Extracto
La cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) es el quinto cáncer más común, que afecta anualmente a más de medio millón de personas en todo el mundo. Actualmente, no hay biomarcadores aceptados para la detección clínica y la vigilancia de la CECC. En este trabajo, se empleó un análisis exhaustivo de todo el genoma de las alteraciones epigenéticas en tumores primarios HNSCC en conjunción con las estadísticas de valores atípicos específicos de cáncer para definir nuevos genes biomarcadores que están metilados diferencialmente en CECC. Los 37 candidatos de biomarcadores identificados fueron las mejores puntuaciones genes atípicos con prominentes metilación diferencial en los tumores, pero sin señal en los tejidos normales. Estos candidatos putativos fueron validados en cohortes independientes HNSCC de nuestra institución y TCGA (El Atlas del Genoma del Cáncer). Utilizando los mejores candidatos,
ZNF14
,
ZNF160
, y
ZNF420
, se desarrolló un ensayo para la detección de cáncer de CECC en muestras de tejido y saliva primarias con 100% de especificidad cuando en comparación con las muestras de control normales. Dada la alta especificidad de detección, el análisis de la metilación del ADN ZNF en combinación con otros biomarcadores de metilación del ADN puede ser útil en el ámbito clínico para la detección HNSCC y vigilancia, en particular en pacientes de alto riesgo. Varios candidatos adicionales identificados a través de este trabajo se pueden investigar más hacia el desarrollo futuro de un panel de genes múltiples de biomarcadores para la vigilancia y la detección de los CECC
Visto:. Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Y, Tsai NS, Wang H, Zhang C, et al. (2015) Análisis de valores atípicos Define Zinc Finger familia de genes de metilación del ADN en los tumores y la saliva de cabeza y cuello pacientes. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10.1371 /journal.pone.0142148
Editor: Kwok Wai-Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 10 Febrero, 2015; Aceptado: October 18, 2015; Publicado: 6 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Gaykalova et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Expresión de datos de Affymetrix . disponible en GEO33205 y Illumina la metilación de datos en GEO33202
Financiación: Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial y el Instituto Nacional de Salud Challenge Grant (RC1DE020324); Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial y subvención del Instituto Nacional del Cáncer (P50 DE 019.032 Cáncer de Cabeza y Cuello SPORE) de la JAC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) afecta a un estimado de 60.000 personas en los Estados Unidos y 600.000 personas al año en todo el mundo [1, 2]. CECC es comúnmente causada por el tabaco y la exposición al alcohol, así como por el virus del papiloma humano (VPH) [1]. A pesar de los avances en la comprensión de la biología CECC, aproximadamente la mitad de todos los pacientes con CECC sucumben a la enfermedad dentro de los cinco años del diagnóstico [2-4].
En la actualidad se observa que todo el genoma de hipometilación, acompañado de de genes específicos de la hipermetilación del promotor, es una característica general de los tumores sólidos [5, 6]. la hipermetilación del promotor se ha descrito para un gran número de genes, y por lo general resulta en gen supresor de tumores represión transcripcional [3]. Dada la alta tasa de anormalidades de metilación del ADN en las células cancerosas, así como estabilidad de la señal de metilación del ADN durante la división celular, la detección de la metilación del ADN es una herramienta valiosa en el desarrollo de biomarcadores para la detección del cáncer y el pronóstico [7-9]. Varios ensayos de metilación de todo el genoma se han realizado para definir la firma de la metilación del ADN HNSCC [5, 10-14]. La metilación del ADN de
DCC
,
EDNRB
,
DAPK
,
CCNA1
,
p16
,
Hoxa9
y
KIF1A
genes se han detectado en los tejidos primarios y fluidos biológicos, incluyendo la saliva y el plasma [7, 10, 15, 16], derivadas de pacientes HNSCC. La metilación del ADN de varios otros genes, entre ellos
MINT31
,
MGMT
,
NID2
,
ERCC1
, y
TIMP3
, tienen ha propuesto como biomarcadores de HNSCC que se pueden detectar en biofluidos de un paciente [11, 16]. Otros genes, como
CYGB
,
RASSF1A
,
SPARC
,
GSTM1
,
cyclinA1
,
MX1
,
WIF1
,
GNG7
,
CYP1A1
,
ZNF132
,
ZNF154
, y
ZNF447
han demostrado altas tasas de metilación del ADN en los tumores primarios HNSCC [13, 14, 16-23] y son candidatos para la validación adicional de la detección de la metilación del ADN en los fluidos corporales. la identificación de todo el genoma de los genes alterados en epigenetically CECC mejora la comprensión de los mecanismos de la carcinogénesis. Además, estos enfoques pueden descubrir nuevos eventos de metilación del ADN específicos de cáncer que se pueden utilizar para las estrategias de detección molecular de los márgenes quirúrgicos o fluidos corporales [7, 24-27]
.
