Extracto
Capan-1 es un bien caracterizado
BRCA2
línea celular humana deficiente en aislado de una metástasis del hígado de un adenocarcinoma de páncreas. Aquí mostramos una evaluación de todo el genoma de las variaciones estructurales y caracterización del exoma de alta profundidad de variantes de nucleótido único y pequeñas inserciones /deleciones en Capan-1. Para identificar el potencial somático y variaciones asociadas a tumores en ausencia de una línea de células armónicas de lo normal, hemos ideado un nuevo método basado en el análisis de muestras de HapMap. Se demuestra que Capan-1 tiene uno de los genomas reordenados más secuenciados hasta la fecha. Además, pequeñas inserciones y deleciones se detectan con mayor frecuencia en el contexto de la secuencia corta se repite que en otros genomas. También hemos identificado una serie de nuevas mutaciones que pueden representar cambios genéticos que han contribuido a la progresión del tumor. Estos datos proporcionan información sobre los efectos genómicos de pérdida de función BRCA2
Visto:. Peluquero LJ, Rosa Rosa JM, Kozarewa I, K Fenwick, Assiotis I, Mitsopoulos C, et al. (2011) completa el análisis genómico de un
BRCA2
cáncer pancreático humano deficiente. PLoS ONE 6 (7): e21639. doi: 10.1371 /journal.pone.0021639
Editor: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Marzo, 2011; Aceptado: June 3, 2011; Publicado: 5 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Barber et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias Breakthrough Breast Cancer, Cancer Research UK, y la Asociación Americana para la Investigación del cáncer /Contra el cáncer para financiar este trabajo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los individuos heterocigóticos para la pérdida de función de las mutaciones en el gen supresor de tumores
BRCA2 ¿Cuáles son altamente predispuestos a una gama de diferentes tipos de cáncer. Las mujeres que heredan un mutante
BRCA2
alelo tienen un riesgo de por vida significativamente muy elevado de desarrollar cáncer de mama y [1] ováricos. Además, los cánceres de mama y próstata masculinas están fuertemente asociados con
BRCA2
mutaciones de genes [2]. En ambos sexos,
La deficiencia de BRCA2
aumenta el riesgo de desarrollar cáncer de páncreas, estómago, vesícula biliar y de las vías biliares, así como el melanoma [3]. El tratamiento del cáncer de páncreas presenta desafíos significativos como la mayoría de los pacientes presentan localmente avanzado o enfermedad metastásica y terapias contra el cáncer convencionales muestran una eficacia limitada; sólo el 5% de los pacientes con cáncer de páncreas sobreviven más de cinco años desde el diagnóstico inicial [4], [5].
BRCA2 juega un papel clave en el mantenimiento de la integridad genómica, particularmente a través de la regulación de la reparación del ADN mediante homóloga reparación de recombinación (HR) [6] un proceso que también es controlada por otra proteína supresora de tumor, BRCA1 [7]. HR es un proceso en gran medida libre de errores que restablece el orden original en el sitio de un ADN de doble filamento se rompe (DSBs) [8]. DSBs surgen con relativa frecuencia y pueden ser causadas por la replicación celular normal, así como el estrés exógeno tal como la exposición a la radiación [9] ionizante. Ante la falta de recursos humanos, por ejemplo, debido a la pérdida de la función de BRCA2, DSB parecen ser reparado por procesos más propensos a errores que finalmente conducen a la acumulación de reordenamientos cromosómicos brutos [10]. Se cree que la utilización de los procesos de reparación del ADN propensos a errores en la ausencia de la función de BRCA2 más probable fomenta la génesis tumoral [10]. Como parte de su papel en recursos humanos, BRCA2 controla la carga y retirada de la recombinasa RAD51 ADN en las DSB. El filamento RAD51-ssDNA resultante media en la búsqueda de una secuencia de ADN homóloga a la plantilla de la reparación del OSD [11].
