Extracto
A pesar de la mejora de los resultados en los últimos 30 años, menos de la mitad de todas las mujeres diagnosticadas con cáncer de ovario epitelial en vivo cinco años después de su diagnóstico . Aunque normalmente tratada como una sola enfermedad, el cáncer epitelial de ovario incluye varios subtipos histológicos distintos, tales como carcinomas serosos papilares y endometrioide. Para determinar si las diferencias morfológicas observadas en estos carcinomas representan características distintas a nivel molecular se analizaron los patrones de metilación de ADN en 11 tumores papilares serosos, 9 endometrioides tumores de ovario, 4 normales muestras del tubo de Falopio y 6 tejidos endometriales normales, además de 8 trompa de Falopio normal, y 4 muestras serosos de TCGA. Para la comparación dentro del subtipo endometrioide añadimos 6 tumores uterinos endometrioid primaria y 5 metástasis endometrioid desde el útero al ovario. Se obtuvieron datos de 27.578 dinucleótidos CpG se producen en o cerca de regiones promotoras de 14.495 genes. Se identificaron 36 lugares con importantes aumentos o disminuciones en la metilación en las comparaciones de los tumores serosos y las muestras del tubo de Falopio normales. Por otra parte, las técnicas de agrupamiento no supervisado aplicadas a todas las muestras mostraron tres perfiles principales que comprende en su mayoría muestras normales, los tumores serosos, y tumores endometrioid incluyendo ovario, de útero y de origen metastásico. El análisis de la agregación identificó 60 sitios metilados diferencialmente entre el grupo serosa y el grupo normal. Un conjunto relacionado de 25 tumores serosos validó la reproducibilidad de los patrones de metilación. En cambio, & gt; 1.000 genes se metilado diferencialmente entre los tumores endometrioides y muestras normales. Este hallazgo es consistente con una interrupción de regulación generalizada causada por un fenotipo methylator. A través de la metilación del ADN analiza hemos identificado genes con funciones conocidas en la etiología de carcinoma de ovario, mientras que la vía análisis proporcionó información biológica a la función de nuevos genes. Nuestro hallazgo de diferencias entre los tumores ováricos serosos y endometrioid indica que las estrategias de intervención se podrían desarrollar para tratar específicamente los subtipos de cáncer de ovario epitelial
Visto:. Kolbe DL, DeLoia JA, Porter-Gill P, M extraño, Petrykowska HM , Guirguis A, et al. (2012) Análisis diferencial de cáncer de ovario y de endometrio identifica un methylator fenotipo. PLoS ONE 7 (3): e32941. doi: 10.1371 /journal.pone.0032941
Editor: Joseph Califano, Escuela de Medicina John Hopkins, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 29, 2011; Aceptado: February 2, 2012; Publicado: 5 de Marzo, 2012
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Financiación:. Los fondos son proporcionados por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano, Institutos Nacionales de Salud (LE y LB), del Departamento de Defensa del Gobierno de China#04-124 y Magee Womens Instituto de Investigación /Scaife Grant (TCK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario tiene una incidencia de 21.500 casos por año en los Estados Unidos y 204.000 en todo el mundo, con una mortalidad anual estimada de 125.000 mujeres. La condición se ubica como el 5
ª causa principal de muertes relacionadas con el cáncer para las mujeres en los Estados Unidos; la alta tasa de mortalidad es una consecuencia de la naturaleza asintomática de la enfermedad en estadio temprano y la ausencia de una prueba de detección fiable. La mayoría de los casos (75%) son diagnosticados en una etapa avanzada (III o IV) en el que la tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 30% [1].
