Extracto
resistencia a cisplatino es una de las principales razones que llevan a la alta tasa de mortalidad de cáncer de ovario . secuenciación metil-Captura (MethylCap-ss), que combina la precipitación de ADN metilado por recombinante dominio de unión a metil-CpG de la proteína MBD2 con NGS, análisis global e imparcial de los patrones globales de metilación del ADN. Aplicamos MethylCap-ss para analizar el perfil de metilación del ADN en todo el genoma de cisplatino sensibles A2780 línea celular de cáncer de ovario y su derivado isogénicas línea resistente A2780CP. Se obtuvieron 21.763.035 prima lee para la A2780CP línea celular resistente a los medicamentos y 18,821,061reads para el A2780 línea celular sensible. Se identificaron 1.224 hiper-metilado y 1216 DMR hypomethylated (diferencialmente metilado región) en comparación con A2780CP A2780. Nuestros datos MethylCap-ss en este modelo resistente al cisplatino cáncer de ovario siempre un buen recurso para la comunidad de investigación. También se encontró que A2780CP, en comparación con el A2780, tiene baja observada a las relaciones de CpG metilados esperados, lo que sugiere una metilación CpG mundial menor en las células A2780CP. PCR específica de metilación y la secuenciación de bisulfito confirmaron hipermetilación de PTK6, PRKCE y Bcl2l1 en comparación con A2780CP A2780. Además, el tratamiento con el reactivo de desmetilación 5-aza-DC en las células A2780 demethylated los promotores y restauró la expresión de PTK6, PRKCE y Bcl2l1
Visto:. Yu W, Jin C, Lou X, X Han, Li L, Él Y, et al. (2011) Análisis global de la metilación del ADN mediante secuenciación Metil-Captura Revela control epigenético de la resistencia a cisplatino en la célula del cáncer ovárico. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10.1371 /journal.pone.0029450
Editor: Matteo Pellegrini, Instituto UCLA-DOE de Genómica y Proteómica, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Octubre, 2011; Aceptado: 29 Noviembre 2011; Publicado: December 22, 2011
Derechos de Autor © 2011 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos para BL por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, 2007DFC30360]. Este trabajo es apoyado por los fondos a JZ de la National Science Foundation (30921140312), Programa Nacional de Investigación de Investigación Básica (2009CB825606, 2009CB825607 y 2010CB912802) y Grant Colaboración Internacional (2009DFA31010) para XD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la resistencia a fármacos es la razón principal que conduce a la alta tasa de mortalidad de cáncer de ovario. El agente quimioterapéutico cisplatino (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) es particularmente eficaz contra el carcinoma de ovario con una tasa de respuesta inicial de hasta 70% [1]. Sin embargo, el cáncer de ovario se desarrolla eventualmente resistentes a cisplatino, y la tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes es sólo el 15-20% [2]. El cisplatino media sus acciones mediante la formación de aductos de ADN principalmente aductos de reticulación intra-filamento [3] y activa las vías de transducción de señal incluyen varios los ATR, p53, p73, y las vías de MAPK, que resulta en apoptosis [3], [4].
metilación del ADN se asocia a menudo con la represión transcripcional de la expresión génica [5] y con las respuestas a la quimioterapia [6], [7]. Un ejemplo clásico es que la metilación de la MGMT (metiltransferasa O6-metilguanina-DNA) promotor en gliomas es un predictor útil de la capacidad de respuesta de los tumores a agente alquilante carmustina [1,3-bis (2-cloroetil) -1-nitrosourea] , así como de la supervivencia global y libre de enfermedad en los gliomas [6]. En los cánceres de ovario, Taniguchi et al. proponer un modelo de progresión del tumor de ovario en el que la metilación inicial de FANCF es seguido por FANCF desmetilación y finalmente resulta en la resistencia a cisplatino [7]. la metilación del ADN de varios genes en el cáncer de ovario incluyendo HSulf-1 [8], ABCG2 [9], EZH2 [10] se han encontrado para ser asociado con la resistencia a fármacos. Boettcher et al. analizada de alta definición de perfiles de metilación del ADN de 800 islas CpG (CGIs) de los genes seleccionados e identificados que hiper-metilación en CGI de BRCA1, CDH1, DNAJC15 y SULF2, así como hipo-metilación de los CGI para ABCB1, APC y HIC1 genes mostraron un aumento tolerancia doxorrubicina [11]. Chang et al. usado la expresión génica global de perfiles para analizar células cancerosas antes y después del tratamiento de ADN metiltransferasa inhibitor5-aza-2 'desoxicitidina, que re-activa metilación de genes silenciados [12]. Se identificaron varios cientos de genes que se redujeron reguladas en las células cancerosas resistentes al cisplatino y reactivado por el inhibidor de la ADN metiltransferasa 5-aza-2'- desoxicitidina [12]. Li et al. en comparación con el patrón de metilación del A2780 y su línea celular resistente a la deriva después de varios ciclos de selecciones de drogas utilizando conjuntos de CGI y global de la metilación de ARNm microarrays de expresión [13].