A pesar del gran interés en función de BRCA2 y su papel en la génesis tumoral y la reparación del ADN, hay pocos modelos de células tumorales de la deficiencia de BRCA2 que se pueden utilizar de manera productiva en el laboratorio. De éstos Capan-1 es el más bien caracterizado. Capan-1 se obtuvo a partir de una metástasis de hígado en un 40 años de edad, varón de raza blanca con un adenocarcinoma pancreático principal [12], [13]. Estas células carecen de un funcional
BRCA2
alelo y en su lugar llevan un
c.6174delT
alelo. La única deleción de base a
c.6174
causa un desplazamiento del marco, (p.S1982fs * 22) resulta en la pérdida de los C-terminales 1416 aminoácidos de la proteína [14], [15]. La proteína truncada resultante carece de dos motivos BRC implicados en la interacción entre BRCA2 con RAD51 y ssDNA [16], así como las secuencias C-terminales que se cree que se requiere para la localización nuclear de BRCA2 y RAD51 /DNA desmontaje [17], [18] . Esta isoforma truncada BRCA2 se ha demostrado que tanto citoplásmica y disfuncional en HR [19], [20]. De acuerdo con el concepto de que la disfunción BRCA2 conduce a la inestabilidad genómica, análisis de cariotipo SKY ha demostrado que Capan-1 posee un genoma hypotriploid, con 36 reordenamientos estructurales definidos distribuidos a lo largo de todo el genoma [21]. La mayoría de estos reordenamientos probabilidades son muy complejos y parece involucrar más de tres segmentos de cromosomas, aunque dos translocaciones recíprocas (t (6; 15) y t (7; 10)) se han descrito (www.path.cam.ac. uk /~ pawefish).
dado el uso considerable de la línea de células Capan-1 como modelo no sólo de la disfunción BRCA2 sino también de cáncer de páncreas, se utilizó la tecnología de secuenciación próxima generación para estudiar la secuencia genómica de esta línea celular.
resultados
estrategia de secuenciación de ADN
Para identificar reordenamientos estructurales candidatos que generó por primera vez una secuencia de todo el genoma de profundidad media de Capan-1. Se aislaron ADN de una células Capan-1, y generó una biblioteca de fragmento de ADN de 500 pb utilizando un enfoque libre de PCR que mejora la complejidad de la biblioteca [22]. Este banco de ADN fue secuenciado utilizando una estrategia de extremo emparejado en una Illumina Genoma Analizador GAIIx, produciendo 365811868 prima de 76 pb mate-emparejado lee (27,8 Gb). Después de la alineación a un genoma de referencia humana (hg19 /build37) y el proceso de filtración posterior para eliminar duplicados de PCR y de mala calidad lee, estos datos dio cobertura del genoma suficiente (90,09%) para el estudio de reordenamientos estructurales, a una profundidad media de 8,55 -fold (Tabla 1, Tabla S1).
Para investigar la secuencia de codificación de Capan-1 con mayor profundidad, se utilizó una estrategia de enriquecimiento específico basado en Agilent SureSelect captura en solución. Hemos utilizado el kit SureSelect Human All Exon, diseñado para capturar mayor de 38 Mb de ADN genómico humano que corresponden a la base de datos NCBI Consenso de CDS. Dos hibridaciones independientes de captura se realizaron en aproximadamente 200 pb fragmentos de Capan-1 ADN genómico. Las bibliotecas exoma resultantes fueron secuenciados en un Illumina usando GAIIx de extremo emparejado 2 × 76 carreras de secuenciación pb. Esto produjo 130.310.847 de bajo nivel Lee (9,9 Gb). Al igual que en todo el análisis del genoma, la secuencia se lee desde el proceso de captura se alinea con un genoma de referencia humana (hg19 /build37) usando Burrows-Wheeler alineador (BWA, [23]) y después se filtró para eliminar duplicados de PCR y de mala calidad lee. El porcentaje de lecturas en blanco era 65%, alcanzando una cobertura final del 98,51% para las regiones cebadas con una profundidad media de 89 veces (Tabla 1, Tabla S2), muy superior a la profundidad de 30 veces necesario para identificar variantes genéticas en muestras de tumor [24].
Para que las estrategias tanto de todo el genoma y la secuenciación del exoma, más del 80% de lecturas fueron alineados en conjunto con su respectivo compañero de par (Tabla 1). En el caso de todo el genoma re-secuenciación, 5,63% de lecturas asignado a un cromosoma diferente en comparación con su compañero de par, y otros 10,31% de lecturas fueron huérfano, es decir, donde el mate-par no logró alinear debido a un exceso de N o desajustes /indeles (Tabla 1). Esto apoya previas de baja resolución espectral análisis del cariotipo (SKY) de Capan-1 que sugieren un genoma altamente reorganizado [21]. Para la secuencia del exoma, un poco menos dice estaban alineados con independencia de su compañero de par que para la secuenciación del exoma, lo cual sugiere que los reordenamientos dentro de la región de codificación fueron menos frecuentes en Capan-1 que en las regiones no génica (Tabla 1).