Los datos recientes sugieren que la detección de la metilación del promotor de
EDNRB
y
DCC Hoteles en pacientes con lesiones orales de alto riesgo tiene un rendimiento similar en el diagnóstico como la evaluación de expertos clínicos [25]. No obstante, las pruebas de la utilización de
DCC
y
EDNRB
la metilación del promotor se limita a un 46% de sensibilidad y especificidad del 72% para la detección de cáncer en la saliva enjuagues [25]. Mientras baja sensibilidad puede estar limitado por la poca frecuencia de los cambios relacionados con el cáncer [11, 25, 28], la baja especificidad suscita inquietudes técnicas. Aunque el aumento del umbral de detección de prueba puede aumentar la especificidad [10, 25], esto requiere manipulaciones valor de corte adicionales que no son prácticos en el entorno clínico. Por lo tanto, la detección de nuevos marcadores de ADN con especificidad absoluta a los tejidos de cáncer puede mejorar los paneles de biomarcadores actuales y aumentar el potencial aplicación clínica de las estrategias de detección molecular [7, 24-26]. La baja sensibilidad de los biomarcadores individuales que son altamente específicos de tejidos de cáncer se pueden superar mediante la combinación de varios genes altamente específicos en los paneles sin sacrificar la especificidad global [11].
Dado el carácter amplio de técnicas de alto rendimiento, miles de diferencialmente regiones metiladas pueden ser detectadas al comparar tumor y las muestras normales [10]. La heterogeneidad de las alteraciones genéticas y epigenéticas en tumores sólidos ha presentado desafíos en el uso de métodos estadísticos convencionales, tales como t-tests o pruebas de señal a ruido. Estas dificultades pueden reducirse al mínimo mediante el uso de análisis basados en valores atípicos para proporcionar una medida de la significación estadística para las alteraciones heterogéneos en los tumores. basado en el análisis de valores atípicos ha proporcionado un mecanismo para definir significativos, pero diversas alteraciones, en los cánceres. El método estándar empleado en la investigación del cáncer para el análisis de valores atípicos es el cáncer de valores atípicos Análisis de Perfil (COPA [29]), que compara los valores extremos a un empírica nula. Para eliminar los valores extremos de baja señal, este trabajo implementado estadísticas basadas en la COPA con un enfoque de suma de rangos de valores atípicos, así como el establecimiento de un nivel mínimo para la convocatoria de un valor atípico [30]. Este es el primer documento que utiliza el análisis de valores atípicos [30] para el descubrimiento de biomarcadores.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido
tejidos tumorales primarios y muestras de enjuague salivales emparejados se obtuvieron de CECC los pacientes en el hospital Johns Hopkins después informados, se obtuvo el consentimiento por escrito. Este estudio fue aprobado por el Consejo de Medicina Johns Hopkins Revisión Interna (JHM IRB) y lleva a cabo bajo protocolo de investigación NA_00036235. En general, se utilizaron dos cohortes independientes de las muestras de pacientes HNSCC y las muestras de control normales. Todos los sujetos humanos que participaron en este estudio fueron des-identificados después de la recopilación de datos clínicos. La cohorte descubrimiento se compone de 44 tejidos HNSCC primarias y normales 25 muestras mucosas de uvulopalatofaringoplastia (UPFP) cirugías de afectados no cancerosas control de los pacientes de los estudios publicados previamente [31-33]. La cohorte de validación independiente incluido tejidos tumorales primarios y muestras de enjuague salivales coincidentes de 59 pacientes HNSCC, 31 muestras de tejido normales UPPP, y 35 muestras de enjuague salivales de pacientes no cancerosos. Todo el tejido primario y las muestras de líquido corporal se almacenaron a -140 ° C hasta su uso. Todas las muestras de tejidos primarios fueron analizadas por investigadores del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital de la Universidad Johns Hopkins (WHW y JAB). Las muestras tumorales fueron confirmados a ser HNSCC y posteriormente se microdissected para producir al menos 75% de pureza tumor. Características clínicas de los dos