Aprovechando la secuenciación de la próxima generación de tecnologías (NGS) , la fracción metilada de genoma capturado por MeDIP-seq [14], MethylCap-seq [15] y methylcap-seq [16] se han perfilado en una profundidad mayor que la plataforma basada en la matriz, que revela muchas regiones novedosos que son diferencialmente metilado con el contenido biológicos. Aquí se presenta la comparación de los patrones de metilación del ADN globales de ciplatin sensible (A2780) y (A2780CP) las líneas celulares resistentes ováricos para los controles epigenéticos clave responsables de la resistencia a cisplatino. Se identificaron 1.224 hiper-metilado y 1216 DMR hypomethylated (diferencialmente metilado región) en comparación con A2780CP A2780. También se encontró que A2780CP, en comparación con el A2780, tiene una metilación CpG mundial inferior. Varios genes se confirmó que tanto la metilación del promotor y la expresión correspondiente cambia incluyendo PTK6, PRKCE y Bcl2l1, y el tratamiento con el reactivo de desmetilación 5-aza-DC en las células A2780 desmetilados los promotores y restauraron su expresión.
Resultados
análisis Methylomic del A2780CP resistentes a cisplatino y su línea celular A2780 cisplatino sensibles isogénica
línea celular de carcinoma de ovario humano A2780CP (cisplatino-resistentes) se derivó de A2780 línea celular (cisplatino-sensibles), pero muestran una mayor resistencia al cisplatino [17]. A2780CP y A2780 son isogénicas (mismo ADN genómico). Para confirmar que la línea celular A2780CP todavía había mantenido la resistencia a cisplatino, se realizó el ensayo de MTT para evaluar las respuestas de drogas cisplatino de células A2780CP y A2780. Se encontró que el IC50 de A2780CP (5,0 mg /ml) es casi 3 veces mayor que la de A2780 (1,8 mg /ml) (Fig. 1). Nuestros datos son consistentes con la anterior informó de perfiles de respuesta de cisplatino A2780CP [17], lo que indica que las líneas celulares que teníamos en el laboratorio conserva la diferencia en la resistencia a cisplatino.
Tanto A2780 y A2780CP fueron tratados con cisplatino en diferentes las dosis de 0 mg /ml a 16 mg /ml durante 72 horas.
Hemos aplicado, por tanto, MethylCap-ss para analizar los perfiles methylomic de ambas células A2780 y A2780CP. Se obtuvieron 21.763.035 prima lee para la A2780CP línea celular resistente a los medicamentos y 18,821,061reads para el A2780 línea celular sensible. 13.950.202 (64,1%) y 13671899 (72,6%) lee fueron asignadas de forma única al genoma humano para A2780CP y A2780, respectivamente
Hemos anotado las lecturas con respecto a las islas CpG en el genoma humano (http:. //Genoma .ucsc.edu /) y se encontró que aproximadamente el 1,4% y el 2,5% de las lecturas localizan en el interior de las islas CpG, respectivamente A2780CP y A2780.The profundidad media de secuencia para las islas CpG cubiertas es de aproximadamente 16 y 24,5 veces. Alrededor del 68% y el 66% de las islas CpG humanos fueron cubiertos en nuestro análisis de A2780CP y A2780, respectivamente (Tabla 1). La cobertura de CpG y la profundidad que obtuvimos en nuestra MethylCap-ss es similar a lo publicado previamente [18].