Secuencia de profundidad en todo el genoma se comparó con los datos generados por la matriz de hibridación genómica comparada (aCGH) (Fig. S1, el cuadro S1). En general, la profundidad mediana para cada cromosoma identificado por secuenciación se correspondía con el perfil de número de copia generada por aCGH (Fig. S1). Por ejemplo, los cromosomas, tales como 4 y 6, que por aCGH parecía estar presente en dos copias, predominantemente mostraron incluso profundidad a través de toda su longitud. Además, el cromosoma X solo ejemplar devuelto aproximadamente la mitad del número de lecturas de los cromosomas 4 y 6. El informó anteriormente [21], [25] homocigotos supresión de 9p21 que implica
CDKN2A
, y la pérdida de la mayoría de cromosoma Y, también fueron confirmados por secuenciación. (Figura 1A; Fig. S1, el cuadro S1)
A. Circos trama de todo el genoma de los reordenamientos identificados en Capan-1 por análisis BREAKDANCER. Un ideograma de un cariotipo normal se muestra en el anillo exterior y el número de copias está representado por la línea azul en los anillos intermedios. La posición relativa y la clase de cada reordenamiento se representa dentro del círculo interno, como se describe en la leyenda. B. Comparación del número total de reordenamientos inter e intra-cromosómicas detectadas por análisis BREAKDANCER en un panel de
BRCA2
,
BRCA1
, y no
BRCA
ha mutado líneas celulares y tumores primarios. C. Las muestras fueron clasificadas como
BRCA
-mutated (mut) o BRCA de tipo salvaje (WT), y el número de inter, intra-cromosómicas, y se compararon los reordenamientos totales. valores de p se refieren a análisis de Mann Whitney con aproximación gaussiana. D. Comparación del porcentaje de cada clase de reordenamiento en cada muestra. Las muestras se clasifican como
BRCA2
,
BRCA1
, y no
BRCA
ha mutado, como en B.
variación estructural
Para identificar reordenamientos estructurales candidatos, analizamos toda la secuencia del genoma de las células Capan-1 utilizando BREAKDANCER [26]. Se utilizó un método de filtrado estrictos que los reordenamientos únicamente se han identificado con el apoyo de por lo menos diez lecturas (la profundidad media en todo el genoma fue 8.55x). Este enfoque identificado 354 grandes variaciones estructurales en Capan-1, que eran sub-clasificarse como deleciones intracromosomal, inserciones, inversiones, translocaciones o directas o invertidas inter-cromosómicas (Fig. 1A). No hay inserciones se detectaron en este análisis, ya que todos ellos estaban dentro de los límites de tamaño de los fragmentos de distribución normal (1-1000 pb).