grupos se enumeran en las Tablas S1 y S2. La distribución de los subtipos HNSCC en ambas cohortes es representativa de la distribución del cáncer de cabeza y cuello, tanto en los Estados Unidos y en todo el mundo, incluyendo ~ 30% de VPH relacionados (HPV +) casos de SCC de la orofaringe. La validez de esta cohorte de descubrimiento, y su idoneidad para múltiples análisis se ha demostrado en múltiples publicaciones anteriores [31-34]. En un esfuerzo por reducir el sesgo y obtener robustos controles no afectados de cáncer, los pacientes de control fueron seleccionados al azar a partir de muestras de tejido UPPP disponibles y enjuagues salival, pero las características clínicas no fueron capaces de ser emparejado.
preparación de ADN
microdissected muestras de tejido tumoral o 250 ml de alícuotas de las muestras de saliva se digirieron en solución de 1% dodecil sulfato de sodio (SDS) (Sigma) y una solución de 50 mg /ml de proteinasa K (Invitrogen) a 48 ° C durante 48-72 horas. ADN se purificó por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol como se describe anteriormente [35]. ADN se resuspendió en tampón de LoTE, y la concentración de ADN se cuantificó usando el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific).
ARN preparación
RNA fue aislado de las muestras de tejido microdissected con el kit de aislamiento mirVana miRNA ( Ambion) según las recomendaciones del fabricante, y la concentración de ARN se cuantificó usando el NanoDrop.
las matrices
Diez microgramos de ARN y ADN fueron presentados al Fondo para el núcleo de Johns Hopkins para la consulta de control de calidad y análisis de muestras por arrays de alto rendimiento. Las muestras se procesaron en GeneChips Affymetrix HuEx1.0 (que contienen 1,4 millones de sondas) para el análisis de expresión y Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChips (sondaje 27.578 dinucleótidos CpG) para el análisis de metilación después de la conversión de bisulfito. Todas las matrices se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos del fabricante y los datos se informó anteriormente [31-33]. Affymetrix Expresión de datos está disponible en GEO33205 y Illumina La metilación de datos está disponible en GEO33202. Ambos conjuntos de datos están disponibles en el GEO SuperSeries GSE33232. Los datos se pueden consultar en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.
VPH análisis
Los informes de patología en relación con la estado del VPH de los tumores orofaríngeos SCC se obtuvieron del Departamento de Patología del hospital Johns Hopkins. Además, el estado de VPH de todos los tejidos tumorales primario en la orofaringe SCC fue confirmado independientemente por PCR cuantitativa (qPCR) usando cebadores de HPV16 y sondas en la máquina de PCR en tiempo real [7] en relación con CaSki línea (ATCC) de células, conocido por tener 600 copias de HPV16 por genoma. Las muestras con el número de copias de HPV ≥ 1 copia /genoma /celulares fueron identificados como positivos de VPH.
tratamiento con bisulfito bisulfito y Genómica Secuenciación
El EpiTect bisulfito Kit (Qiagen) se utiliza para convertir en citosinas no metiladas ADN genómico en uracilo. ADN tratado con bisulfito se amplificó con cebadores diseñados utilizando MethPrimer [36, 37] (Tabla S3). Los pares de cebadores fueron diseñados dentro de la isla CpG que rodea la región del promotor con las proximidades de las sondas de matriz de metilación. La muestra representativa de la cohorte de descubrimiento se eligieron sobre la base de las más altas diferencias en la metilación y de expresión concurrente calculado durante el análisis de valores atípicos para cada gen individual. secuenciación de bisulfito fue elegido para esta etapa a fin de determinar el estado de metilación absoluta (no relativa o normalizada) de varios dinucleótidos CpG en la isla CpG cerca del promotor de cada gen. Momento del aterrizaje se realizó una PCR [38]. Los productos de PCR se purificaron utilizando el QIAquick PCR Purification Kit 96 (Qiagen) y los productos de PCR purificados fueron secuenciados (GENEWIZ). el estado de metilación del gen se determinó como una variable tricotómica (no metilado, hemimethylated, o hypermethylated) de acuerdo con la secuencia lee.
