Extracto
Los modelos estadísticos normales adyacentes, en combinación con técnicas de perfiles de expresión de todo el genoma, tiene demostró que el estado molecular del tumor son suficientes para inferir su estado patológico. Estos estudios han sido extremadamente importante en el diagnóstico y han contribuido a mejorar nuestra comprensión de la biología del tumor. Sin embargo, su importancia en la comprensión en profundidad de la fisiopatología del cáncer puede ser limitada ya que no toman en cuenta explícitamente el papel fundamental del microambiente del tejido en la especificación de la fisiología del tumor. Debido a la importancia de las células normales en la configuración del microambiente del tejido formulamos la hipótesis de que los componentes moleculares del perfil de las células epiteliales normales adyacentes al tumor son predictivos de la fisiología del tumor. Hemos tratado esta hipótesis mediante el desarrollo de modelos estadísticos que enlazan perfiles de expresión génica que representan el estado molecular de las células epiteliales normales adyacentes a las características tumorales en el cáncer de próstata. Además, el análisis de red mostró que los genes predictivos están vinculados a la actividad de los factores secretados importantes, que tienen el potencial de influir en la biología del tumor, tales como IL1, IGF1, PDGF BB, AGT, y TGF
Visto:. Trevino V, Tadesse MG, Vannucci M, al-Shahrour F, Antczak P, S Durant, et al. (2011) Análisis de normal-tumor Interacción Tissue en tumores: Predicción de cáncer de próstata Características del perfil molecular de las células normales adyacentes. PLoS ONE 6 (3): e16492. doi: 10.1371 /journal.pone.0016492
Editor: Diego Di Bernardo, la Fundación Teletón, Italia |
Recibido: 4 Agosto, 2010; Aceptó 3 de enero de 2011; Publicado: 30 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Trevino et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Víctor Treviño era un beneficiario de una beca de Darwin la confianza y el CONACyT. Este trabajo está financiado en parte por subvenciones de la CRUK (C8504 /A9488), Ministerio de Ciencia e Innovación español (BIO2008-04212), GVA-FEDER (PROMETEO /2010/001). Los autores también agradecen el apoyo del Instituto Nacional de Bioinformática (www.inab.org) y RtICC (RD06 subvención /0020/1019) ambas iniciativas del Instituto de Salud Carlos III (MICINN). Marina Vannucci es parcialmente apoyado por el NIH-R01-NHGRI HG003319. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la aplicación de las tecnologías de genómica funcional, en particular perfiles de expresión génica, ha proporcionado a la comunidad científica con las herramientas para caracterizar el estado molecular de las células y los tejidos a nivel del genoma. Estas tecnologías junto con la capacidad para diseccionar tipos específicos de células de un tejido complejo han creado una oportunidad sin precedentes para caracterizar la identidad molecular de tipos de células específicas en el contexto de un tejido complejo de [1]. Siguiendo este enfoque, perfiles de expresión génica se han aplicado para generar el perfil transcripcional de las células tumorales que son predictivos de ambas características del tumor y el resultado clínico en una variedad de cánceres humanos [2]. Muchos estudios de genoma completo, sin embargo a menudo se analizaron no tomar explícitamente en cuenta que los componentes de la matriz extracelular (ECM) (proteínas de la matriz, crecen solubles factores y quimiocinas) secretadas por las células normales, adyacentes al sitio del tumor, en gran medida influye en la biología del tumor. Recientemente, las células estromales han surgido como los principales candidatos para jugar un papel en la interacción de células de tumor normal [3]. Estas células secretan la mayor parte de las enzimas implicadas en la degradación de ECM, por ejemplo que producen factores de crecimiento que tienen un papel en el control de la proliferación de células tumorales, la apoptosis y la migración. También secretan citoquinas pro-inflamatorias implicadas en quimiotaxis y activación de leucocitos específicos y por lo tanto juegan un papel en la determinación de las respuestas inflamatorias [4]. Los factores de crecimiento y citoquinas también están involucrados en la transformación neoplásica de las células, la angiogénesis, la expansión clonal y el crecimiento del tumor, el paso a través de la ECM, intravasación en la sangre o los vasos linfáticos y el homing no aleatoria de la metástasis tumoral a sitios específicos. Muchos de estos factores también son secretadas por las células epiteliales normales, células inmunes y las células endoteliales en la proximidad de la masa tumoral. También se ha demostrado que el estroma puede repercutir en la respuesta a la terapia anti-tumor. De hecho, la presencia de leucocitos CD11b + confiere resistencia a la terapia anti-angiogénesis [5].