Dado que Capan-1 es un modelo deficiente BRCA2, se investigó la posibilidad de que a medio profundidad, la secuenciación de todo el genoma se podría utilizar para distinguir BRCA1 y tumores deficientes en BRCA2 a partir de formas no familiares. Hasta la fecha, dos tumores BRCA2 deficientes, dos tumores deficientes en BRCA1 y líneas celulares deficientes dos BRCA1 también han sido sometidos a profundidad media secuenciación de todo el genoma, como parte de un estudio más amplio de tumores de mama primarios y líneas celulares [27]. Se obtuvieron los datos en bruto de este estudio [27], y procesado a través de nuestra propia tubería, que incluyó el análisis con BREAKDANCER. De esta manera, hemos sido capaces de comparar directamente la frecuencia y el tipo de reordenamientos estructurales identificados en Capan-1 con las dos tumores deficientes y competente primarios de mama BRCA y líneas celulares (Fig. 1B-D). De todos los genomas estudiados, Capan-1 exhibió los reordenamientos más estructurales, tanto inter e intracromosómica (Fig. 1B). Aunque el número de la muestra en estudio fue relativamente baja (n = 7
BRCA
tumores mutantes vs n = 15 no
BRCA
tumores mutantes) comparación de los datos Capan-1 con los datos de
BRCA2
tumores primarios de mama mutantes y
BRCA1
tumores primarios de mama líneas celulares mutantes y sí sugirieron una tendencia para las muestras deficientes en BRCA que presentan un mayor número de reordenamientos estructurales, (mediana del número de
BRCA
= 72 tumores mutantes reordenamientos, mediana del número de no-
BRCA
tumores mutantes = 41; Fig. 1C), en consonancia con las funciones de los genes BRCA1 y BRCA2 en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Aunque esta observación no fue estadísticamente significativa (p = 0,1368, Mann Whitney), esto se podría atribuir al tamaño de la muestra. Por otra parte, como mutaciones en genes distintos de
BRCA1
y
BRCA2
afecta HR, es muy posible que algunas de las muestras clasificadas como "no-
BRCA
" podría también tener una deficiencia de recursos humanos similar a
BRCA1 /2
tumores mutantes. El porcentaje de reordenamientos totales en cada clase se comparó también a través de la
BRCA
grupos -mutant y no mutantes (Fig. 1D). En Capan-1, como en la mayoría de los otros genomas, deleciones intracromosomal eran la clase más frecuente de reordenamiento. Sin embargo, no había ningún tipo de clara o patrón de reordenamientos que era específico de
BRCA
células -mutant, en base a este pequeño grupo de muestras.
Se han identificado previamente una serie de reajustes estructurales brutas en Capan-1 usando cariotipo espectral (SKY) el análisis [21]. Sin embargo, la resolución de SKY análisis es relativamente baja y en muchos casos las posiciones de muchos de los reordenamientos putativos identificados con este tipo de análisis no se pueden predecir con cualquier gran confianza de coordenadas. Teniendo en cuenta esto, sólo intentamos un análisis comparativo de los datos con los datos de NGS cielo donde el coordinar las posiciones de SKY predijeron reordenamientos podría hacerse dentro de ~ 10 Mb. Este análisis comparativo sugiere que seis de los reordenamientos identificados previamente como se pudo determinar mediante secuenciación de todo el genoma, pero a una resolución más alta (Tabla 2). Un reordenamiento complejo aún más entre los cromosomas 6, 8, y 17 habían sido previamente sugerido por el análisis de SKY, aunque no el suficiente detalle como para elucidar las regiones exactas de cada cromosoma implicado. Nuestro análisis también sugirió translocaciones complejas entre los cromosomas 6 y 8, y entre 8 y 17 (Tabla 2).
Curiosamente, once de los reordenamientos interchromosomal identificados identificados en Capan-1 parecía coincidir con regiones génica en ambos puntos de interrupción, lo que sugiere potencialmente eventos de fusión de genes (Tabla 3). Ninguna de estas fusiones han sido reportados previamente en el Censo del Genoma del Cáncer [28]. Otros 42 reordenamientos se encontraron dentro de un gen o regiones reguladoras aguas arriba en un punto de interrupción, que también podría tener efectos deletéreos (Tabla S3). Uno de estos reordenamientos tenían un punto de interrupción en un gen,
ZNF521
, que recientemente ha sido identificado como el objeto de translocaciones cromosómicas en la leucemia linfoblástica aguda [29]. A más de 118 genes parecían estar afectados por reordenamientos intracromosomal (Tabla S4).
Exoma variante de un solo nucleótido (SNV) y Indel descubrimiento
Para identificar SNVS y pequeña inserción /deleción ( indel) eventos en la secuencia codificante de Capan-1, hemos utilizado SAMtools [30] para el análisis choque en cadena de la secuencia del exoma de alta profundidad y la posterior llamada SNV. Pequeños indeles (1-6 pb) fueron identificados mediante una canalización personalizada (ver Métodos). Larger descubrimiento indel se logró utilizando Pindel [31]. En el primer caso, las variantes se filtraron para excluir los detectados a una profundidad de menos de diez lecturas por copia. SNVS y indeles que se hace referencia como polimorfismos de población general en dbSNP también se tuvieron en cuenta, en gran medida, ya que estábamos interesados en la identificación de los posibles cambios específicos del cáncer.