Quantitative PCR específica de metilación (QMSP)
Para QMSP, cebadores fueron diseñados para incluir de forma específica dinucleótidos CpG que mostraron cambios en la metilación como se ve por la secuenciación de bisulfito. QMSP se llevó a cabo en la máquina de PCR en tiempo real con la normalización de no metilado
Control
referencia β-actina [39]. La máquina Taqman PCR se estableció en 38 ciclos máxima para eliminar las señales de falsos positivos. ADN de leucocitos con bisulfito convertido de un individuo sano se utilizó como control negativo. El nivel relativo de ADN metilado en cada muestra se determinó como la relación del gen amplificado a
β-actina
[40] y multiplicado por 100. Las secuencias de los cebadores y sondas utilizadas se pueden encontrar en la Tabla S3.
transcripción inversa y PCR cuantitativa en tiempo real
Uno g de ARN a partir de la cohorte de validación se sometió a transcripción inversa utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó utilizando genes específicos de los ensayos de expresión (Tabla S3) y Universal PCR Master Mix en la máquina de PCR en tiempo real 7900HT (todos de Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante. La expresión del gen de interés se cuantificó por triplicado con respecto a
GAPDH
y
18S
expresión utilizando el método 2-ΔΔCT [41].
El análisis estadístico
la metilación normalización de datos.
Para obtener los datos de metilación del promotor, los valores beta (proporción de metilación) se estimaron a partir de mediciones no metilado (U) y metilado (M) sobre una base de la sonda de nivel. estimaciones a nivel de genes fueron producidos por la elección de los más altos niveles de metilación entre todas las sondas ligadas a los mismos genes (genes 14.477 en total).
determinación sonda de aguja significativo.
los datos de expresión génica se normalizó con múltiples robusta el análisis -array media (RMA) utilizando el paquete Bioconductor oligo [42, 43]. estimaciones a nivel de genes fueron producidos por RMA utilizando las sondas de núcleo, produciendo 22.011 genes para el análisis [31, 32].
Análisis de valores atípicos.
El método estándar empleado en la investigación del cáncer para el análisis de valores atípicos es el cáncer Análisis de valores atípicos perfil (COPA), que compara las distribuciones de valores atípicos a un empírica nula generada por permutación de etiquetas de clase [29]. Un método de suma de valores atípicos rango modificado, modificado a partir de Ghosh [44], se utilizó, en el que los niveles mínimos de cambio se establecieron para la definición de un valor atípico [30]. Este eliminado muchos valores atípicos en el que el cambio no era biológicamente significativo (por ejemplo, cambio de menos de 10% entre dos muestras de metilación). Estas estadísticas se aplican al conjunto de datos de metilación del ADN descubrimiento, que contiene 14.477 genes de los tejidos tumorales 44, en el que señales procedentes de 25 muestras normales se utilizaron para establecer el punto de corte de línea de base para cada gen. Izquierda-cola y los valores atípicos derecha de la cola se determinaron utilizando el método de suma de rangos [45]. puntajes de valores atípicos se calcularon tanto para diestros-cola y casos izquierda-cola, lo que permitió la definición de los valores extremos que fueron hypermethylated y hypomethylated sobre los tumores, respectivamente [30, 45]. Dado que el análisis de valores atípicos no tiene un punto de corte, se seleccionó un umbral para producir aproximadamente 50 genes con mayor puntuación. Este punto de corte de 13,2 identificados 37 mejores candidatos para la validación adicional (S4 Tabla).
correlación Expresión-metilación.