Para detectar las regiones de metilación diferencial (DMR) en el genoma humano entre las células sensibles y resistentes, utilizamos MEDIPS, una herramienta de software desarrollada recientemente especializado para analizar el análisis de metilación basado inmunoprecipitación (por ejemplo MeDIP-ss y MethylCap-ss) [19]. Hemos establecido los criterios para DMR significativos: la longitud de los picos se establece en 500 pares de bases y picos con & gt; 20 rpm (lee por millón), p-valor inferior a 0,001 y la relación de revoluciones entre dos líneas de células & gt; 20. Se obtuvieron 1224 DMR que es hiper-metilado en comparación con A2780CP A2780 (Tabla S1) y 1216 DMR que se hiper-metilado en comparación con A2780 A2780CP (Tabla S2). Estos DMR fueron anotados con sus lugares del genoma y los genes asociados dentro de -5 a +5 K pb pb K a los sitios de inicio de la transcripción (Tabla S3 y 4).
Casi la mitad de los DMR se encuentra a menos de 5 k pb de transcripción empezar sitios (TSS) de los genes. 190 y 270 DMR se encuentran aguas arriba de los SAT, respectivamente, en A2780 y A2780CP (Tabla 1). El resto asigna a otras regiones del genoma humano, incluyendo intrones, exones, regiones intergénicas y repeticiones (Ensembl anotaciones del genoma humano) (Fig. 2A). regiones hypermethylated en promotores de genes son conocidos por disminuir la expresión de genes [17], pero el efecto de las regiones hipermetilación en otro lugar dentro de la región del gen no son concluyentes. La hipermetilación de secuencias genómicas repetitivas podría prevenir la inestabilidad cromosómica, translocaciones, y la alteración del gen causada por la reactivación de las secuencias de ADN de transposición [17], [20].
A. Porcentaje de picos hypermethylated en función de sus características genómicas localizadas. B. Distribución de CpG
O /E para los picos hypermethylated en función de sus características genómicas localizadas.
Li et al. en comparación A2780 isogénica y su línea celular resistente seleccionada utilizando los microarrays oligo 60-mer que contiene 40.000 fragmentos ricas en CpG de 12.000 promotores de genes conocidos (Agilent, Santa Clara, CA) [13]. El uso de un valor de corte de 1,5 veces, identificaron 595, 870 y 1.176 genes hypermethylated para las sublíneas resistentes RONDA1, Round3 y Round5 que comparan a los Round0 ( "") A2780 células parentales [13]. La tecnología que utilizan es la hibridación de metilación diferencial (DMH) [21], en el que metila el ADN se separó del no metilado por metilación diagestion enzima sensible para sondear la matriz de oligonucleótidos de las regiones de la isla CpG humanos. DMH es diferente de MDB-ss, en la que metila el ADN se precipitó por recombinante dominio de unión a metil-CpG de la proteína MBD2, y luego se secuenció. En DMH, el ADN aislado se digirió con la enzima de restricción insensible a metilación BfaI (C∧TAG), se ligaron a enlazadores, y se digirió de nuevo con las enzimas de metilación sensibles HinP1I (G∧CGC) y HpaII (C∧CGG). Los productos de la digestión fueron entonces amplificados utilizando enlazadores y se marcaron con los tintes Cy3 o Cy5 para hibridaciones comparativas [21]. A pesar de las diferentes tecnologías utilizadas, comparamos nuestros datos MDB-ss con los datos del DMH Li et al.. Se encontró que 221 (de 1224, 18,1%) y 142 (de 1216, 11,68%) de los genes hypermethylated y hipometilados en A2780CP en comparación con A2780 estaban también en la matriz que Li et al. utilizado (Tabla S3, S4). Se encontró que 15 regiones (correspondientes a 13 genes) y 23 regiones (21 genes) que son comunes entre los dos conjuntos de datos (Tabla 2), que son altamente significativas solapamientos con probabilidades hipergeométrica de 1.11E-5 y 4.22E-20 respectivamente . Los genes comúnmente hypermethylated en las células resistentes incluyen la unión retinoblastoma proteína 8 (rbbp8), SRY-box 1 (SOX1), de tipo sin alas MMTV sitio de integración de la familia (WNT9A), factor de transcripción general IIIA (GTF3), y los genes comúnmente hypomethylated en las células resistentes incluyen soluto transportista familia 22 (transportador de monoamina extraneuronal) (SLC22A3), aldehído deshidrogenasa 1 familia (ALDH1A3), hialuronano sintasa 3 (HAS3) y el dominio CUB que contiene proteína 1 (CDCP1) (Tabla 2).