De los cuatro principales subtipos histológicos, es serosa el más común, seguido por endometrioide, mucinoso y tipos de células claras. Estos subtipos tienen perfiles de expresión de genes distintivos [2] y se clasifican en virtud de su semejanza morfológica normal del tubo de Falopio, el endometrio, endocérvix y las células endometriales claros, respectivamente [3]. La semejanza entre los subtipos de tumores y tejidos distantes es consistente con los modelos que proponen la migración de lesiones precursoras de orígenes dispares, tales como las trompas de Falopio [4] o el revestimiento mesotelial de la cavidad peritoneal [5]. Por esta razón, tumores serosos de ovario (que se asemejan a los epitelios de Müller) se pueden legítimamente en comparación con trompa de Falopio normal (que se deriva de Mullerian epitelios). Sin embargo, el epitelio superficial del ovario (OSE) Capa [6] comparte su origen con el epitelio del endometrio (conocido como epitelio celómico [7]) y sigue siendo una explicación alternativa plausible para "de novo" tumorigénesis.
Al igual tumores serosos, el origen de los tumores endometrioides es controvertido [8], y se han propuesto las células progenitoras que proceden de fuentes no de ovario, tales como endometriosis [9]. Los tumores con histopatología endometrioide se diagnostican tanto en el útero y ovario. Ellos ocurren frecuentemente, como tumores primarios o metástasis sincrónicas desde el útero al cáncer de ovario [10]. Considerando que las diferencias moleculares se han reportado en los tumores primarios duales, los tumores metastásicos son idénticos por clonación [11].
estudios de expresión génica de los tumores de ovario destinados a detectar perfiles específicos de cáncer han dado un éxito modesto y reproducibilidad limitada [12], [13], [14], [15]. Sin embargo, los estudios de perfiles mutacionales han arrojado resultados más consistentes, lo que demuestra que los tumores serosos y endometrioid tienen agresivos, subtipos de alto grado [16], [17], [18] con mutaciones en el
TP53
genes [19 ], [20], [21] a pesar de sus evidentes diferencias histológicas [16], [17], [18]. subtipos de bajo grado son más comunes en los tumores con mutaciones endometrioid ocurre predominantemente en
WNT
y
PIK3CA
vías [2].
En concierto con los perfiles de expresión génica y mutaciones, delinear el epigenoma de las células tumorales debe revelar las relaciones entre las muestras que reflejan los orígenes embriológicos comunes, los resultados histopatológicos similares, o eventos mutacionales compartidos. En los tumores de ovario, la metilación del ADN silencia la expresión de genes críticos [22], [23], y crea haploinsuficiencia genética [24], mientras que en otros sitios hipometilación permite la expresión de genes que normalmente están silenciados. Como prueba de principio, los patrones específicos del lugar de la metilación del ADN fueron utilizados recientemente para distinguir cuatro subtipos de cáncer de ovario epitelial, utilizando un total de 1.505 loci diana CpG [25], [26].
La hipótesis de que el ADN los patrones de metilación en los tumores de ovario se asemejan a las células de su tejido de origen putativo, con un pequeño número de cambios que representan eventos asociados con la malignidad, que representan de forma única cada subtipo de tumor. Por otra parte, también la hipótesis de que uterinas y ováricas tumores endometrioides estaban relacionados por mecanismos patógenos, que se observan en los patrones de metilación del ADN. Para hacer frente a estas ideas, se examinaron los perfiles de metilación de sitios CpG 27.578 diana que representan 14.495 genes en el genoma humano, usando ADN derivado de tumores serosos y endometrioide del ovario, trompa de Falopio normales y endometrio normal y los tumores endometriales endometrioides primarios y metastásicos. Este gran conjunto de datos se analizaron mediante un análisis supervisado seguido por
de novo
clasificación utilizando la agrupación de cálculo sin supervisión. Para mejorar la resistencia de la técnica de perfiles epigenéticos, se incluyeron los datos en bruto de metilación tumores serosos y las trompas de Falopio normales generadas a través del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA). Estas muestras se analizaron utilizando la misma plataforma de metilación, y realizados por laboratorios de investigación independientes usando muestras de tumores independientes.