Al igual que la mayoría de las líneas celulares derivadas de tumores, Capan-1 no lo hace tener una línea celular normal emparejado del mismo paciente que se podría utilizar para ayudar a identificar los cambios específicos de cáncer y eliminar artefactos derivados de la producción y la alineación de la muestra. A la luz de esto, hemos desarrollado un proceso de filtración para la resecuenciación exoma, basado en la comparación cruzada con los datos obtenidos de la preparación de la muestra análoga y el análisis de cuatro muestras normales genoma HapMap (NA11881 (masculino); NA12761, NA12813, y NA12892 (hembra )) (Tabla S5). El uso de estas muestras HapMap, hemos sido capaces de quitar los artefactos derivados de la producción de la muestra (por ejemplo, la variación en la eficiencia de la hibridación) y la alineación (por ejemplo, regiones homólogas).
El análisis de los datos obtenidos a partir de resecuenciación exoma de las muestras de HapMap habilitado nos permite establecer límites para la homocigosis (variante lee & gt; 88% o & lt; 10% del total) y la heterocigosidad (variante lee 33-67% total) de variantes. Estos umbrales se utilizan para filtrar los SNVS y indeles identificados en el genoma de las células Capan-1. Por otra parte, ya que estábamos interesados en la identificación de mutaciones específicas del tumor candidatos, no tuvimos en cuenta todas las mutaciones que también fueron detectados en las muestras de HapMap, como la normalización aproximada de la variación de la línea germinal probable.
A medida que un mayor nivel de rigurosidad también número de copias Considerado cambia en todo el genoma Capan-1, tal como se define por el análisis aCGH. Esto es particularmente relevante para los genomas reordenados altamente aneuploides y, como Capan-1. Basándonos en nuestra experiencia, el uso de filtros específicos de la región para la profundidad de secuenciación facilita la identificación variante más fiable. Claramente, las variantes heterocigotos llamados en las regiones de copia única es probable que sean falsas (muy probablemente debido a la desalineación), y en otras partes, el número de lecturas que lleva el alelo variante puede fluctuar de forma diferente dependiendo del estado de número de copias. Por lo tanto umbrales de confianza se aplicaron a ambos SNV y el descubrimiento indel, lo que requiere un mínimo de 10 lecturas por copia genómica. Además, dice estaban requiere al menos tres variantes para llamar a un SNV y al menos siete variante lee por indeles, por copia genómica. El catálogo resultante de SNVS y indeles identificados en Capan-1 se detallan en las Tablas S6 y S8, respectivamente.
Caracterización de codificación SNVS
rendimiento estudios de secuenciación de genes candidatos bajas en Capan-1 tienen previamente identificado tres SNVS homocigotos en
KRAS
,
SMAD4
y
MAP2K4
. El uso de la secuenciación del exoma, hemos sido capaces de detectar todos los tres de estos cambios: el
KRAS
c.35G & gt; T mutación que causa la sustitución de aminoácidos p.G12V clínicamente relevante [32], [33], la c .1028C & gt; G SNV en
SMAD4
que da como resultado un codón de parada prematuro [34] y el
MAP2K4
c.661G & gt; T mutación en Capan-1, lo que conduce a un asociado con el cáncer proteína de truncamiento [35]. La aparición de los tres de estas mutaciones en la lista filtrada final del exoma variantes, dio confianza a nuestras tuberías de análisis (Tabla S6).
El uso de la secuenciación del exoma de alta profundidad, se identificaron un total de 608 SNVS en Capan -1 que afectan a diferentes transcripciones 1270 (Tabla 4). La mayoría de las mutaciones (61%) se encuentran en las regiones no codificantes (intrones genes o no codificante), o variantes eran sinónimos. Veinticuatro por ciento de los afectados transcripciones fueron modificados por los cambios de codificación no sinónimas. En total, se detectaron SNVS no sinónimas en 206 genes diferentes, 56 de los cuales eran homocigóticos (Tabla S6). Doce genes ganaron codones de terminación prematuros, cuatro de los cuales eran homocigóticos (
GRIA3
,
GRM1
,
MAP2K4
,
SMAD4
). De manera significativa, el número de mutaciones de codificación somáticas probables detectados para Capan-1 en este estudio comparó muy favorablemente con los que se muestran en estudios anteriores que examinan las líneas de células tumorales COLO-829 (172 SNV no sinónimo) [36] y NCI-H209 (94 no sinónimo SNV) [24]. Ambos de estos estudios anteriores identificadas mutaciones somáticas por comparación con un control de ADN de sangre normal emparejado del mismo paciente, lo que sugiere que el uso de exomas HapMap es una alternativa eficaz para la identificación de mutaciones somáticas en Capan-1, y otra célula "huérfano" líneas
Tres de la novela potencial truncando mutaciones fueron seleccionados para la validación mediante secuenciación de Sanger:.