Hay 410 DMR hypermethylated (Tabla S3) y 316 hypomethylated (Tabla S4) en A2780CP en comparación con A2780 que no estaban en la matriz que Li et al. utilizado, y no han sido identificadas por el enfoque de DMH. Estos nuevos DMR revelaron el poder de MDB-seq en la identificación de nuevos DMR sin conocimiento previo de los promotores candidatos a ser puesto en matrices para ser utilizado en DMH. Además, estos nuevos DMR podría ser debido a diferencias en las líneas celulares resistentes a derivados que fueron utilizados por Li et al. y nosotros.
Una metilación CpG mundial menor en las células resistentes a cisplatino A2780CP en comparación con las células sensibles al cisplatino A2780
Para entender el patrón global de la metilación CpG en ambas líneas celulares, que analiza las características de GPC hypermethylated a través de todo el genoma mediante el recuento del número de CpG vecinos dentro de las regiones de 500 pb alrededor de los sitios hypermethylated y calculado el observado relación de CpG /esperado (CpG
O /e) para cada CpG utilizando el método descrito por Ruike et al . [22]. Hemos encontrado que, en general, tiene una menor A2780CP CpG
O /E a la de A2780, lo que sugiere una metilación CpG mundial menor en comparación con A2780CP A2780 (Fig. 2B, panel superior izquierdo). Las diferencias se manifiestan principalmente en la mayor CpG
O /E en el intrón y repiten secuencias de A2780 en comparación con la de A2780CP. La comparación de CpG
O /E a través de diferentes categorías región genómica (Fig. 2B), el CpG
O /E fue mayor que 0,6 en los exones y promotores para ambas líneas celulares resistentes y sensibles, pero menos de 0,6 en otra genómico regiones (repeticiones, intrones y regiones intergénicas) (Fig. 2B).
anotaciones funcionales y análisis de vías de enriquecimiento para los genes DMR
Se realizó el análisis de los genes GO hypermethylated tanto en la resistencia (Tabla S5) y la línea celular sensible (Tabla S6). Encontramos que los genes hypermethylated en la línea de células sensibles fueron enriquecidos por los términos de GO: anti-apoptosis (GO: 0006916), la regulación negativa de la muerte celular (GO: 0060548), y la regulación de la cascada intracelular de la proteína quinasa (GO: 0010627). Los genes hypermethylated en la línea celular resistente tienen varios términos relacionados con la regulación enriquecidos factor de transcripción tales como GO: 0030528 regulador de la actividad de transcripción y GO: 0003677 unión a ADN
También se realizó un análisis KEGG vía de los genes DRM y encontramos. que los genes con promotores hypermethylated fueron enriquecidos en los siguientes KEGG vías que incluyen 11 genes en hsa04010 (vía de señalización MAPK), 18 genes en hsa05200 (caminos en el cáncer), 5 genes en hsa04310 (vía de señalización Wnt), 5 genes en hsa00982 (metabolismo de los fármacos ), y 5 genes en hsa04115 (vía de señalización de p53) (Tabla 3).
Curiosamente, muchas proteínas ECM relacionadas y los canales de membrana se hypermethylated. Por ejemplo, KCNS1 y KCNA1, dos de potasio proteína de canal dependiente de voltaje, y SLC15A4 (soluto familia de transportadores 15, miembro 4) están hypermethylated en células A2780CP mientras SLC4A11 (soluto familia portador 4, el transportador de borato de sodio, el miembro 11) se hypermethylated en A2780 Células. COL18A1 (colágeno, tipo XVIII, alfa 1) se hypermethylated en las células A2780 mientras KRTAP10-6 (proteína asociada a la queratina 10-6) y LRFN5 (repeticiones ricas en leucina y fibronectina tipo III de dominio que contiene 5) se hypermethylated en las células A2780CP. También se identificaron hipermetilación en varios loci microARN incluyendo hipermetilación de MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3, y MIR10A en A2780CP y la hipermetilación del MIR185, MIR548Q, MIR642A y MIR661 en A2780 (Tabla 4).