Resultados
ensayo experimental y el diseño
Se analizó el estado de metilación del ADN de las muestras genómicas utilizando la plataforma Illumina Infinium. ADN se trató con bisulfito para convertir citosinas no metiladas en uracilo, dejando sin cambios las citosinas metiladas. La reacción de hibridación en la HumanMethylation27 Illumina BeadChip proporcionado específico señal a los estados metilados y no metilados, utilizando la extensión de una sola base protocolo de ensayo Illumina [27]. La hibridación diferencial de sondas a sitios diana metiladas y no metiladas se tabuló como la fracción de la señal total que correspondía al estado metilado. El conjunto inicial de la muestra representada diversos tipos de tejidos y tumores incluyendo normal del tubo de Falopio, el endometrio normal, carcinoma seroso papilar ovárico, carcinoma endometrioide del ovario, y carcinoma endometrioide endometrial primario y metastásico de 42 pacientes (Tabla 1). Técnico repeticiones indicaron resultados altamente reproducibles para el ensayo (Figura S1). Además, se incluyeron los datos de la misma plataforma Illumina metilación de 12 muestras adicionales de la base de datos pública del proyecto Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA). Este conjunto consta de 8 muestras de control (trompa de Falopio normal) y 4 muestras de tumores (ovario seroso), contribuyó en un único lote de muestras examinadas en condiciones experimentales consistentes de un proveedor de datos.
metilación granel
Para evaluar los cambios brutos en grado de metilación, se examinaron los niveles de metilación agregados de todas las muestras. Los valores de ensayo se presentan como la proporción de la fluorescencia resultante de la sonda para el estado metilado, desde 0 (todo el ADN no metilado) a 1 (todo el ADN metilado). La comparación de todas las muestras, la gran mayoría mostró perfiles de metilación consistentes. En todo el genoma, los sitios más ensayados tenían niveles de metilación entre 0 y 0,2, un pequeño número de sitios tenían niveles entre 0,2 y 0,8, y un número ligeramente mayor tenían niveles de 0,8 a 1 (Figura 1).
Frecuencia de metilación en todos los loci para un nivel dado de la metilación (rango de 0 a 1). Cada muestra biológica se representa como una sola línea; todas las muestras no metastásicos se representaron. Respectivamente, paneles de izquierda a derecha contienen todos los loci (N = 27.561), el cromosoma X solamente (N = 1038), o el cromosoma 10 sólo (N = 1044).
Por el contrario, teniendo en cuenta sólo el se esperaba que el cromosoma X, de una sola copia por silenciamiento aleatoria X-inactivación para producir un nivel de metilación de 0,5. El patrón observado mostró un pico ancho centrado a 0,5 para la mayoría de las muestras, a pesar de que las muestras tumorales tenían más extensa heterogeneidad. Cinco muestras de tumores serosos mostraron un perfil distinto, con muchos loci ser no metilado (es decir, nivel de metilación & lt; 0,2), lo que indica ya sea la incapacidad de mantener X-inactivación o copiar alteraciones en el número con exceso relativo de la X activa [28]. Para evaluar si esta variación observada fue simplemente debido al pequeño número de loci en el cromosoma X, también se consideran los niveles de metilación en el cromosoma 10, que tenía un número similar de sondas. El patrón para el cromosoma 10 se parecía al patrón a través de todos los loci autosómicos, con altos niveles de similitud entre muestra y muestra.
análisis supervisado
Se consideraron en primer lugar si los subtipos de tumores (definido por histopatología) correspondieron a los perfiles de metilación específicos. Con la inclusión de las muestras del TCGA, 12 muestras normales trompa de Falopio y 16 tumores serosos de ovario cedieron el poder estadístico suficiente para una comparación directa. Las sondas con un mal control de calidad, de alta variabilidad en los controles, o se encuentra en X o Y-cromosomas no se consideraron (ver Métodos). Usando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para identificar sitios que consistentemente asociados con la clasificación anterior, 36 fueron significativas a p & lt; 0,05 después de la corrección de pruebas de múltiple (14 a p & lt; 0,01; Tabla 2). Tres genes fueron identificados como miembros de la vía canónica para el cáncer de ovario en un ingenio Pathway Análisis (IPA) (Tabla 2; [29] [30] [31] [32]). análisis supervisado de los tumores de ovario endometrioide contra los controles trompa de Falopio o del endometrio no se realizó debido al pequeño número de muestras.