Los datos de expresión génica normalizada se correlacionó con los niveles de metilación del promotor de los candidatos de metilación utilizando correlación de Spearman (Tabla 1).
correlación y concordancia de ADN de detección de metilación.
Las correlaciones de ZnF señales de metilación del ADN entre los tejidos tumorales primarias y enjuagues salival (detectado por el ensayo QMSP ) entre los pacientes HNSCC de la cohorte de validación se evaluaron mediante el coeficiente kappa y coeficiente de Spearman. concordancia Acuerdo se calculó usando estadísticas kappa.
Sensibilidad y Especificidad La cuantificación.
Los valores QMSP de metilación de las muestras de saliva fueron calculados utilizando un método de la curva estándar y se normalizaron a un control de carga de ADN metilación independiente (
β-actina
). nivel de metilación de cada gen se trató como una variable binaria (metilado frente a no metilado) por la dicotomización de la metilación en la detección de la metilación del ADN cero por QMSP. Los sujetos con un diagnóstico de HNSCC se definieron como "presencia de la enfermedad", y la "ausencia de enfermedad" sujetos fueron definidos por los controles normales. Es cierto que los verdaderos tasas de falsos positivos y negativos negativos, falsos positivos se determinaron luego por los genes individuales. Para la combinación de marcadores, el paciente fue clasificado como "positivo" si cualquiera de los marcadores fueron positivos, y "prueba negativa" si todos los marcadores fueron negativos. La sensibilidad se calcula como la proporción de pacientes que eran prueba positiva entre las personas con la enfermedad, y la especificidad se calcula como la proporción de pacientes que eran prueba negativa entre aquellos sin la enfermedad. El intervalo de confianza del 95% (IC) para la sensibilidad y especificidad se calculó suponiendo una distribución binomial [46].
Resultados
Identificación de los valores extremos de genes diferencialmente metiladas
Desde el genoma el análisis de metilación del ADN diferencial de 44 tumores primarios y 25 controles de tejido normal, biomarcadores candidatos fueron seleccionados basado en el esquema que se muestra en la figura 1. Con base en el número de muestras de valores atípicos y la intensidad relativa de la señal, 37 de los mejores candidatos de clasificación fueron seleccionados para su posterior análisis (S4 Tabla). Correlación de la expresión y de la matriz de metilación de datos permitidas por el descubrimiento de 24 genes candidatos (de 37 genes iniciales) con correlación negativa biológicamente relevante entre la metilación del ADN y la expresión génica (Tabla 1). En particular, los 24 genes candidatos mostraron hipermetilación y la disminución de expresión en muestras de tumores. Por otra parte, todos los candidatos mostraron una mínima señal de metilación del ADN en tejidos normales, con una media máxima de β-valor para las muestras normales de 0,058, o un 6% de metilación (Fig S1 y el cuadro S5). La norma t-test demostró que 23 de los 24 genes (96%) tenían diferencia estadísticamente significativa en la metilación del ADN entre muestras normales y tumorales de todo y entre muestras normales y tumorales VPH. Uno de los genes,
CCND2
, no alcanzó significación estadística basada en un t-test, sin embargo, esto demostró una diferencia entre muestras tumorales y normales por una prueba exacta de Fisher basada en la presencia de valores atípicos hypermethylated en muestras de tumores.
contornos esquemática del enfoque integrador utilizado en este estudio, que combina cribado de alto rendimiento de la metilación del ADN y la expresión génica para la cohorte de descubrimiento de HNSCC: el empleo de datos de la matriz de metilación del ADN con sondas de 27.578 totales; normalización de los datos en R, 14.477 genes totales; El análisis de valores atípicos y de corte para recibir aproximadamente 50 genes superiores (puntuación de 13,2 atípico; 37 mejor clasificados genes que se transmiten, véase Métodos para más detalles); La integración de los datos normalizados del ensayo de expresión (22.011 genes); cálculos de los coeficientes de correlación de Spearman (24 genes que se transmiten); 7 ZNFs validación secuenciación de bisulfito; QRT-PCR, 5 ZNFs validación de la expresión génica; Validación de 3 Detección ZNF QMSP en muestras de saliva y de tumores en diferentes cohortes.