Validación de los genes con los DMR por MS-PCR y secuenciación de bisulfito
la expresión de los genes con el promotor hypermethylated fue verificada por RT-qPCR, si la expresión fue significativa cambia entonces PCR específica de metilación (MS- PCR) se utilizó para validar el estado de metilación de las regiones DMR entre dos líneas celulares. Se identificaron los siguientes genes Bcl2l1 (BCL2-como 1), PPKCE (proteína quinasa C, épsilon), PTK6 (PTK6 proteína tirosina quinasa 6), RAC2 (C3 botulínica de sustrato de toxina relacionadas con ras 2), SECTM1 (secretada y transmembrana 1) y DDIT3 (daño del ADN-inducible transcripción 3) que cambió tanto en la metilación del promotor y de expresión. La figura 3A muestra los cambios de expresión de estos genes, y la Figura 3B muestra los patrones de metilación del promotor de estos genes. DDIT3 se hypomethylated en las células A2780 en comparación con A2780CP, mientras que el resto mostró lo opuesto (Fig. 3B). Para confirmar aún más DMR entre A2780 y A2780CP, se utilizó la secuenciación de bisulfito para secuenciar las regiones promotoras de los tres genes seleccionados al azar a partir de los 6 genes. Figura 3C mostró que todas las regiones promotoras del gen PTK6 recogido, PRKCE y Bcl2l1 se hypomethylated en comparación con A2780CP A2780.
A. PCR en tiempo real que muestra la expresión diferencial de los genes seleccionados entre el A2780 sensible cisplatino y las células resistentes a cisplatino A2780CP. B. datos MS-PCR que muestran estados de metilación diferencial en las regiones promotoras de los genes seleccionados entre las células A2780 y A2780CP. C. bisulfito resultado secuenciación de las regiones promotoras de los genes seleccionados PTK6, PRKCE y Bcl2l1 (ciclo blanco: CpG no metilado, ciclo de Negro: CpG metilado).
Restauración de la expresión génica de los genes afectados por DMR treatmentwith 5 reactivo de desmetilación -aza-dc
con el fin de confirmar aún más nuestros datos, se utilizó 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-dC) para ver los genes silenciados metilación si podemos volver a activar esa identificamos. 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC) es un análogo de la citosina. Cuando se incorpora en el ADN, que se une de forma irreversible las enzimas metiltransferasa, dando como resultado la reactivación de-pasiva methylationand de los genes silenciados epigenético [23]. Se utilizó 5-aza-DC para tratar tanto las células A2780CP y A2780 en diferentes dosis de 0 M a 10 mM. La expresión de los genes tratados con el más bajo (0 M) se comparó con el tratado con la dosis más alta (10 mM) de reactivo de desmetilación.
Hemos demostrado que hemos sido capaces de demethylate los promotores de la PRKCE hypermethylated, Bcl2l1, RAC2- PTK6, SECTM1 (Fig. 4A, B), y restauró su expresión tras el tratamiento con 5-aza-dC en las células A2780. Del mismo modo, hemos sido capaces de demethylate los promotores del gen DDIT3 hypermethylated, y restauró su expresión tras el tratamiento con 5-aza-DC en las células A2780CP (Fig. 4A, B).
A. La validación de los cambios de estado de metilación de MS-PCR para los seis genes están bajo tratamiento con 0 M y 10 M 5-aza-DC. B. cambios de expresión génica (eje Y, cambios veces relativas) de los genes seleccionados seis después del tratamiento con diferentes concentraciones (eje X) de reactivo de desmetilación 5-aza-DC.
Discusión
Se describe aquí por primera vez un análisis MDB-ss de un modelo de respuesta de cisplatino de las células de cáncer de ovario. Los cambios epigenéticos entre el par isogénicas de la A2780 sensible cisplatino y sus células A2780CP derivados resistentes sugieren un mecanismo de control epigenético para la resistencia a cisplatino. El conjunto de datos MDB-ss global generado para este par de células isogénicas será un recurso útil para la comunidad de investigación interesados en la resistencia a cisplatino y la epigenética, y en cáncer de ovario en general. la metilación del ADN Global cambia durante la carcinogénesis y es a menudo un factor de predicción de las respuestas de terapia. Por ejemplo, Anisowicz et al. mostró que incluso la parte normal del pulmón de un paciente de cáncer ya ha experimentado una pérdida de la metilación del ADN a nivel mundial en comparación con un individuo normal [24]. Kim et al. mostró que la metilación global de CpG desempeña un papel en el control epigenético de la radiosensibilidad en líneas celulares de cáncer de pulmón [25]. En los gliomas, LINE-1 metilación, un marcador global de la metilación del ADN, es proporcional a la Gestión de promotor metilación y superior LINE-1 metilación es un factor pronóstico favorable en GBM primaria, incluso en comparación con el promotor MGMT metilación [26]. Aquí se observó una metilación CpG mundial menor en las células A2780CP resistentes a cisplatino en comparación con las células A2780 sensibles cisplatino, lo que sugiere que los patrones de metilación de ADN mundial podrían ser capaces de predecir la resistencia a cisplatino para el cáncer de ovario. Se necesita mayor experiencia para evaluar esta hipótesis.