agrupamiento no supervisado
Para resolver si otras divisiones de la muestra por compartir molecular fenotipos existían y tengan una visión más amplia de las relaciones entre los tipos de muestras, nos trasladamos a la agrupación sin supervisión. Utilizando el conjunto completo de 31 muestras de tumores primarios y 18 tejidos normales (y excluyendo los 5 metastásico muestras utilizadas para el análisis secundario), limitamos el análisis a las sondas que se encontraban en la parte superior 500 cuando calificados por la varianza, según lo informado por Houseman et al. [33] para reducir la dimensionalidad de los datos. Los resultados de varios algoritmos de agrupación se reunieron en la misma interpretación de los grupos fenotípicos distintos (Figura S2). K-significa la agrupación y la partición utilizando un modelo de β-mezcla diseñado para los datos de esta plataforma de [33], tanto apoyado fuertemente la existencia de 3 grupos primarios, que corresponde aproximadamente a controlar de tipo muestras, muestras de tipo tumor seroso, y muestras endometrioide. Un análisis adicional con la agrupación jerárquica (a través de múltiples medidas de distancia y métodos de vinculación) apoya firmemente el tipo de control y tipo de endometrio racimos, e indicó las serosas muestras del tipo de tumor eran un grupo afuera de las muestras de control, pero era incompatible en cuanto a si estas muestras formadas un subgrupo distinto (Figura S2).
las agrupaciones de consenso, como se muestra en la Figura 2, están marcados con una barra de color para indicar el tipo normal de tipo seroso o de tipo endometrioide. Cabe destacar que el grupo de control contenía trompa de Falopio normal y endometrio normal, lo que indica un fenotipo consistente a través de ambos tejidos dentro del conjunto de sondas destacados. Las muestras del TCGA agrupados con sus tipos de muestras identificadas, lo que confirma la reproducibilidad y robustez de los resultados, ya que estos tumores se obtuvieron y se clasifican en diversas instituciones. La exclusión de las muestras del TCGA del análisis tuvo impacto relativamente pequeño en los resultados, en los que una división marcada permaneció entre el endometrioide y seroso o muestras de control; sin embargo, sólo permaneció débil apoyo para una subdivisión de los tumores de tipo seroso de las muestras de control
Mapa de calor de los niveles de metilación.; azul = 0.0, negro = 0,5, amarillo = 1,0. A la izquierda, una muestra representativa de la agrupación jerárquica, y bloques de color que da los grupos de consenso. Seis columnas de la derecha dan características de la muestra: número; tumor (T) o normal (N); ubicación en el ovario (O), las trompas de Falopio (F), o endometrio (E); Histología de serosa (S) o endometrioide (O); grado (1-3; donde los símbolos utilizados son '-' para las normales y 'NA' para la información no está disponible.) y en el extremo derecho, puntos para los datos del TCGA públicas. Cinco muestras en la parte inferior son las metástasis ováricas de tumores endometriales endometrioide, excluidos del análisis inicial y la agrupación.
El conjunto de muestras endometrioide, incluyendo tumores de ambos sitios ovárico y uterino, muestra un perfil notablemente alterada, con la metilación en numerosos sitios que son islas CpG no metilados normalmente, y una pérdida de metilación en los sitios que están normalmente metilado. El alcance y la reproducibilidad de estos cambios es una fuerte reminiscencia de los fenotipos observados en methylator otros tipos de cáncer [34] [35]. Un fenotipo methylator ha propuesto previamente para el carcinoma endometrioide endometrial, basado en la metilación de promotores de unos pocos genes diana [36], pero no ha a nuestro conocimiento ha descrito en una encuesta a nivel genoma o en el cáncer de ovario.