El aumento de la metilación y la disminución de la expresión de genes alteraciones en los pacientes VPH
Se sabe que el VPH + y VPH HNSCC casos difieren en su paisaje de alteraciones genéticas y epigenéticas [5, 12, 47, 48]. Mediante la separación de 44 pacientes HNSCC por el VPH, se determinó que el 92% (22 de 24) los genes tenían significativamente más alta en la metilación del VPH CECC, en comparación con las muestras normales (S5 Tabla). Sólo el 4% (1 de 24) candidatos tenía la metilación del ADN en muestras de VPH + HNSCC significativamente mayor en relación con las muestras normales (S5 Tabla). La mayoría, 54% (13 de 24) genes tenía significativamente mayor metilación en VPH HNSCC, en comparación con HPV + muestras, de acuerdo con los datos publicados [12]. Las muestras tumorales tenían una correspondiente disminución de la expresión de genes candidatos (S1 Figura y la Tabla S6). Por lo tanto, 71% (17 de 24) genes demostró una disminución significativa en la expresión génica en todas las muestras HNSCC en comparación con las muestras normales; 75% (18 de 24) genes mostró una disminución significativa en la expresión génica en muestras de VPH en comparación con las muestras normales; y 21% (5 de 24) genes ha disminuido significativamente la expresión génica en muestras de VPH en comparación con HPV + muestras. La disminución de la expresión de genes en muestras tumorales fue consistente con el aumento de la metilación del promotor global en muestras de tumores (Fig S1 y Tabla 1).
Validación de la hipermetilación de genes candidatos
Para validar la metilación diferencial estado de las islas CpG cerca de la región promotora de los 24 genes candidatos seleccionados, la secuenciación de bisulfito se realizó en 5 muestras representativas de las muestras de la mucosa normales y 5 muestras tumorales HNSCC primarios de la cohorte inicial descubrimiento. De los 24 genes, 22 (92%) mostraron un aumento de la metilación en tumores en relación con las muestras normales (figura 2). Veinte genes candidatos (84%) mostraron metilación en más del 50% del tumor primario, incluyendo
ADFP
,
FUZ
,
ZNF71
,
ENPP5
,
ZNF211
,
y ZNF14 gratis (figura 2). datos de secuenciación de bisulfito fuertemente correlacionada con los resultados de la matriz de datos, en los que se detectó la metilación del ADN mínima en muestras normales (Fig S1 y Figura 2).
resultados de la secuenciación de bisulfito se muestran en 5 muestras tumorales HNSCC y 5 tejidos normales de la cohorte de descubrimiento original para las 24 mejores puntuaciones genes candidatos (Tabla 1). cajas negras sombreadas representan los promotores completamente metilados, cajas grises representan los promotores hemimethylated y cajas blancas representan los promotores no metilados.
Zinc candidatos proteína con dedos de
Se observó que 7 de los 24 genes candidatos eran miembros del grupo de zinc de proteínas de dedo (ZNF), y el análisis adicional se llevó a cabo en este grupo. Con el fin de profundizar en los candidatos ZnF, la metilación del ADN se analizó en una cohorte de validación independiente de 59 tumores y tejidos normales (31 S2 Tabla). El uso de métodos de secuenciación de bisulfito, se detectó un aumento significativo de la metilación del ADN para cinco de los genes en esta cohorte (S7 Tabla). Sin embargo, la disminución de la metilación del ADN de
ZNF141
promotor en la cohorte de validación contradice los datos de descubrimiento de cohortes, y, no se detectó metilación del ADN en
ZNF211
en las muestras de la cohorte de validación. De los cinco genes de proteínas ZnF restantes,
ZNF14
,
ZNF160
,
ZNF71
,
ZNF420
y
ZNF585B
, la metilación del ADN fue significativamente mayor en las muestras de tumor, en comparación con los controles normales (S7 tabla).