Además, el tratamiento previo de la estroma con moléculas anti-angiogénesis antes de la implantación del tumor en modelos tumorales de ratón pueden aumentar paradójicamente el desarrollo de tumores [6], [7]. Esto ilustra que la calidad de la estroma tumoral puede influir significativamente en el desarrollo de tumores.
La importancia de la micro-entorno en la determinación de la aparición y progresión de cáncer surge la cuestión de si puede ser posible predecir la patofisiología y el resultado clínico del tumor a partir de los componentes específicos del estado molecular de las células normales. Si es posible, esperaríamos que estas firmas moleculares que representan componentes importantes de la célula-célula diafonía involucrados en la especificación del desarrollo del cáncer.
Hemos tratado esta cuestión mediante el desarrollo de modelos estadísticos basados en una escala del genoma de perfiles de la normalidad tejido adyacente al tumor y la identificación de aspectos que son predictivos de características del cáncer.
Hemos analizado dos diferentes conjuntos de datos de microarrays cáncer de próstata disponibles en el dominio público [8], [9]. Se demuestra que en ambos conjuntos de datos del estado molecular de las células adyacentes al tumor es predictivo de características de cáncer clínicamente relevantes. Estas vías son firmas moleculares informativos y representan vías de señalización implicadas en la producción y la respuesta a los factores secretados.
Estos hallazgos apoyan la importancia potencial de las biopsias de tejido normal en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata. Este enfoque también proporciona una estrategia de análisis de aplicación general para identificar las vías principales que intervienen en la comunicación célula a célula.
Resultados
Los modelos estadísticos establece un vínculo entre el estado molecular de las células normales y tumorales histopatológico características
el objetivo inicial de nuestro análisis fue comprobar si el perfil molecular de las células normales es predictivo de las características del cáncer. Inicialmente se consideraron dos aspectos importantes de la fisiología del tumor de próstata: el grado de organización de las células tumorales definidos por un sistema de puntuación histopatológico llamada puntuación de Gleason, y la capacidad de las células tumorales para penetrar la cápsula de órganos resumido por una puntuación binaria histopatológico llamada penetración capsular. El nivel de diferenciación de las células tumorales mide la tendencia de las células a agregarse en estructuras glandulares-como que son una reminiscencia de la organización del tejido normal. La puntuación de Gleason se puede utilizar para definir dos clases principales. La primera se caracteriza por tumores de bajo grado que muestran una estructura altamente organizada (correspondiente a una puntuación inferior o igual a 6), mientras que una segunda clase se caracteriza por células de tumores de alto grado que se encuentran dispersos en la matriz y no muestran una tendencia para formar estructuras glandulares similar (correspondiente a una puntuación superior o igual a 7). Por el contrario penetración capsular describir el grado en el que las células han eludido la cápsula que rodea la próstata.
Nuestro análisis tiene la intención de vincular el perfil molecular de las células normales a nivel de diferenciación (baja versus alta diferenciación) y la penetración capsular (positivo frente a negativo). Esto se logró mediante el desarrollo de modelos estadísticos que se basa en el perfil molecular de las células normales y predictivo de las clases de muestra, específicamente la puntuación de Gleason y la penetración capsular.
