en uno de los 20 clones epiteliales pierden membrana de E-cadherina y claudin 7 y adquirieron la variante mesenquimales transcripción de p120 catenina [33], lo que indica que se sometió a un EMT (Figura S1).
Es importante destacar que sólo las culturas que contienen E /M células fueron capaces de formar tumores en ratones SCID-amarillento plazo de 4 meses cuando 10
se inyectaron células 5 (paso 6) (Figura 1D). Los tumores muestran heterogeneidad fenotípica, contenían estroma tumoral y se vascularizados (Figura 1E). En general, la histología de los tumores derivados de células clonal de E /M trasplantados fue similar a la del tumor del paciente (Figura 1F). trasplante de serie de células derivadas de estos tumores también dio lugar a nuevos tumores (datos no mostrados). Significativamente, este estudio muestra que una sola célula puede formar un clon que es posteriormente capaz de formar un tumor heterogéneo. Esto indica que la célula original era un cáncer de células madre potencial, con la capacidad de diferenciar, auto-renovación, y formar un tumor. Tomados en conjunto, estos datos muestran que los cultivos de cáncer de ovario primarios son fenotípicamente heterogéneo y que las células iniciadoras de tumores parecen tener rasgos de mesenquimales y células epiteliales (E /M).
Las células en la periferia de subconjuntos resistente a tripsina contener híbrido epitelio-mesenquimal (e /M) células que co-tinción con marcadores de células madre
Después de haber encontrado una posible relación entre los rasgos similares a células epiteliales y /mesenquimales madre del cáncer tumorigénico en cultivos clonales de ovc316-XC, se realizó el análisis de inmunofluorescencia de las culturas de cáncer de ovario primarios (derivadas de biopsias o xenoinjertos) con una serie de marcadores epiteliales y mesenquimales (Figura 2). Nos centramos nuestro análisis en las células que fueron aisladas de xenoinjertos y acababa (paso 0/1) o recientemente (pasajes 6-10) adaptadas al cultivo de tejidos, y contenía una gran proporción de subconjuntos resistente a tripsina. Estos subconjuntos teñidas positivas para marcadores epiteliales E-cadherina, claudin7 y EpCAM en las membranas celulares laterales (figuras 2A, B). Las células epiteliales que rodean subconjuntos fueron negativos para estos marcadores en sus membranas laterales y se tiñeron para proteínas mesenquimales vimentina y laminina. Un análisis más detallado de la E-cadherina reveló la diversidad fenotípica dentro de las culturas ovc316-XC. Se observaron dos tipos de células que se localizan E-cadherina a sus membranas, la membrana E-cadherina
alta y la membrana E-cadherina
baja (Figura 2A, panel inferior, inserte#2 y#3). Un tercer tipo de células adyacentes a la membrana de E-cadherina
pilas de gran contenidas claramente detectable E-cadherina en el citoplasma /núcleo (Figura 2A, panel inferior, inserte#2). Citoplasmática E-cadherina
pilas de gran también tiñe positivo para marcadores de células mesenquimales tales como la laminina, así como caldesmón-1 (un marcador mieloide), el endoteliales progenitoras endoteliales /marcadores CD31, y VCAM-1 (Figura S2A). E-cadherina
alta E /M-células también expresaron altos niveles del receptor Tie2 angiopoyetina (Figura S2A, paneles de la derecha). Cabe destacar que Tie2 es un marcador de células madre hematopoyéticas que también se encuentra en una serie de tumores epiteliales [34], [35].
A) Análisis de E-cadherina (verde) y laminina (rojo) en culturas cáncer de ovario. Ampliación de las zonas marcadas se muestra en la parte inferior: A1) E-cadherina
células negativas expresan laminina. A2) epitelial /mesenquimales (E /M) células híbridas: E-cadherina
baja células muestran la localización principalmente citoplasmática de E-cadherina y alta expresión de laminina. E-cadherina
pilas de gran contener niveles elevados de membrana E-cadherina y menores cantidades de laminina. A3) E-cadherina
células positivas tienen un tamaño celular y mantener el aumento de los niveles más bajos de claridad localizada en la membrana de E-cadherina que la E-cadherina
pilas de gran. la expresión de laminina es casi ausente en la E-cadherina
células positivas (panel superior derecho). B) Análisis para epitelial adicional (verde) y mesenquimales (rojo) marcadores confirma la existencia de células híbridas E /M en cultivos ovc316-XC. Epiteliales marcador
pilas de gran están en estrecha proximidad al marcador mesenquimal
pilas de gran y doble tinción positiva en las áreas que contienen esferas. En el lado izquierdo y el panel del medio, tenga en cuenta que todas las células son positivas para vimentina y CD44. C) CD133 marca las áreas que contienen E-cadherina
altas y E-cadherina
células bajas. D) E-cadherina
alta y E-cadherina
baja células muestran una fuerte co-etiquetado con los inductores de la EMT-Caracol, retorcer, y NGAL. La barra de escala es 40μm. Se muestran las imágenes de ovc316-XC. El análisis de inmunofluorescencia de ovc0117-PC, PC-ovc0122, ovc100506-XC y XC-ovc100728 reveló resultados similares.