Estos datos confirman la hipótesis de que los tumores de tipo endometrioide, ya sea en los sitios de ovario o de útero, comparten similitudes a nivel molecular. Para seguir haciendo frente a este hallazgo, se analizaron cinco metástasis ováricas derivadas de tumores endometriales primarios utilizando una prueba de probabilidad log-ratio anidada. Esta prueba se dirigió a la consistencia de la agrupación con las muestras endometrioid primarios frente a los tumores serosos y controles combinados, y en segundo lugar habilitado clasificación dentro de los grupos de control serosas o cuando sea necesario. Cuatro de las cinco muestras fueron fuertemente identificados como de tipo endometrioide, mientras que el quinto era más similar a las muestras de control (muestra 54; Figura 2). La quinta muestra no aparece groseramente alterada de la metilación de tejido endometrial normal que indica que el fenotipo tumoral mayoría no es universal. Este valor atípico puede representar una subdivisión poco frecuente de tumores endometrioide, como resultado de diferentes patologías subyacentes, sin embargo, no representa un tumor de bajo grado (Figura 2).
La evaluación de los tumores primarios de todos los histopatologías también identificó los valores extremos poco frecuentes. Los ejemplos incluyen muestras endometriales endometrioid 47 y 49, los cuales agrupan con los tejidos normales y contribuyeron al 15% de las muestras que mostraban discordantes colocación relativa a su histopatología asignado (grado 1 y grado no está disponible, respectivamente; Figura 2). Cuatro tumores serosos de ovario también agrupados con los tejidos normales, que muestra los cambios muy limitados en la metilación con respecto a los controles (grados 2 y 3). Dada la similitud fenotípica de estas muestras con los controles normales, el apuntalamiento biológica de este subconjunto de tumores requiere más investigación. Además, una muestra endometrioide del ovario agrupa con los tumores serosos (muestra 36, grado 2), lo que sugiere ya sea un subtipo raro endometrioide con un más agresivo, el perfil serosa similar, o errores de escritura de una muestra pobremente diferenciado.
Diferencial el análisis de conglomerados
Teniendo en cuenta los tres grupos primarios proporcionados por el análisis de agrupamiento no supervisado, que deseaba para identificar loci metilación más predictivo de la pertenencia a una clase en particular. Repetimos la prueba de suma de rangos de Wilcoxon se utiliza en el análisis supervisado, después de dejar de considerar las 500 sondas utilizadas en la agrupación. La comparación de la agrupación de tipo seroso con el grupo de tipo de control, 35 sondas permanecieron significativas a p & lt; 0,01 después de estrictas corrección de Bonferroni para múltiples pruebas y 60 se mantuvieron en p & lt; 0,05 (Tabla 3). Los resultados mostraron una mezcla de hiper e hipometilación en relación con los controles (Figura S3). Un análisis de IPA identificado biomarcadores conocidos para el cáncer de ovario entre esta lista (Figuras S4 y S5). Se identificaron dos genes con relevancia registrada a la metilación del ADN, incluyendo
DNMT3A
, un gen de ADN metiltransferasa y
RB1
.
APC gratis (de la vía beta-catenina),
RBAK1 gratis (un
RB1
compañero de interacción),
MAPK15
y
map2k2
quinasas, y la histona deacetilasa
HDAC1
también estaban en la lista (Tabla 3). Aunque los análisis supervisados y no supervisados utilizan diferentes conjuntos de comparación, las listas de genes contenían 10 entradas superpuestas (Tabla 3).
Teniendo en cuenta la endometrioide-cluster en comparación con el grupo de control, se determinó que el número y el grado de sitios diferencialmente metilado se incrementaron en más de un orden de magnitud. Por ejemplo, 954 sondas fueron significativas a p & lt; 0,01. El gran número de sitios hypermethylated sugiere un defecto subyacente en las vías de metilación del ADN, y limita la utilidad de considerar la metilación alterada de genes individuales.