Para este propósito hemos aplicado dos métodos de modelización multivariante diferentes ( GA-MLHD y métodos BVS) a dos conjuntos de datos independientes desarrollados por Singh et al. [9] y por Lapointe et al. [8]. Los dos métodos de modelización estadística están diseñadas para buscar marcadores múltiples genes que maximizan la distinción entre las clases de muestra. El uso de estos métodos, se han desarrollado modelos representativos que son predictivos de características del tumor por medio del perfil de expresión génica de las células normales. precisión y tamaño de estos modelos de clasificación fueron comparables a los desarrollados usando el estado molecular de las células tumorales (Tabla 1). modelos representativos desarrollados con los métodos BVS y GA-MLHD representan subconjuntos de predicción óptimos que se basan en un número muy similar de genes y tienen un alto grado de solapamiento a nivel de genes, lo que sugiere que nuestros resultados son independientes de la metodología utilizada (Figura 1 y las figuras S1, S2 y S3). En consonancia con el relativamente pequeño grado de solapamiento entre las plataformas de microarrays (& lt; = 8%, consulte la sección de Proceso de Datos en el Texto S1 para más detalles), los modelos representativos desarrollados a partir de los dos conjuntos de datos independientes no tienen genes en común
.
la figura muestra los mapas de calor que representan el perfil de expresión de genes seleccionados por los modelos GA y BVS en ambos Lapointe y Singh conjuntos de datos de los datos de tejido normal. Cada cuadrante en la figura representa una combinación de un enfoque de modelado y un conjunto de datos específico. Los genes presentes en GA-MLHD y BVS para el mismo conjunto de datos se resaltan en rojo. La precisión se informó debajo de cada mapa de calor. número de acceso de GeneBank y símbolo de genes se muestran en el lado izquierdo de la carta térmica. Brillantes colores verdes o rojos en mapas de calor representan más baja o más alta expresión relativa, respectivamente. T-test, p-valor se muestra para la comparación con los criterios de la expresión diferencial de uso común en los enfoques de selección de variables univariantes.
Un análisis más detallado de la contribución relativa de los genes individuales a la separación de la muestra fue realizado mediante un análisis de componentes principales (Figura 2). Este enfoque ha revelado que los genes implicados en las vías de comunicación celular son predictivos de la penetración capsular. Dentro del conjunto de genes seleccionados por la Asamblea General en el conjunto de datos tejido normal, una combinación de una mayor expresión del gen
PRELP Opiniones y una menor expresión de los genes
UBE4A
,
ZNF146
en las células normales fue predictivo de penetración capsular del tumor. En el conjunto de genes desarrollado mediante la aplicación del procedimiento de la BVS en el conjunto de datos tejido normal, una alta expresión de
PPP2R4
,
PRELP
,
CALLA
,
ISG20L2
fue predictivo de penetración capsular del tumor. Los modelos desarrollados a partir del conjunto de datos revelaron que Lapointe menor expresión de
OAT
y una mayor expresión de
PCGF5
y
MYCN
en el modelo GA y menor expresión de
IGF1 Opiniones y
PRC
y una mayor expresión de
PCGF5
y
CPSF7 ¿Cuáles son predictivos de penetración capsular.
la figura muestra el resultado de un PCA que representa la separación de la muestra sobre la base de la expresión en el tejido normal de genes seleccionados por los procedimientos de modelado. Cada cuadrante en la figura representa una combinación de un enfoque de modelado y un conjunto de datos específico. Cada cuadrante tiene una parcela 2D que representa la separación de negativos penetración capsular (negro cerrar círculos) y (círculos rojos cercanos) muestras positivas (parcelas B, D, F y H) y un gráfico de barras (parcelas A, C, E y G) que representa las cargas de PC (eje x) para cada componente de genes (eje y). Tenga en cuenta que las cargas de PC representan la contribución de cada gen a la separación de clases. Las líneas de puntos delimitados los genes con mayor contribución que se discute en el manuscrito. Los genes presentes en GA-MLHD y BVS para el mismo conjunto de datos se resaltan en rojo.
El vínculo entre lo normal y tumoral se muestra en este análisis también se apoya en un análisis univariado que hemos realizado utilizando una amplia espectro de metodologías disponibles (Figura S4).