Los cultivos en el paso 0/1 en general mostraron una mayor expresión global de marcadores epiteliales y mesenquimales que los cultivos en pasajes 6-10 y formadas 3 conglomerados de células /esferas tridimensionales que contienen células híbridas e /M en zonas altamente proliferativas (Figura 2B). La etapa E /M híbrido de células (dentro de las esferas) se confirmó mediante doble tinción con otros marcadores epiteliales (EpCAM, claudin7) y marcadores mesenquimales (N-cadherina, vimentina). Además, las esferas se tiñeron para EpCAM y el marcador de células madre mesenquimales CD44. Cabe destacar que la mayoría de las células teñidas para EpCAM, CD44 y vimentina (Figura 2B), lo que sugiere que las señales de EpCAM /CD44 subestiman la diversidad fenotípica dentro de las células de cáncer de ovario temprano de paso. La mejor discriminación entre los diferentes subconjuntos se logró con E-cadherina en combinación con un marcador mesenquimal o CD44. Posteriormente se utilizó esta combinación de marcadores para caracterizar la mayoría de los experimentos siguientes. Cuando se analizaron para la E-cadherina y el marcador madre del cáncer putativo CD133, dos subfracciones de células CD133 positivas se hacen evidentes CD133
+ /E-cadherina
alto y CD133
+ /E-cadherina
células de baja (Figura 2C). Esta observación apoya aún más el papel de E-cadherina como un potencial marcador discriminatorio para subconjuntos de células de cáncer. Las células dentro de la E /M población de células (particularmente células E-cadherina
bajos) también expresaron otros marcadores que son característicos de las células madre, incluyendo Nanog, oct 4, y Sox2 (Figura S2 B). /células M E, en particular células en esferas, también fueron muy positivos para los inductores de la EMT Caracol, haga girar y NGAL (Figura 2D). Por otra parte, también se encontró que las células que eran bajos en la membrana claudin 7 predominantemente localizar beta-catenina en el citoplasma /núcleo (Figura S2C). La transición de la beta-catenina desde la membrana celular al núcleo es un evento temprano en la EMT
En general, los estudios de inmunofluorescencia indican la existencia de dos CD133
+ fracciones.; i) la membrana E-cadherina
alto y ii) citoplasmática E-cadherina
alta /membrana de E-cadherina
células bajas. Citoplasmática E-cadherina
alta /membrana de E-cadherina
baja células llevan rasgos de otros linajes de células y, por tanto, muy probablemente, representan células progenitoras o células madre primitivas.