GRM1 gratis (
c.C1458A
, p.Y486 *),
SMAP2 gratis (
c.C764G
, p.S255 *), y
GLT6D1 gratis (
c.G593A
, p.W198 *). Los tres mostraron ser verdaderos SNVS, y el cigocidad detectado por la secuenciación del exoma también se confirmó mediante secuenciación de Sanger: homocigotos para
GRM1
, heterocigotos para
SMAP2
y
GLT6D1
(Fig. 2A-C).
GRM1
codifica un receptor metabotrópico de glutamato, la expresión aberrante de que se ha sugerido que desempeñar un papel en el desarrollo de melanoma [37]. SMAP2 es una proteína activadora de GTPasa-ARF1 específico implicado en el tráfico de membrana dependiente de clatrina [38]. El
GLT6D1
gen codifica una-6-dominio que contienen la proteína glicosiltransferasa, que aún no caracterizada.
A. Cromatograma que representa el tope de ganancia SNV en
GRM1
detectado por Capan-1. Las secuencias de proteínas y de referencia genómico se muestran por encima de la cromatograma. El SNV está resaltado en azul en la secuencia de referencia, y se subraya el residuo afectados. B. Como A, por
SMAP2
. C. Como A, por
GLT6D1
. D. Comparación de las frecuencias de sustitución de una sola base en Capan-1, tumor de mama de tipo basal, NCI-H209, COLO-829, y U87 MG genomas. E. Comparación de todo el genoma y las frecuencias de sustitución de bases-exoma específica observada en Capan-1.
Todos los nuevos SNVS identificados aquí fueron una referencia cruzada con una serie de bases de datos en línea (Tamizar [39 ], [40], la mutación Taster [41], [42], DAVID [43], [44], CGC [28], [45]) para predecir su capacidad de modificar la función de proteínas. Uno de los candidatos más interesantes fue un homocigotos c.
C162A
mutación en
FZD10
, un miembro de la familia de genes que codifican rizado Wnt ligando vinculante receptores [46]. El homocigotos
c.C162A
variante detectado en este estudio lleva a una sustitución de aminoácidos no sinónimos (p.N54K) en un residuo muy conservadas dentro del sitio de unión al ligando Wnt putativo (FZ dominio) [47] , [48]. FZD10 es un regulador positivo de la vía de señalización Wnt-βCatenin-TCF, se ha demostrado ser hasta reguladas en los tumores primarios de colon [49], y Wnt-beta catenina de señalización es conocido por ser aberrante en algunos adenocarcinomas de páncreas [50].
Tres variantes homocigotos estaban presentes en el supresor de tumores
DCC gratis (
eliminado en carcinoma colorrectal)
, que codifica un receptor netrina necesaria para la diferenciación celular [51], y también la inducción de la apoptosis en ausencia de ligando [52]. Las mutaciones y la pérdida de
DCC
previamente han sido implicados en el cáncer de páncreas, así como una gama de otros tipos de tumores [52], [53]. Una de las tres nuevas variantes detectadas en Capan-1 fue localizada en el sitio de empalme donante del intrón 20 a 21, cuatro bases aguas abajo del motivo GT crítico. Las otras dos variantes dieron lugar a mutaciones de proteínas no sinónimos (p.L1042 M y p.K1411T). Aunque ninguna de estas últimas mutaciones no sinónimas se ha informado anteriormente, ambos están situados cerca de residuos de interés: p.F1039S, mutado en el adenocarcinoma [54]; y p.Y1418, un residuo crítico fosforilada por Fyn, y necesario para la función DCC [55].