La especificidad de las firmas de predicción de genes de rasgos histopatológicos de cáncer
adyacentes tejidos normales y tumorales son morfológicamente distintos. Sin embargo, muestran un grado de similitud molecularmente que es en parte consecuencia de compartir el mismo microambiente [10]. por lo tanto, nos preguntamos si los modelos de predicción que hemos desarrollado a partir de células epiteliales normales representan una firma molecular que es específico de tejido normal o si la expresión de los genes de predicción en las células tumorales también puede ser predictivo de características tumorales. Para hacer frente a esta hipótesis, se llevó genes seleccionados por nuestras estrategias de modelado desarrolladas a partir de los conjuntos de datos de tejidos normales y probado si su expresión en la edición del tumor fue predictivo de las características del cáncer.
También desafió a la precisión de la predicción de los modelos desarrollado a partir de los datos de tumores mediante la realización de la comparación correspondiente en el conjunto de datos normal. En ambos casos, la precisión de la predicción de los modelos es cerca de 50% (que corresponde a la precisión esperada de una conjetura al azar) (Figura 3). Por lo tanto, este análisis muestra que las firmas moleculares que hemos identificado son específicos para los tejidos (normal o tumoral) que han sido seleccionados para representar.
La exactitud de predicción de los modelos desarrollado utilizando tejidos normales (panel A, círculos rellenos ) es comparable a los modelos desarrollados usando tejido tumoral (panel B, diamantes negros). Cuando los modelos desarrollados usando tejido normal son entrenados y probados con datos de tejido tumoral, el poder de predicción se reduce considerablemente (círculos vacíos). Del mismo modo, los modelos tumorales entrenados y evaluados con los datos de tejido normal también son predictivos (rombos vacíos) no.
redes funcionales vinculadas a firmas predictivas que representan células epiteliales normales de perfiles de expresión incluyen importantes señales de citoquinas y factores de crecimiento
con el fin de facilitar la interpretación biológica de los genes representados en nuestros modelos estadísticos se utilizó el software de análisis de IPA para llevar a cabo un análisis en profundidad a nivel de red. Para asegurar que nuestro análisis abarcó toda la gama de posibles soluciones, se utilizó como entrada para el software IPA la lista de genes representados en la colección de modelos predictivos identificados a partir de tejido normal por el procedimiento de GA. Estas cubiertas de un espectro más amplio de la relación espacio de soluciones a los modelos representativos descritos anteriormente (Figura 1 y 2) y representan 239 y 259 genes para Singh y Lapointe conjuntos de datos, respectivamente. En este análisis nos centramos en la penetración capsular debido a su relevancia clínica y pronóstica. El análisis de redes se realizó de forma independiente en los dos conjuntos de datos y las redes más importantes (estadísticamente significativas y con & gt; 50% de genes diana representados en la red). Se seleccionaron para su posterior análisis
En ambos conjuntos de datos, predicción de genes eran parte de las redes que enlazan las moléculas extracelulares, tales como la citoquina proinflamatoria
IL1β
, las quimiocinas pro-metastásicos
CX3CL1
y
CCL20
y los factores de crecimiento
IGF1
,
TGF
y
PDGF BB
con la actividad de la transcripción nuclear factores
NFkB
,
HF4A
,
TP53
y
MYC
.
Figura 4 describe las redes más significativos identificados por la aplicación representante IPA de los modelos basados en el estado molecular de las células normales y predictivo de la penetración capsular en el Lapointe et al . conjunto de datos (ver Tabla S2 para la lista completa de las redes significativos identificados por el IPA). La figura 4A muestra una red representado por la interacción entre la citoquina proinflamatoria
IL1β
y el factor de transcripción
NFkB
. Figura 4B-D representan tres sub-redes interconectadas que implican la interacción entre varios factores de crecimiento genes y el P53 factores de transcripción (
TP53
) y C-MYC (
MYC
). Más específicamente, la figura 4C representa una red que incluye los factores de crecimiento
IGF1
, su receptor
IGF1R
y
PDGF BB
. La figura 4B representa la interacción entre los factores de la angiotensina extracelular (
AGT
), el factor de crecimiento
TGF
y el ligando del receptor Notch Jagged (
JAG
). La figura 4D, por otro lado representa los genes que están directa o indirectamente conectadas con el factor de transcripción c-myc (
MYC
).