Cambio de fenotipo, EMT y la diferenciación
in vitro
: estudios de citometría de flujo
para cuantificar el número de células epiteliales y mesenquimales con fenotipos en células cultivadas, que emplea citometría de flujo y se inició mediante el control de las células para el EpCAM marcadores epiteliales, así como monitoreo para vimentina o el marcado CD44 células con atributos mesenquimales. Por otra parte, para delinear los cambios fenotípicos de horas extraordinarias, tales como la iniciación de la EMT, se analizaron diferentes pasajes de las células ovc316-XC (Figura 3). Estos estudios revelaron una serie de observaciones interesantes. i) En suspensiones de células tumorales que fueron recién aisladas de xenoinjertos, la mayoría de las células eran o células E /M (EpCAM
alta /vimentina
alta, EpCAM
alta /CD44
alto) o E -Cells (EpCAM
alta /vimentina
baja, EpCAM
alta /CD44
baja), sin embargo, en el paso 1 se pudieron detectar sólo las células E /M, lo que indica que la mayoría de las células obtenidas a partir xenoinjertos que se adaptan al cultivo de tejidos son E /M (Figura 3A). Esto implica que, incluso a principios de paso, las culturas no reflejan adecuadamente la composición celular del tumor
In situ
. El paso 1 contenía EpCAM
altos /CD44
/vimentina
/CD44
/vimentina
células Bajo Bajo Alto y EpCAM
altos altos. ii) Es importante destacar que durante el cultivo de células en MEGM que contienen factores de crecimiento /FBS (ver pasos 1, 5, 7, 20), tanto en el EpCAM
alta /CD44
alta /vimentina
alto o EpCAM
/CD44
/vimentina
tipos de células bajas desaparecieron y fueron reemplazados por EpCAM
/CD44
altos /vimentina
pilas de gran bajo bajo alto. Esto demuestra que las células E /M se diferencian en células mesenquimales
in vitro
de una manera similar a la EMT. iii) La mayoría de CD133
+ células son células híbridas E /M. Después de pases en cultivo de células ovc316-XC pierden rápidamente la expresión de CD133 en forma concomitante con la pérdida de las características epiteliales. Fluya
A) Triple color análisis de citometría de suspensiones de células de xenotrasplante /biopsia y células cultivadas
in vitro
en diferentes pasajes. Panel izquierdo: EpCAM /CD44 /CD133. Panel derecho: EpCAM /vimentina /CD133. B) Paso 1 y 5 células se sometieron a 14 días de factor de crecimiento /FCS inanición y luego analizadas por citometría de flujo. Se muestran los datos de ovc316-X y ovc316-XC. Los resultados fueron confirmados en suspensiones celulares a partir de biopsias y cultivos primarios (ovc100506-biopsia, ovc100506-PC, ovc100728-biopsia, y 100914). C) El análisis de inmunofluorescencia de paso 3 y 18 culturas de ovc316-XC. Las células en los primeros pasajes (paso 3) tienen niveles elevados de E-cadherina y laminina si se compara con el paso 18. Las células se aumentó el tamaño y la esfera del crecimiento en altas densidades de células se reduce notablemente en los pasajes altos. Porcentaje de lado la población (SP) células positivas se muestran a continuación. La barra de escala es 40μm. D) La formación de tumores después de un trasplante de células 3 y 18 ovc316-XC pasaje en ratones SCID-beige (evaluada 4 meses después de la inoculación). p3 TIC: 1/110, p18 TIC: 1/744. Chi-cuadrado:. 0.245
También encontramos que para un número de pasajes inanición puede estancar la diferenciación y la pérdida del fenotipo epitelial, mientras que los niveles de CD133 disminuyen ligeramente durante este proceso (Figura 3B). En general, encontramos que los cultivos primarios de cáncer de ovario muestran la formación de más esfera cuando se cultivan sin factores de crecimiento (Figura S3).
Una vez identificada la E-cadherina como un marcador capaz de diferenciar subgrupos celulares, repetimos fluir análisis de citometría con E -cadherin (Figura S3). La diferenciación también se reflejó en una disminución de los niveles de E-cadherina y laminina después de los pases. Mientras que los cultivos paso bajo las contenían un alto número de esferas, E-cadherina
células de altura, y cantidades excesivas de laminina, células de alto pasaje mostraron una reducción notable crecimiento esfera y los bajos niveles de estas proteínas, mientras que el tamaño de celda se incrementó (Figura 3C). Esto también se confirmó en estudios de citometría de flujo de los pasajes 1, 3, y 7 (figuras S3A-C). Estos estudios muestran que el mesenquimales (E-cadherina
negativos /bajos) sub-fracción aumenta durante los pases y EMT concomitante. CD133
+ células fueron altamente positivas para CD44 (Figura S3 A). También se analizó la membrana de Tie2 en correlación con la E-cadherina (Figura S3 B). Por el análisis de inmunofluorescencia, las células Tie2 tienen un fenotipo epitelial y son más bajas en CD44 de CD133
+ células. En particular, una correlación entre E /M fenotipo, CD133 /CD44-positividad, y tumorigenicidad también es apoyado por citometría de flujo análisis de cultivos clonales (Figura S3C). Sólo E /M clones contenían cantidades considerables de CD133
+ células con elevada expresión de CD44 (y como se ha mostrado anteriormente, sólo los clones de E /M formaron tumores). La pérdida de características "célula madre" durante los pases también se refleja en la reducción de la fracción de la población lateral (SP) células de 7,8 ± 0,5% en el paso 3) a 2,1 ± 0,3% en el pase 18 (Figura 3C). El fenotipo de células SP se ha asociado con cáncer de células madre en los estudios anteriores de cáncer de ovario [36]. Por último, la pérdida de CD133
+ y E /M células correlacionado con una disminución de la capacidad para formar tumores (Figura 3D).
