Extracto
Estudios recientes utilizando las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento han identificado varios genes y las vías de forma recurrente mutadas en múltiples genomas del cáncer. Sin embargo, las consecuencias de la transcripción de estas alteraciones genómicas en genoma del cáncer siguen sin estar claros. En este estudio, se realizó un análisis integrado y comparativo de genomas enteros y transcriptomes de 22 virus de la hepatitis B (VHB) relacionados con la PI hepatocarcinomas (HCC) y sus controles emparejados. Comparación de la secuencia del genoma completo (WGS) y RNA-Seq reveló muchas pruebas de que varios tipos de mutaciones genómicas activan diversos cambios transcripcionales. No sólo las mutaciones en sitios de empalme, sino también mutaciones silenciosas en las regiones codificantes, profundas mutaciones intrónicas y los cambios estructurales causados aberraciones de empalme. integraciones VHB generan diversos patrones de transcripción de fusión virus-humana en función de gen afectado, como
de TERT,
CDK15
,
FN1
y
MLL4
. variaciones estructurales podrían conducir sobre-expresión de genes tales como ligandos Wnt, con /sin crear fusiones de genes. Por otra parte, teniendo en cuenta las mutaciones genómicas causar aberraciones de la transcripción, se podría mejorar la sensibilidad de la detección de mutaciones en los genes deletéreos conductor del cáncer conocidos (
TP53, AXIN1, arid2, RPS6KA3
), y las interrupciones recurrentes identificados en el cáncer de controlador putativa genes, como
HNF4A
,
CPS1
,
TSC1
y
THRAP3 Hoteles en los HCC. Estos resultados indican alteraciones genómicas en el genoma del cáncer tienen diversos efectos de transcriptómica y análisis integrado de WGS y RNA-Seq puede facilitar la interpretación de un gran número de alteraciones genómicas detectadas en el genoma del cáncer
Visto:. Shiraishi Y, Fujimoto A, Furuta M, Tanaka H, Chiba Ki, Boroevich KA, et al. (2014) Análisis integrada de todo el genoma y transcriptoma Secuenciación Revela Aberraciones Transcriptomic Diversos Impulsado por somáticos genómicos Los cambios en los cánceres de hígado. PLoS ONE 9 (12): e114263. doi: 10.1371 /journal.pone.0114263
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de mayo de 2014; Aceptado: 5 Noviembre 2014; Publicado: 19 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Shiraishi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. datos de mutación somática fue depositado a la base de datos ICGC (https://dcc.icgc.org/), que está disponible gratuitamente. archivos de secuencia de datos en bruto de WGS y RNA-Seq se han depositado en el Genoma-Fenoma Archivo Europeo bajo el código de adhesión EGAD00001001035, y su acceso es controlado por ICGC DACO
Financiación:. Los fondos para este trabajo provino del RIKEN del Presidente del Fondo de 2011, el Fondo de la princesa Takamatsu Investigación del cáncer, Fundación Takeda Ciencia, Grand-de Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (integradores de sistemas comprensión del cáncer de diagnóstico avanzadas, terapia y prevención), y Grant-en-Ayudas para jóvenes científicos ( B) 24700272. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, más de medio millón de personas en el mundo son diagnosticadas con carcinoma hepatocelular (CHC), el quinto y el séptimo cáncer más común en hombres y mujeres, respectivamente [1]. En la mayoría de los casos, los HCC desarrollan siguiendo la hepatitis o cirrosis causada por el virus de la hepatitis B (VHB), infección por virus de la hepatitis C, alcoholismo o enfermedades metabólicas, de los cuales el VHB es el factor más importante, especialmente en el sudeste de Asia y África al sur del Sahara África [1]. Aunque varias alternancias genéticas se han detectado en los HCC, tales como mutaciones de
TP53
y
CTNNB1
que codifica β-catenina [2], se requiere la caracterización más detallada del genoma del cáncer de hígado para la identificación de biomarcadores para la medicina personalizada y un desarrollo más eficaz de fármacos terapéuticos
.