Se obtuvieron 1.224 y 1.216 DMR que es hiper-metilado o hipo-metilado en A2780CP comparación con las células A2780 (Tabla S1, S2). Encontramos que los genes hypermethylated en la línea de células sensibles fueron enriquecidos por los términos de GO para anti-apoptosis (GO: 0006916) y la regulación negativa de la muerte celular (GO: 0060548), lo que sugiere un posible mecanismo general de silenciamiento epigenético de genes anti-apoptosis, resultante de la sensibilidad a cisplatino. También se encontró que los DMR se enriquecen en varias vías de señalización, incluyendo la hsa04010 (vía de señalización MAPK), hsa04310 (vía de señalización Wnt), y el hsa04115 (vía de señalización p53) vías (Tabla 3). La vía de señalización Wnt se ha implicado en la progresión del cáncer de ovario y la quimiorresistencia [27]. La activación de las vías de MAPK JNK /p38 en respuesta a cisplatino podría conducir a la inducción de ligando Fas y la muerte celular en células de carcinoma de ovario [4]. P53 y su vía de señalización también se ha implicado en la resistencia a cisplatino en las células de cáncer de ovario [28], [29]. Nuestros datos sugieren que la regulación epigenética de estas vías de señalización es uno de los mecanismos para la participación de estas vías en la resistencia al cisplatino en las células de cáncer de ovario.
También hipermetilación identificado en varios loci microARN incluyendo hipermetilación de MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, y MIR10A en A2780CP y la hipermetilación de MIR185, MIR548Q, MIR642A y MIR661 en A2780 (Tabla 4). Los microARN han sido implicados en la resistencia a cisplatino en el cáncer de ovario [30]. Por ejemplo, Yang et al. mostraron que muchos miRNAs están desregulados en el cáncer de ovario humano, incluido el miR-214, miR-199a *, miR-200a, miR-100, miR-125 ter, y let-7 clúster, y que el miR-214 induce la supervivencia celular y la resistencia a cisplatino por la orientación PTEN [30]. microRNAs epigenetically silenciados han sido implicados en el cáncer [31], [32]. Sin embargo, la metilación de los genes miARN locus no se ha informado previamente para los cánceres de ovario; tampoco lo son los informes sobre la relación entre la metilación de los genes miARN y la resistencia a cisplatino. Nuestros datos podrían apuntar a una nueva dirección para el estudio de la metilación de microARN loci y cisplatino resistencia.
Hemos encontrado que, PTK6 (proteína PTK6 Bcl2l1 (BCL2-como 1), PPKCE (proteína quinasa C, épsilon) tirosina quinasa 6), RAC2- (C3 toxina botulínica sustrato relacionadas con ras 2), SECTM1 (secretada y transmembrana 1) se hypermethylated en las células A2780 sensibles al cisplatino y DDIT3 (transcripción daño del ADN-inducible 3) se hypermethylated en el A2780CP resistentes a cisplatino Células. Su expresión también se han cambiado también de acuerdo a la hipótesis de que la hipermetilación sería silenciar la expresión génica. Se confirmó el patrón de metilación de estos genes por MS-PCR, y también pudimos demethylate los promotores de estos genes y restaurar su expresión tras el tratamiento con 5-aza-DC, un agente que de-metilato, y se reactiva de genes epigenetically silenciados [ ,,,0],23].