Las referencias cruzadas de los SNVS detectados en Capan-1 con el gen del cáncer de Consenso (CGC) [28], [45] identificado doce genes que han sido previamente demostrado para ser mutado en otros residuos en líneas celulares de cáncer o tumores primarios. Ninguna de las variantes identificadas en Capan-1 en este estudio se han descrito anteriormente. Sin embargo, la mayoría de estos cambios eran no-codificante o sinónimo cambios (Tabla S7). Una mutación no sinónima heterocigóticos se observó en el factor de la estabilidad del genoma puesto de control
La ataxia telangiectasia mutada gratis (
ATM
). Sin embargo, el residuo variante (p.R1585S) se encuentra fuera de los dominios funcionales conocidos y por lo tanto es difícil de predecir las consecuencias funcionales de este cambio. Una segunda novela mutación no sinónima heterocigóticos fue identificado en
TPR gratis (
translocado región promotora
), que codifica una proteína que interactúa con el complejo del poro nuclear. Esta mutación (p.V779I) abarca un residuo conservado dentro de un motivo conocido común a las proteínas de segregación de cromosomas, aunque la valina a isoleucina sustitución identificado aquí es probable que sea neutral.
Los patrones de sustitución de bases
Se trataba de evaluar si el patrón de sustituciones de una sola base en Capan-1 refleja la de otros genomas del cáncer. Los genomas línea celular humana previamente publicados, COLO-829 [36], y NCI-H209 [24] cada exhiben un patrón característico de sustituciones de bases, representativa de la exposición UV y carcinógeno tabaco, respectivamente. Se obtuvieron los datos de estos estudios, además de la de la línea celular de glioblastoma U87 MG [56], y un tumor de tipo basal de mama [57], para la comparación con Capan-1. Análisis comparativo de estas secuencias sugiere que Capan-1 no exhibió un patrón obvio de sustituciones de bases o una firma única representante de un mutágeno particular. La mayoría de las sustituciones de codificación (~ 45%) en Capan-1 eran C & gt; T /G & gt; A, aunque éstos no eran tan predominante como se observa en las células COLO-829 donde C & gt; T transiciones en los sitios dipyrimidine, indicativo de la exposición UV , predominar [36] (Fig. 2D). Con base en el número limitado de los genomas del cáncer que se han secuenciado hasta la fecha, el patrón de sustituciones de bases observadas para Capan-1 más se asemeja a la de U87 MG y el cáncer de mama de tipo basal, solamente difieren de forma significativa en el porcentaje de A & gt; G /T & gt;. C mutaciones (Fig. 2D)
también compararon el patrón de sustituciones de bases en Capan-1 en todo el genoma en comparación con el exoma. Hemos observado que el patrón era en gran parte la misma en regiones codificantes y no codificantes, excepto que C & gt; T /G & gt; A mutaciones fueron representados en una frecuencia más alta en el exoma, con los números más bajos concurrentes de A & gt; C /T & gt; sustituciones G (Fig. 2E).
Caracterización de codificación de indeles
en cuanto a la SNVS, novedosos indeles identificados en la línea celular Capan-1 se filtran de acuerdo con el número de copias. Hemos tomado nota de que 93 genes fueron afectadas por pequeños indeles, que van de uno a seis pares de bases (Tabla S8). Se identificaron más deleciones en comparación con inserciones (Tabla 5), como era de esperar por el uso de métodos de alineación con huecos. 18 de los indeles (nueve inserciones, deleciones nueve) eran homocigotos variantes, mientras que 62 eran heterocigóticos (27 inserciones, deleciones 35). De manera similar a la SNVS, los efectos de variación fueron clasificados de acuerdo a la transcripción (163 a través de los 93 genes), y se detectaron la mayoría de indeles (72%) en las regiones no codificantes. Sólo el 13% de indeles provocó desplazamientos del marco y 15% afectadas sitios de ayuste. El sello distintivo
BRCA2 c.6174delT
mutación en Capan-1 [14], [15] fue uno de los 15 genes anotados como afectados por supresiones de codificación del marco de lectura.