Validación de metilación diferencial
Para explorar si nuestro conjunto de 60 diferencialmente metiladas sitios en los tumores serosos fue reproducible, se evaluó la metilación de 25 muestras adicionales que eran independientes del conjunto de análisis original. Todo se tipificaron como carcinoma seroso de ovario y se analizaron de forma independiente (independiente de determinación y en tiempo de análisis) de los originales. Para cada sitio y para cada muestra de validación, se evaluó si la metilación se parecía más a la agrupación de la muestra normal o de la agrupación de la muestra del tumor seroso. De las muestras de tumor de 25, 4 se parecía el patrón de metilación de las muestras normales, siete fueron alterados a los 21 o más de los 60 loci, y 14 muestras mostró el patrón alterado en 40 o más de los 60 loci (Figura 3).
la metilación en 60 loci se utilizó para evaluar un conjunto independiente de los tumores serosos. Cada fila representa una muestra individual; cada columna corresponde a uno de los sitios diferencialmente metiladas previamente identificados. Un cuadro vacío indica la metilación más similar a la agrupación de control (no necesariamente metilado); una caja llena negro indica la metilación más similar a la agrupación de los tumores serosos de ovario. Las muestras son ordenados por el número de sitios que tienen la metilación se asemeja el grupo del tumor seroso.
Evaluación de eventos de metilación publicados
Nuestro análisis de metilación diferencial se centró en los cambios que definen las características de cada grupo y fueron compartidos entre todas o casi todas las muestras. Muchos cambios importantes en el estado de metilación, previamente reportados en la literatura, tienen una prevalencia más baja y no se identifican directamente por nuestro enfoque. Cuando se evaluó nuestras muestras de patrones de metilación conocida, nuestros datos fueron consistentes con los resultados publicados. Por ejemplo,
BRCA1
se hypermethylated en 2 de 16 (12,5%) de las muestras de ovario seroso. El supresor de tumor
RASSF1A
mostró evidencia de metilación completa en 11 tumores, y la metilación de una sola copia en 4 más (31% de serosa, y 60% de endometrioide). Estos cambios, y otros, es probable que sean importantes eventos de transformación, pero se limitan a pequeños subconjuntos de las muestras
Gene ontología & amp.; vía analiza
Para atar estos resultados a la literatura sobre el cáncer de ovario, se realizó un análisis de genes ontología (GO) y un análisis de IPA de los genes diferencialmente metilado de la comparación basada en el grupo de tumores serosos frente a los controles. Los genes correspondientes a los loci metilado en nuestra lista mostraron un enriquecimiento estadísticamente significativa para GO términos relacionados con la regulación del ciclo celular (Tabla 4). Los dos mejores redes identificadas por el IPA incluyen "ciclo celular y la morfología de la célula" y "respuesta inflamatoria" con las puntuaciones de la red de 24 y 23, respectivamente. La puntuación de la red se basa en una distribución hipergeométrica y se calcula mediante la prueba exacta de extremo derecho de Fisher, lo que implica que hay un 1 en 10
23 o 10
24 probabilidad de cualquiera de las redes se producen a partir de una lista aleatoria de genes (Tabla 4, Figura S4, S5). Cabe destacar que diferencialmente los genes metilados tuvieron una gran presencia en estas redes, que interactúan con los genes importantes en el desarrollo de tumores de ovario, incluyendo
AKT
,
PI3K
,
VEGF
, y los receptores de estrógenos.
Discusión
Este trabajo representa uno de los mayores estudios de metilación utilizando varios subtipos normales y tumorales de cáncer ginecológico. Se examinó inicialmente el estado de metilación de 27.578 sitios para 49 muestras incluyendo normal del tubo de Falopio y el endometrio, cáncer de ovario seroso, cáncer de ovario endometrioide, cáncer endometrial endometrioide primario y metástasis de ovario de cáncer de endometrio. Independientemente de tumor o estado normal, todas las muestras mostraron perfiles similares en la distribución global de los sitios metilados. Aunque no encontramos cambios globales hacia hiper o hipometilación través de las muestras ensayadas, un subconjunto de las muestras mostró metilación alterada drásticamente para el cromosoma X, en consonancia con la pérdida del cromosoma X inactivo, la amplificación de la X activo restante, o ambas cosas [28 ]. Ejemplos de aneuploidía, incluyendo los autosomas, son comunes en el cáncer de ovario seroso de alto grado y no se determinan directamente por este análisis, pero influyen en los niveles de metilación proporcionales en cada locus. Por lo tanto, hemos eliminado todas las sondas en el cromosoma X de nuestra base de datos.