En general, se observó una notable diferencia de fenotipos entre las células
in vivo
y
in vitro
. Las células que se adaptaron al cultivo de tejidos fueron células CD133
+ E /M. Después de pases E /M células se diferencian en células mesenquimales en un EMT igual manera. Este proceso va acompañado de una reducción de la tumorigenicidad.
Presencia de subconjuntos de células E /M
In situ
Teniendo en cuenta que las culturas de cáncer de ovario, en particular a finales de los pasajes, sólo escasamente reflejar el fenotipo de tumores
in situ
, nos centramos nuestra inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis sobre secciones de biopsias de tumores o xenoinjertos, o suspensiones de células obtenidas por digestión con colagenasa de los tumores (Figura 4). análisis de inmunofluorescencia de secciones de xenoinjertos cosechados en la semana 10 después del trasplante de las células tumorales (Figura 4) o secciones de biopsias de pacientes (Tabla S1, la figura S4) mostraron que los tumores
in situ
tener grupos de células E /M (EpCAM
+ /vimentina
+), así como grupos de células epiteliales (E-cadherina
+ /vimentina
-) (Figura 4A). En los xenoinjertos, nidos de E /M y las células epiteliales fueron rodeados por capas de laminina. También observamos costaining de E-cadherina y Tie2 (Figura 4B). CD133
pilas de gran (Azules) son Tie2
baja y E-cadherina
baja (Figura 4B, panel inferior). Se observó un patrón interesante cuando la doble tinción con E-cadherina y CD133 Como no se encontraron células CD133 positivas en la periferia del tumor, en áreas de crecimiento tumoral activa (Figura S5A). Cabe destacar que no todos los
células CD133 + fueron células E /M. Dentro de CD133
+ células, encontramos dos subconjuntos de células E /M como se describió anteriormente para los estudios in vitro (Figura 4C, más grande de ampliación en la figura S5B). Es interesante que el CD133
alta /membrana de E-cadherina
bajo subconjunto
In situ
mostró la presencia de E-cadherina dentro de las vesículas citoplasmáticas aparentemente más que
in vitro
. Los resultados obtenidos utilizando xenoinjertos de tumores eran representativas para la tinción de secciones de tumores procedentes de nueve pacientes diferentes (Tabla S1, figura S4).
A) Existencia de células híbridas E /M
In situ
. E-cadherina
+ /vimentina
+ células están presentes biopsias y xenoinjertos de tumores. Se muestran las imágenes de ovc316-biopsia y ovc316-X. tinción similar se encontró para ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, y ovc100914-biopsia /ovc100914-X. B) Correlación de la E-cadherina (verde) y Tie2) positividad rojo (en biopsias de cáncer de ovario. CD133
pilas de gran (Azules) son Tie2
baja y E-cadherina
intermedia. Se muestran las imágenes de ovc316-biopsia y ovc316-X. tinción similar se encontró para ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, y ovc100914-biopsia /ovc100914-X. C) CD133
pilas de gran tienen niveles bajos de membrana E-cadherina. E-cadherina
muestran pilas de gran membrana punteada CD133 tinción. Se muestran las imágenes de ovc316-biopsia y ovc316-X. tinción similar se encontró para ovc100506-biopsia /ovc100506-X, ovc100728-biopsia /ovc100728-X, y ovc100914-biopsia /ovc100914-X. La barra de escala es 40μm. D-F) tres chorros color análisis de citometría de ovc316-X para marcadores epiteliales (eje x), características mesenquimales (eje y), y para los marcadores de cáncer de células madre CD133 (histogramas). D) Los xenoinjertos contienen células epiteliales, epiteliales /mesenquimatosas (E /M) las células híbridas, y las células que son negativas para todos los marcadores. CD133
+ células son casi exclusivamente en una fase híbrida E /M basado en el análisis de EpCAM /CD44. CD133
pilas de gran son EpCAM
alta, CD44
alta y vimentina
baja. E) La sustitución de EpCAM con E-cadherina revela mayor diversidad dentro de xenoinjertos. CD44
pilas de gran son E-cadherina
bajo /intermedio. CD133
+ células se divide en dos sub-fracciones claras. La fracción 1: E-cadherina
bajo /intermedio /CD44
alto y la fracción 2: E-cadherina
alta /CD44
intermedia.