los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento nos permiten una detección completa de mutaciones somáticas en los genomas del cáncer [3] y la secuenciación de alto rendimiento de los genomas de HCC ha revelado varias novedades los genes del cáncer de controladores tales como reguladores de la cromatina [4], [5] y las integraciones de virus recurrentes en el
de TERT
y
MLL4
loci [4], [6] - [8]. estudios genómicos actuales se centran principalmente en las mutaciones en regiones codificantes, y otros tipos de mutaciones tales como sustituciones de bases o indeles en las regiones no codificantes, y las variaciones estructurales (SVS) suelen ser ignorados, ya que su impacto en el desarrollo del cáncer es difícil de evaluar e interpretar hasta aquí. Un enfoque para la evaluación de la deleteriousness de estas mutaciones es comprobar las consecuencias de la transcripción de estas alteraciones genómicas. Para este propósito, entendimientos más amplios de las relaciones entre mutaciones y aberraciones genómicas de la transcripción en el genoma del cáncer son necesarios. Varios ejemplos de aberraciones de empalme [9], [10] y de genes fusiones [11] causadas por mutaciones genómicas son conocidos, y los estudios que utilizan los últimos datos de secuenciación de alto rendimiento aberraciones de transcripción específicos de cáncer identificados en varios tipos de cáncer [12], [13 ]. Sin embargo, todavía hay pocos estudios que comparan sistemáticamente mutaciones genómicas y aberraciones de la transcripción de la secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación del transcriptoma (RNA-Seq) de datos. Como tal, aún tenemos poco conocimiento sobre el paisaje del transcriptoma cáncer y sus relaciones con las mutaciones somáticas.
Anteriormente, hemos secuenciado y analizado WGS de 27 diversos tipos de cánceres de hígado [4], pero los efectos de gran parte de diversas mutaciones somáticas, incluyendo mutaciones no codificantes y SV, eran apenas interpretar utilizando sólo los datos de WGS. Por lo tanto, en este estudio, hemos añadido más WGS y sus datos de RNA-Seq correspondientes, totalmente de 22 muestras de HCC relacionado con el VHB, para determinar las alteraciones genéticas junto con su consecuencia transcripcional. y se realizaron análisis comparativos e integrada de sus grupos de trabajo y los datos de RNA-Seq (ver Fig. 1A para la visión general del estudio). En primer lugar, hemos identificado una variedad de eventos somáticos genómicas que incluyen mutaciones puntuales, indeles cortos, SVS y las integraciones de HBV a partir de datos de WGS. Entonces, después de la caracterización sistemática aberraciones transcriptómica específicos de cáncer, tales como diversos tipos de alteraciones de empalme (saltos de exón, el sitio de empalme se desliza, inclusiones pseudo-exón y las retenciones de intrones, ver fig. 1B), fusiones de genes incluyendo aquellas que implican secuencias de HBV, sobre -expresión eventos y cambios de nucleótidos a nivel de ARN, se investigaron las relaciones entre los cambios genómicos y transcriptomic detectados. Por último, proporcionando un perfil de mutaciones genómicas y aberraciones de la transcripción, se discuten las ventajas del análisis integrado del WGS y WTS para la detección sensible de los genes del cáncer de controladores.
(A) En primer lugar, hemos detectado varios tipos de genómica y transcriptómica cambios con respecto a los datos de RNA-Seq 22 de HCC. Los cambios que se caracterizan detectados por cada análisis se compararon para revelar los efectos de los cambios genómicos somáticas en aberraciones transcriptomic. (B) Los cuatro tipos de aberraciones de empalme definidos en este estudio. Las líneas verdes y las flechas indican la transcripción normal, mientras que las líneas rojas y las flechas indican las transcripciones aberrantes.