La cifra representa las cuatro redes más significativos seleccionados por el IPA software. Los genes representados por formas azules están presentes en la colección de modelos de recogida por el procedimiento de GA-MLHD. Los genes representados con formas de color rojo representan los genes en la colección de modelos, sino que también incluyen en los modelos predictivos más representativos. Los genes en las redes se organizan por localización celular (extracelular, membrana, citoplasma y núcleo). Tenga en cuenta que el software de búsqueda de IPA estadísticamente significativas sub-redes de un tamaño máximo dado para simplificar su visualización. Sin embargo, en este caso, éstos se vinculan como se indica mediante trazos roja flechas que conectan los componentes específicos de la red.
Los cuatro mejores redes más significativos identificados en el conjunto de datos Singh (Figura S5) representan los genes conectados a las mismas citoquinas y factores de crecimiento identificados en el conjunto de datos Lapointe. Esta interesante observación sugiere que, a pesar de la limitada cantidad de solapamiento a nivel del gen, modelos derivados de los dos conjunto de datos pueden representar las redes moleculares funcionalmente similares.
La expresión de citoquinas, factores predictivos de crecimiento y sus receptores en la progresión del cáncer de próstata
con el fin de mejorar la comprensión de la importancia biológica de las redes del IPA se analizó la expresión de genes en diferentes etapas de la progresión del cáncer de próstata. Nos hemos centrado la investigación en un pequeño subgrupo de 20 genes que representan los factores secretados incluidos en las redes de la API y sus receptores (Tabla S3).
Con el fin de limitar la interferencia de contaminantes de células del estroma, se seleccionó un conjunto de datos lo que representa un análisis de microarrays de siete tipos de poblaciones de células normales y tumorales epiteliales, purificados por láser de captura de microdisección (LCM) reportados por Tomlins et al. [11]. Estos, células normales de la próstata incluidos purificadas a partir de próstatas sanos (Nor), células normales de la hiperplasia benigna de próstata (BPH), las células normales adyacentes al tumor (adj), las células tumorales de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), células tumorales de carcinoma de próstata de bajo grado (L-PCA), carcinoma de células tumorales de próstata de alto grado (H-PCA) y las células tumorales de las metástasis del cáncer de próstata (Meta).
Nuestra hipótesis es que, dado que los 20 genes que hemos seleccionado se incluyeron en los modelos predictivos altamente de penetración capsular tumor, también pueden ser expresadas diferencialmente durante la progresión del cáncer de próstata. Pusimos a prueba esta hipótesis mediante la comparación de las siete poblaciones de células de LCM. Descubrimos que una gran proporción sorprendente de estos genes son expresados diferencialmente (75% en p
& lt; 0,001 Opiniones y 95% a
p & lt; 0,05
) (Tabla S3, la Figura 5, S7 y S8). Más apoyo a la relevancia de la expresión de genes firma habíamos identificado provino de la observación de que los dos clúster dimensiones análisis realizados utilizando la matriz de perfiles de expresión génica diferencial (promedio de expresión para cada grupo), se recapitula la relación esperada entre las diferentes etapas de la desarrollo de cáncer de próstata (Figura 5A). Más precisamente, las poblaciones de células normales agrupados juntos seguido de PIN y un grupo de L- PCA y H-PCA. El grupo celular metastásico agrupado a un lado.
La figura representa los resultados de los análisis realizados en el conjunto de datos desarrollado por Tomlins et al. [11]. Diferentes poblaciones de células están etiquetados como sigue. Las células normales (Norma), las células normales adyacentes al tumor (adj), hiperplasia benigna de próstata (MPH), carcinoma de próstata de bajo grado (L-PCA), el carcinoma de próstata de alto grado (H-PCA) y células metastásicas (meta). El panel A muestra un análisis de dos dimensiones clúster realizado en los genes expresados diferencialmente (
p & lt; 0,01
) a través de las poblaciones de células epiteliales normales y tumorales purificados siete LCM. Panel B representa el nivel de expresión (eje y) de los genes expresados diferencialmente entre norma, adyacentes y BPH (representado en el eje y). Los niveles de los genes individuales a través de todas las etapas se presentan en paneles CF y en la Figura S8.