ZNF regulación a la baja se asocia con la metilación del promotor
para validar la hipótesis de que la expresión de genes individuales de proteínas se ve afectada por ZnF metilación de sus promotores, el análisis de QRT-PCR se realizó posteriormente para
ZNF14
,
ZNF71
,
ZNF160
,
ZNF420
y
ZNF585B
expresión en las muestras de una cohorte de validación independiente (Fig S2). Todos menos
ZNF71
demostró regulación a la baja significativa de la expresión en las muestras tumorales en comparación con tejidos normales, lo que era coherente con el aumento de los niveles de metilación. La separación de las muestras tumorales de acuerdo con el estado de tumores VPH demostró que la expresión ZNF no fue significativamente diferente en el VPH y los grupos de VPH + paciente (Fig S2 y Tabla S7).
ZNF detección de la metilación del ADN es altamente específico para tejidos HNSCC primarias
Basándose en los resultados de metilación del ADN, se planteó la hipótesis de que ZNF metilación podría ser utilizado como un biomarcador clínicamente aplicable para HNSCC. Por lo tanto, los cebadores QMSP y ensayos de sonda fue diseñada para
ZNF14
,
ZNF160
y
ZNF420
. Un ensayo QMSP altamente específico para
ZNF585B
no se podría diseñar debido a su alta densidad de CpG.
Los ensayos fueron validados QMSP primero para los tres genes ZnF en muestras de tejido. Similar a bisulfito resultados de la secuenciación, ensayos QMSP no detectó metilación del ADN en las muestras normales, pero la metilación del ADN se detectó en
ZNF14
,
ZNF160
y
ZND420 Hoteles en 44,1% , 39% y 32,2% de los tumores, respectivamente. Al menos un ZNF fue metilado en 57,6% de los tejidos tumorales. (Tabla 2). En particular, 17% de los pacientes (10 de 59) tenía metilación detectado en los tres promotores ZnF. tasas ligeramente más altos de metilación del ADN se observaron en el grupo de VPH, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 3)
.
Se muestran los resultados ZNF QMSP en 59 muestras de tumores primarios y enjuague salival HNSCC en comparación con el plasma normal y muestras de saliva de enjuague de la cohorte de validación. ZNF la metilación del promotor se cuantificó en relación con la BACT metilación y se multiplica por 100. Más (+) o menos (-) se refiere a su estado de VPH de los pacientes con cáncer. NS = normal muestra salival de enjuague (n = 35), N = tejidos primarios normales (n = 31), TS = enjuague salival de pacientes HNSCC (n = 59, 41 de HPV + [TS +] y 18 de VPH [TS] ), T = primarios muestras tumorales de pacientes HNSCC (n = 59). No hubo detectable metilación del ADN ZNF en muestras normales. Significativa (p & lt; 0,05). Diferencias entre los grupos se indica con un asterisco (*), calculado por la prueba exacta de Fisher
ZNF detección de metilación del ADN en TCGA cohorte
Para validar ZNF la metilación del ADN y su correlación con la expresión en diferentes cohortes HNSCC, la matriz de datos Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip y RNA-Seq fueron descargados y analizados de la cohorte CECC del Genoma del cáncer Atlas (TCGA), que contiene 279 tumores HNSCC, incluyendo 36 HPV +, con muestras normales emparejados. ZNF metilación del ADN fue mínima en muestras normales del TCGA (Fig S3 y Tabla S10), de acuerdo con los datos de descubrimiento y de cohorte de validación. Los tres tenían ZNFs fuerte correlación negativa de la metilación del ADN y la expresión, en especial
ZNF420 gratis (Fig S3). Cabe destacar que, de entre todas las sondas de metilación del ADN disponibles de TCGA, sondas dentro de
ZNF420
promotor tuvieron la mayor tasa de metilación del ADN en muestras HNSCC con detección de metilación mínima en muestras normales. En general, se observó una alta concordancia entre el descubrimiento, validación y cohortes TCGA para la detección de la metilación del promotor ZNF usando cuatro técnicas diferentes para la detección de la metilación del ADN (S9 Tabla).