Nuestros datos confirman que los diferentes subtipos histológicos tienen distintos patrones de metilación. Por otra parte, los tumores serosos de ovario son más similares a los tejidos normales de ovario y endometrio que a los tumores de ovario o endometrio endometrioide, que son muy similares entre sí y muestran cambios drásticos y coherentes a la metilación. Este resultado es consistente con un fenotipo methylator y de acuerdo con un modelo de tumores de ovario endometrioide derivados de la endometriosis, donde las células derivan en última instancia de un linaje uterino. tumores endometrioides desde el ovario y el útero comparten varias mutaciones somáticas comunes [6], y estos datos apoyan un mecanismo patogénico similar. Las marcadas diferencias en los perfiles de metilación entre los subtipos histológicos ponen de relieve la importancia de caracterizar los tumores a nivel molecular con el fin de desarrollar estrategias de tratamiento adaptado.
Para la identificación de loci diferencialmente metilado, que utiliza etiquetas conocidas y cegados (de datos dirigidas subgrupos). etiquetas conocidas identificaron unas pocas docenas de genes, algunos con papeles caracterizado cáncer de ovario. Sin embargo, dada la barra estrictas para la significación estadística en la prueba de un gran número de sitios, se encontró que algunos valores atípicos dentro de un grupo podrían oscurecer patrones importantes. Al agrupar los datos en un enfoque imparcial, encontramos patrones de metilación similares entre las muestras normales y tumorales algunos valores atípicos, lo que indica que las estrategias actuales de subtipos histológicos pueden pasar por alto las distinciones importantes entre los tumores moleculares. Este punto fue apoyado además en los tumores metastásicos endometrioide, que también contenían un valor atípico que parecía una muestra normal en sus patrones de metilación. Nuestro enfoque de agrupación identificó claramente un conjunto de 500 genes que podrían separar la mayoría de las muestras a partir de muestras serosas endometrioide y controles normales. A pesar de la agrupación era distintivo para las tres clases principales de muestras, su uso impide una evaluación estadística de la importancia de los genes dentro del conjunto. Sin embargo, el aumento de potencia de la agrupación 49 muestras identificó un 60 loci adicionales que eran independientes del conjunto de la agrupación y muestras segregadas en subtipos normales o serosos con significación estadística. Varios de estos genes se corresponden con las redes implicados en el desarrollo de cáncer de ovario (Figuras S4 y S5). Se investigó la superposición entre las listas de genes de los genes estadísticamente significativos identificados en los enfoques supervisados y no supervisados y encontramos 10 genes. En particular, la quinasa
PDPK1
se encuentra en la vía de señalización de PI3K involucrados en el cáncer de ovario seroso [37].
PDPK1
y
PLEKHF1
comparten un dominio de homología pleckstrin, capaz de polifosfatos de inositol vinculante.
PARP3
está implicada en la reparación del ADN y la estabilidad del genoma. Dada la señal reproducibles de estos genes, independientemente del método, llegamos a la conclusión de que los genes no caracterizados en esta lista están fuertemente implicados en el desarrollo de tumores de ovario y requieren caracterización adicional.
Una limitación de nuestro análisis es que no nos evaluamos el tumor ADN de mutaciones de genes o niveles de expresión génica ascertain; sin embargo, se encontró que los
RB1
y
RBak ¿Cuáles son diferencialmente metilado entre las muestras del tubo de Falopio y serosos papilares normales.