De relevancia para la comprensión de las bases biológicas de la capacidad de predicción de las células normales de la firma es la observación de que las células normales adyacentes al tumor mostraron diferencias significativas con respecto a las células normales y las BPH (Figura 5B). Cinco genes (
IL1R, LOX
y
TGFBR, CX3CL1
y
CYR61
) son expresados diferencialmente entre las tres poblaciones de células normales. Más específicamente, las células normales adyacentes al tumor (Norm) se caracterizaron por una menor expresión del gen supresor de tumores
LOX
, los receptores de la interleucina 1 (
IL1R
) y
TGF gratis (
TGFBR
) y por una mayor expresión de los genes pro-tumorales
CYR61
y
CX3CL1
.
a continuación, examinó la expresión de genes individuales a través de las diferentes etapas de la progresión del tumor en relación con las redes identificadas por el software IPA (Figura 4)
.
la citoquina
IL1β
, identificado por el análisis de IPA como vinculada a la la activación de las quimiocinas pro-metastásicos
CX3CL1
y
CCL20 gratis (Figura 4A), fue hasta reguladas en las poblaciones de células tumorales PIN y H-PCA (Figura 5A y 5C), mientras la expresión de
IL1R1
, que mediada la actividad de
IL1β
, sigue una tendencia opuesta (Figura 5 a, B y C). El quimioquinas pro-metastásico
CX3CL1
se expresó en niveles más altos en relación con la población de células adyacentes a PIN, L-PCA y H-PCA, pero no en las células Meta (Figura 5E). La expresión de la
LOX
gen fue encontrado superior en todas las poblaciones de células tumorales en relación con las células adyacentes y normales (Figura 5F) consistentes con el hecho de que una mayor expresión de
LOX
se ha asociado a la hipoxia metástasis inducida en el pecho, cabeza, cuello tipos de cáncer [12], [13].
La expresión de
AGT
,
TGFB
y
JAG1
estaban vinculados en una red diferente IPA (Figura 4B). La expresión de angiotensinógeno (
AGT
) es mayor en las células adyacentes en comparación con el PIN, L-PCA y H-PCA mientras que
JAG1
sigue una tendencia opuesta (hacia abajo regulada en las células adyacentes respecto a L -PCA, H-PCA y Meta). Si angiotensinógeno se produce en niveles más altos en las células adyacentes una de las enzimas activadoras que convierten el producto de la
AGT
gen en angiotensina II (
ACE
) es en cambio mayor en PIN y L-PCA , lo que sugiere la posibilidad de utilización en las células tumorales en las etapas inferiores de desarrollo del cáncer de próstata. El hallazgo de que
AGT
y
JAG1
tienen tendencias opuestas apoya la hipótesis de que
AGT
puede reprimir la expresión de
JAG1 gratis (Figura S8 paneles E y F). Esta conexión fue informado por el software IPA (Figura 4B), pero con el apoyo de un modelo experimental de cultivo de células endoteliales [14]. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que este mecanismo también puede ser relevante en el cáncer de próstata.
Una tercera red IPA representa la interacción entre los factores promotores de tumores
IGF1, PDGF BB
y
CYR61 gratis (Figura 4C). Aunque la expresión de
PDGF
es constante en todas las poblaciones de células, su receptor (
PDGFR
) es mayor en las poblaciones de células Meta H-PCA y comparación con las células adyacentes. La expresión de
CYR61
es mayor en las células adyacentes respecto a la clavija y las poblaciones de células Meta (Figura S8).
Discusión
Nos han demostrado que las firmas de células epiteliales normales son predictivos características importantes de cáncer de próstata. Este hallazgo tiene implicaciones clínicas potenciales como sea sugiere que el estado molecular de las células normales tiene valor pronóstico. A nivel molecular, el análisis de redes ha revelado que nuestro enfoque tiene el potencial de identificar genes implicados en la patogénesis de la enfermedad. Estos incluyen genes que codifican citoquinas clave y factores de crecimiento expresado por las células epiteliales normales y se sabe que influyen en la biología del tumor.
producción de citoquinas inducida por las quimiocinas pro-metastásicos
La red se muestra en la Figura 4A