Nos encontramos Bcl2l1 se hypermethylated en las células A2780 sensibles. Bcl2l1 (Bcl-XL) codifica una proteína perteneciente a la familia de proteínas Bcl-2, cuyos miembros proteínas actuar como reguladores anti o pro-apoptóticos [33]. La sobreexpresión de la proteína Bcl-xL se sabe que confieren resistencia a una amplia gama de estímulos potencialmente apoptóticas en los procesos de carcinogénesis incluyendo activación de oncogenes, la hipoxia y la matriz de desprendimiento [34] - [37]. Nuestro resultado revela que la hipometilación del Bcl2l1 en las células resistentes (es decir, la hipermetilación de Bcl2l1 en las células sensibles) daría lugar a una mayor expresión Bcl2l1, lo que confiere la resistencia al cisplatino. Nuestros datos es coherente con la observación por Williams et al. que la expresión de Bcl-xL en el carcinoma de ovario se asocia con la quimiorresistencia y enfermedad recurrente [38]. Tomando en conjunto, esto sugiere que la modulación de la expresión de Bcl2l1 (Bcl-XL) por medio epigenéticos podría ser una manera de superar la resistencia a cisplatino en las células de cáncer de ovario.
También identificamos PTK6 (proteína tirosina quinasa 6) como hypermethylated en las células A2780 sensibles a cisplatino en comparación con las células A2780CP. PTK6 fosforila directamente AKT y promueve la activación de AKT en respuesta al factor de crecimiento epidérmico [39]. La relación de PTK6 con cisplatino no se ha estudiado anteriormente. Además se justifica el análisis funcional de la función de PTK6 en la modulación de la resistencia a cisplatino. PPKCE (proteína quinasa C, épsilon) es otro gen que se hypermethylated en las células A2780 sensibles a cisplatino en comparación con las células A2780CP. PPKCE es un miembro de la familia de la proteína quinasa C (PKC), cuyos miembros fosforilar una gran variedad de dianas proteicas y están involucrados en diversas vías de señalización celular [40]. Curiosamente, el cisplatino fue capaz de inducir la fosforilación y translocación de PPKCE de la membrana plasmática a la membrana nuclear y a la fracción citosólica [41]. La hipermetilación de PPKCE en las células sensibles reduciría su expresión, lo que resulta en menos translocación a la membrana nuclear o fracción citosólica tras la adición de cisplatino. Sin embargo, si la reducción de expresión de PPKCE confiere sensibilidad al cisplatino en las células de cáncer de ovario sigue siendo objeto de estudio.
último, hemos identificado DDIT3 (daño de ADN-inducible transcripción 3) como hypermethylated en las células A2780CP resistentes a cisplatino en comparación con Las células A2780. También llamado GADD153 (detención del crecimiento y ADN de la proteína daño-inducible 153), DDIT3 codifica un miembro de la /proteína de unión a potenciador-CCAAT (C /EBP) de la familia de factores de transcripción, y se activa por el estrés del retículo endoplásmico, y promueve la apoptosis. DDIT3 (GADD153) expresión puede ser inducida por el cisplatino [42]. Hemos observado que es hipermetilación en las células resistentes, lo que resultaría en una reducción de la expresión de DDIT3. Es posible que el cisplatino actúa a través de DDIT3 para promover la detención del crecimiento y la apoptosis, y la reducción de expresión de DDIT3 en las células haría más resistentes a cisplatino. Sin embargo, el mecanismo detallado se mantuvo a ser investigado.
En resumen, hemos generado un conjunto de datos global para un modelo de resistencia a cisplatino cáncer de ovario y se identificaron varios genes que fueron sometidos a control epigenético para modular la resistencia a cisplatino. Estos genes podrían sirve como objetivos para superar la quimio-resistencia al cisplatino en el cáncer de ovario.
Métodos
Las líneas celulares
A2780 y A2780CP se cultivó en medio RPMI 1640 (Invitrogen) que contiene 10 % de suero bovino fetal (10099-141) a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Stephen Collins de la Universidad de California San Diego (California, EE.UU.).
citotoxicidad análisis
Tanto las células resistentes y sensibles fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una concentración de 4000 células /pocillo en cinco repeticiones con medio de cultivo completo. A continuación, las células se trataron con cisplatino en dosis diferente de 0 g /ml a 16 mg /ml. Después de 72 horas de incubación, las células viables y muertas se contaron mediante el ensayo de MTT, y sólo se incluyeron las células viables en el análisis de datos.