RB1
se informó recientemente por TCGA estar implicado en la etiología de tumores serosos, por mutación o deleción en el 67% de los tumores [38]. La participación de la
RB1
vía es consistente con Rb1 concurrente y TP53 mutación en ratones, que simula las características de los cánceres de ovario seroso agresivos, incluyendo la formación de ascitis y la metástasis [39]. Aunque no hemos encontrado una coincidencia significativa con la lista de genes metilados en los tumores serosos publicados por TCGA, esta discordancia puede ser debido a cuestiones metodológicas. Por ejemplo, nosotros no limitamos la lista de genes candidatos que se convierten en hypermethylated y halló a muchos que pierden la metilación. Por otra parte, la obligación de que la puntuación sea consistente entre todos los tumores. límites del TCGA anotando al 10% de los tumores. Además, no nos limitamos a los resultados de los genes que se convierten silenciado, como la metilación se ha demostrado que causa tanto de los resultados positivos y negativos de regulación [40].
Nuestro análisis de los perfiles de metilación en tumores de ovario y endometrio indica el valor en la caracterización tumores en el nivel molecular. El fenotipo methylator indica una aberración en la función molecular de las enzimas que regulan los niveles de metilación de ADN y sugiere que una molécula que actúa corriente arriba de los genes candidatos es responsable de la cascada de acontecimientos que conducen al desarrollo de tumores. Los estudios realizados en carcinoma hepatocelular han identificado mutaciones en el gen de la beta-catenina en asociación con un fenotipo methylator. Las mutaciones en la beta-catenina también son comunes en los tumores de endometrio [1], y sugieren experimentos de seguimiento para evaluar una relación directa con la metilación del ADN en los tumores endometrioide. Por otra parte, las estrategias terapéuticas dirigidas a la prevención de una amplia metilación (tales como 5-aza-2'- desoxicitidina) deben ser evaluadas en el contexto de los tumores con un fenotipo methylator.
La consistencia de los perfiles de metilación, a pesar de muestra independiente preparación y recopilación de datos para las muestras del TCGA, se utilizó para validar y ampliar nuestros resultados. Estos datos muestran que los efectos lotes de ejemplo son mínimos y no interrumpen la consistencia de datos. Nuestros datos proporcionan una base para futuros análisis genómicos y genéticos de los tumores de endometrio y serosos para aplicaciones de diagnóstico y tratamiento. En particular, nuestros resultados muestran que los niveles de metilación en tumores serosos son menos consistentes que los tumores endometrioides, pero aumentan y disminuyen de una manera dependiente de la diana. En contraste los tumores endometrioid muestran grandes cambios que probablemente están vinculados a un mecanismo común aguas arriba ido mal.
Materiales y Métodos
Recogida de muestras
de ovario, endometrio y las trompas de Falopio tejidos eran recibido del Programa de Compras del tejido Magee-Womens hospital de (Pittsburgh, PA). Los tejidos se congelaron rápidamente después de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. El ADN genómico se aisló usando el Kit de Sangre Puregene (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. la calidad del ADN se evaluó mediante un espectrofotómetro SmartSpec Plus (BioRad, Hercules, CA).
muestras endometriales normales
Las muestras de tejido fueron proporcionados por la Red Cooperativa de Tejidos Humanos, que está financiado por el National Cancer Instituto. Las muestras son de individuos post-menopáusicas con endometrio atrófico y se obtuvieron de la histerectomía de rutina o resección pélvica para cánceres no endometriales. El ADN fue aislado siguiendo el protocolo del reactivo Trizol (Invitrogen).
El uso de material sujeto humano fue aprobado por la Universidad de Pittsburgh y la Oficina de Sujetos Humanos de Investigación en el NIH.
TCGA datos
TCGA datos fueron descargados en el momento de este análisis desde el portal de datos (http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). Los datos del mismo lote contenían tumores serosos sin igual y las muestras del tubo de Falopio normales. Normales: TCGA-01-0639-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0631-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0642-11A-02D-0383-05, TCGA-01-0628- 11A-01D-0383-05, TCGA-01-0637-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0633-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0630-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0636-11A-01D-0383-05.