ZNF detección de la metilación del ADN como biomarcadores potenciales HNSCC
para probar el rendimiento de los ensayos desarrollados para QMSP ZNFs para la detección de la metilación del ADN en los fluidos corporales, emparejados se usaron muestras de enjuague salivales de los pacientes de cohorte de validación CECC. La comparación de las señales de metilación del ADN en las muestras de saliva de aclarado de HNSCC y los pacientes no cancerosos demostró que la especificidad del panel ZNF combinado para detectar HNSCC en estos fluidos corporales era 100% (95% CI: 89,9% - 100%), y el sensibilidad fue del 22% (95% CI: 12,3% - 34.73%) (Tabla 3). En particular, la exploración de ZNF correlación con los datos clínicos metilación de diferentes análisis estadísticos no mostraron asociaciones significativas.
Discusión
A pesar del desarrollo de tecnologías de alto rendimiento y la identificación de prometedoras marcadores de metilación de ADN, nadie biomarcador CECC Actualmente ha sido aceptado para la detección clínica y la vigilancia. Una de las principales preocupaciones de los biomarcadores HNSCC propuestos recientemente es la alta tasa de falsos positivos. Como CECC es una enfermedad muy heterogénea, es difícil definir un único biomarcador tanto con alta sensibilidad y especificidad [10, 11, 25]. Muchos biomarcadores propuestos tienen una sensibilidad muy razonable, pero relativamente baja especificidad, y combinaciones de estos biomarcadores probablemente conducirían a una mayor tasa de falsos positivos [25]. El uso de métodos estadísticos convencionales puede subestimar alteraciones heterogéneos en tumores malignos; Sin embargo, estos retos pueden ser superados mediante el análisis de valores atípicos desarrollado recientemente adaptada de la COPA. Para nuestro conocimiento, este es el primer trabajo publicado que utiliza el análisis de valores atípicos para el desarrollo de la metilación del ADN biomarcador. Mientras que el grupo de candidatos ZNF estudiado en este trabajo siempre 100% de especificidad, los estudios adicionales puede aumentar la sensibilidad mediante la validación de genes candidatos más metilados para el desarrollo de un panel basado en la metilación del ADN de genes múltiples biomarcadores de CECC.
tamaños de cohortes son una serie de publicaciones que utilizan el análisis de metilación del ADN de alto rendimiento, sin embargo muchos han limitado [11-13]. Este estudio fue capaz de utilizar una cohorte previamente publicado que consta de 44 tumor y 25 controles normales para el descubrimiento de biomarcadores potenciales metilados. Por otra parte, los biomarcadores se validaron adicionalmente en una cohorte independiente más grande (con 59 muestras de tumores) y en TCGA (279 muestras tumorales). El uso de la matriz de la metilación del ADN Illumina 27, que ha sido utilizado con éxito por otros [10-14], permitió la definición de biomarcadores potenciales altamente específicos para HNSCC. Sin embargo, se reconoce que las plataformas más completas de metilación del ADN pueden permitir el descubrimiento de un mayor número de alteraciones candidatos.
La correlación de metilación y de expresión es otra poderosa herramienta que se utilizó en este estudio para identificar cambios en la metilación biológicamente relevantes que probablemente ocurrirá más temprano en el desarrollo del cáncer [10, 14]. Sólo los cambios de metilación que se producen más temprano en el desarrollo de tumores permitirán el desarrollo de posteriores cambios de expresión génica. cambios de metilación del ADN que no se correlacionó con la expresión del gen se eliminaron para definir un panel más centrado de 24 candidatos biomarcadores de genes metilados. Por otra parte, la correlación de la metilación del ADN con la expresión de la matriz de la expresión de genes disponibles ayuda a reducir el sesgo de plataforma única. etapas de validación múltiples se realizaron en este estudio, que incluía un total de tres cohortes de muestras HNSCC, así como cuatro técnicas de detección diferentes para la metilación del ADN (arrays Illumina 27 y 450, de secuenciación de bisulfito y QMSP) y tres técnicas diferentes para la expresión de genes (Affymetrix matriz, RNA-Seq del TCGA y QRT-PCR). Se observaron resultados consistentes entre las diferentes cohortes y técnicas (S9 Tabla). Estas etapas de validación confirmaron alta especificidad y la fiabilidad de los biomarcadores basados en la metilación del ADN ZNF detectados para HNSCC.
Se observaron niveles más altos de la metilación del promotor en VPH pacientes en varios genes supresores de tumor putativo incluyendo miembros de la familia de dedos de cinc, consistente