Un subconjunto de los desplazamientos del marco de codificación de alta confianza fue validado por PCR y secuenciación de Sanger convencional, usando una muestra de ADN genómico biológica replicar. Ocho nuevos desplazamientos del marco (homocigotos:
PAPLN
; Heterocigotos:
EPHB2
,
LRRC7
,
DDIT4L
,
ADD3
,
SF1
,
C17orf57
, y
ZNF599
) presente en Capan-1, pero no se detecta en los genomas de HapMap fueron confirmados por secuenciación de Sanger, además de otras 17 y 10 del marco de lectura indeles tres pares de bases comunes a ambos Capan-1 y HapMap. Todos los nuevos desplazamientos de marco, así como los indeles en-marco, fueron autenticadas por secuenciación de Sanger (Fig. 3A-D y datos no presentados). Cinco de los desplazamientos del marco de baja velocidad que no lograron pasar los filtros estrictos no se pudo confirmar, apoyando la validez de nuestro análisis. Algunos de los genes afectados por el marco de lectura, como
EPHB2
, se han asociado previamente con la génesis de tumores en otros órganos [58], aumentando la posibilidad de que un número de estos pueden representar nuevos mutaciones del conductor.
A. Cromatograma que representa la supresión de C (resaltado en azul) en
PAPLN
detectado por Capan-1. La secuencia de referencia genómico se muestra por encima del cromatograma. La flecha indica la posición de la deleción. B. Como A, para la supresión de C en
EPHB2
. C. Como A, T & gt; C SNV y la supresión de T en
DDIT4L
. D. Como A, eliminación de AG en
ZNF599
. E. Comparación del porcentaje de indeles de 1, 2, 3, o & gt; 4 pb de longitud que se flanqueada por homología en Capan-1, COLO-829, COLO-829BL, PD3689a, y PD3690a. La homología se define como tener la misma secuencia que las bases insertados o eliminados ya sea inmediatamente 5 'o 3' a la indel, como se representa por los ejemplos.
contexto de la secuencia de indeles
se ha planteado la hipótesis de que los defectos en la recombinación homóloga, tales como los que resultan de la pérdida de la función de BRCA2, pueden conducir a un aumento en pequeñas deleciones [10], [59]. Estos pueden ser flanqueados por secuencias repetitivas, si los procesos alternativos de reparación del ADN de doble filamento romper, como extremos no homólogos o unirse sola línea de recocido están involucrados en la restauración [10], [15], [59]. Sobre esta base se examinó el contexto de la secuencia inmediata de los pequeños indeles detectadas en el genoma de las células Capan-1, y los comparo con los dos
BRCA2
tumores deficientes secuenciados en el conjunto de datos Stephens [27], además de la
BRCA
-proficient COLO-COLO-829 y 829BL de par combinado [36]. Indeles se clasificaron por la longitud (1, 2, 3, o 4+ pb), y se calificó a si la secuencia flanqueante 5 'o 3' a la indel era idéntica a la secuencia insertada /borrado (Fig. 3E). En la comparación /HapMap Capan-1, más de 60% de los indeles detectados en Capan-1 eran idénticos a la secuencia flanqueante. Esto es significativamente más de lo que se esperaría por azar (50, 12.5, 3, y 0,8%, respectivamente, para un 1, 2, 3, y 4 indel pb) y fue considerablemente mayor que el observado en el en COLO-829 /Colo- comparación 829Bl, donde se presume HR está activo. Capan-1 exhibe una mayor frecuencia de indeles asociados con homología de COLO829 a pesar de la mucho mayor profundidad de la secuencia genómica generada por COLO829. Por lo tanto las observaciones hechas para Capan-1 son poco probable que sea un artefacto como resultado de las diferencias en la profundidad de secuenciación. Además, la asociación entre indeles y homología flanquean sigue siendo alta para todas las longitudes de indeles en Capan-1, lo que contrasta con las otras líneas celulares (Fig. 3E). Los
BRCA2
muestras tumorales deficientes PD3689a y PD3690a tienen frecuencias más bajas de indeles flanqueadas por homología, aunque es posible que estas tasas son insuficientemente representados debido a la profundidad de secuencia bajo utilizado en su análisis (Fig. 3E) . En su conjunto, esta observación sugiere que
BRCA2
células tumorales deficientes pueden estar predispuestos a una incidencia más frecuente de indeles en secuencias repetitivas cortas.
Discusión
Aquí hemos generado el primer análisis de la secuencia del genoma completo de un
BRCA2
línea celular deficiente en. También representa la primera secuencia de una línea celular ampliamente utilizado derivada de un tumor pancreático.