secuenciación del ADN modificado con bisulfito y la metilación específica de PCR
hemos preparado ADN genómico a partir de células cultivadas utilizando el DNeasy Blood & amp; Kit de tejido (Qiagen). Aproximadamente 200 ng de ADN era-bisulfito tratado con el kit de metilación-Gold DNA EZ (Zymo Research) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ZymoTaq Premix se utilizó para la metilación específica de PCR (MSP) y de acuerdo con estos cebadores (Tabla S7). PCR metilación específica se llevó a cabo en un volumen total de 25 l usando ZymoTaq Premix (investigación Zymo). reacciones MSP se sometieron a incubación inicial a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, y el recocido a temperatura apropiada durante 35 segundos y 72 ° C durante 40 segundos. La extensión final se llevó a cabo por incubación a 72 ° C durante 7 minutos. MSP productos se separaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio
Los cebadores para la secuenciación bisulfite modificados (Tabla S7) y MSP fueron diseñados por herramientas web MethPrimer (http:. //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. Las condiciones para la reacción de secuenciación bisulfite modificados son los mismos que MSP. Los productos se purificaron utilizando MinElute PCR kit de purificación, se clonó en el pMD 18-T vector (Takara) y se secuenció.
aislamiento de ARN y en tiempo real RT-PCR
ARN se extrajo usando el protocolo para el reactivo Trizol (Invitrogen). 2 g de ARN en primer lugar fue transcrito de forma inversa en 25 l con un kit de Archivo (Applied Biosystems) y 2 l se amplificaron mediante PCR en tiempo real (Bio-Rad CFX96 Sistema Rea-Time). muestras de cDNA se amplificaron con SYBR® Pre-mezcla Ex Taq ™. El perfil de los ciclos térmicos consistía en desnaturalización inicial a 95 ° C durante 30 segundos y 40 ciclos a 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 15 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos. Cada muestra se procesó por triplicado.
Tratamiento
5-Aza-2 'desoxicitidina
ováricos células de carcinoma A2780 Humanos y A2780CP se cultivaron durante 5 días en presencia de diversas concentraciones de 5-Aza -dC (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, y 10 mM). drogas fresca se añadió cada 24 h.
ADN metilado Encuadernación Secuenciación de proteínas (MethylCap-ss)
3 g de ADN genómico aislado como se ha descrito anteriormente fue fragmentado por sonicación con Bioruptor (Diagenode, Bélgica) y reparado fin, a-cola, y se ligó a 2,5 mmol de adaptadores "de gama sincronizado" (IDT Inc.) siguiendo el protocolo del fabricante recomendar (iluminación Inc). 1,2 g del ADN se fraccionó en una resina GST-MBD hecho en casa con un tampón de un aumento de la concentración de sal por etapas [16]. La fracción de alta concentración de sal se amplificó directamente por 12-ciclo de PCR [18]. La fracción de 350 a 450 pb de los productos de PCR se purificó en gel y se cuantificó usando un ADN Agilent 1000.
Las fracciones 250-400 pb de ADN se escindieron y se purificó como se ha descrito anteriormente. Los productos fueron evaluados y cuantificados usando un ensayo de ADN de Agilent 1000 series II y Qubitfluorometer (Invitrogen), respectivamente. Cada biblioteca se diluyó hasta 8 nM para la secuenciación en una Illumina Genome Analyzer II siguiendo el protocolo recomendado por la fabricación. Las imágenes obtenidas se analizaron y base llamada utilizando el software proporcionado Illumina GA tubería OLB 1.6.0 con la configuración predeterminada. La prima se lee de MethylCap-ss fueron sometidos al GEO base de datos que el número de acceso isGSE31418.
La fracción de ADN 250-400 pb de la fracción de gel fue amplificado purificado. Cada biblioteca se diluyó hasta 8 nM para la secuenciación por Illumina Genome Analyzer II siguiendo el protocolo recomendado por la fabricación. las imágenes obtenidas se analizaron y la base de la llamada utilizando el software proporcionado Illumina GA tubería OLB 1.6.0 con la configuración predeterminada. La prima se lee de MethylCap-ss fueron sometidos a la base de datos GEO (número de acceso GSE31418).
Asignación de Secuencia
Lee
secuencia del genoma humano y la información de asignación (Febrero de 2009, GRCh37 /hg19) se descargado de Ensembl sitio FTP (http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html).