Resultados
eventos somáticos detectados por WGS
extrajeron el ADN de VHB congelada 22 -relacionado HCC tejidos y sus linfocitos normales emparejados, y secuenciado los genomas enteros sus mediante secuenciación masiva en paralelo. La información clínica y patológica se muestra en la Tabla S1 S1 en el archivo. La profundidad media de la secuenciación de los genomas (linfocitos) de cáncer y de control fueron 36,8 × y 29.9x, respectivamente, después de la eliminación de duplicaciones de PCR (Tabla S1 S2 en archivos). En total, se detectaron 209,055 (3,597-19,063) sustituciones somáticas (Tabla S4 en S1 Archivo). Entre ellos, 1.096 de sentido erróneo, 32 disparate y 35 mutaciones en sitios de empalme de las regiones codificantes de proteínas, fueron identificados, donde se definieron las mutaciones en sitios de empalme a ser aquellos sitios aceptores de corte y empalme y de los donantes que afectan situados en las primeras y las dos últimas bases de un intrón secuencia (esenciales sitios de ayuste). De los 5.725 indeles identificados en los genomas completos, 105 se localizaron en regiones codificantes de proteínas y 6 afectados sitios de ayuste esenciales. Los genes conductor inferidos en orden de significación estadística de recurrencia fueron
TP53
,
arid2
,
BRD7
,
HNF4A
y
RPS6KA3
(
P-valor
& lt; 0,001, Tabla S5 en S1 archivo). Además, se detectaron 2.254 SV (15-577 por tumor), de los cuales 1.168 afectados genes codificadores de proteínas anotadas. Además, 86 (0-12 por tumor) integraciones VHB se identificaron con 2 y 5 integraciones recurrentes en el
de TERT
y
MLL4
loci, respectivamente, lo que es consistente con estudios anteriores [4] , [6], [7], [8].
empalme aberraciones relacionadas con mutaciones genómicas
Un total de ARN extraído de los HCC congeladas 22 y sus tejidos no cancerosos del hígado adyacentes estaban sujetos a RNA-Seq, y su resumen se muestran en la Tabla S1 S3 en archivo.
en primer lugar, se investigó el estado de las transcripciones de todo mutaciones esenciales en sitios de empalme mediante la comprobación manual de los alineamientos de secuencia lee. Después de excluir las transcripciones sin expresión, hemos observado aberraciones individuales o múltiples de empalme para 19 de las 24 mutaciones en sitios de empalme esenciales restantes (3 empalme de sitio se desliza, 6 saltos de exón, y 13 retenciones de intrones, Figura S1 en S2 del archivo, el cuadro S6 en S1 File), lo que indica que las mutaciones somáticas en sitios de ayuste esenciales mostraron fuertes efectos sobre aberraciones de empalme como se esperaba. incluidos los genes afectados recurrentemente mutados genes de análisis de WGS (
TP53, arid2, HNF4A
y
RPS6KA3
), así como
AXIN1
.
Con el fin de obtener una lista completa de las aberraciones de empalme específicos del cáncer, que hemos detectado sistemáticamente cuatro tipos de aberraciones de empalme (deslizamiento empalme de sitio, omitir el exón, de inclusión pseudo-exón y el intrón retención, Fig. 1B) mediante el uso de algoritmos desarrollados internamente (ver Materiales y Métodos ). En general, se detectaron 292 aberraciones de empalme eventos (26 desliza el sitio de empalme, 41 saltos de exón, 77 inclusiones de pseudo-exón y 148 retenciones de intrones) (Tabla S7 en S1 Archivo). Puesto que hemos realizado no direccional RNA-Seq, discriminando entre la retención de intrón y antisentido transcripción específica del cáncer fue difícil, y por lo tanto los resultados de las retenciones de intrones deben ser interpretados con cautela. Esta lista incluye eventos de aberraciones correspondientes a los 10 sitios de ayuste esenciales investigadas anteriormente. PCR y secuenciación de Sanger validaron 154 eventos de splicing altamente específicos del cáncer fuera de la 239 detectado. Durante 72 eventos, que confirmó las aberraciones de empalme de destino para el cáncer y tejidos no cancerosos del hígado.
Además de las mutaciones esenciales en sitios de empalme, se identificaron varios tipos de mutaciones y indeles cortos que parecen ser las causas directas de las aberraciones de empalme observados, a través de cambiar las distancias de edición de empalme de donantes o aceptores motivos. Tres mutaciones cerca de las uniones exón-intrón (& lt; 10 pb), pero no en el sitio de empalme esencial causados aberraciones de empalme (Fig 2A, B, y C.). Tres mutaciones en regiones de codificación, lo que probablemente generan nuevos motivos donantes sitio de empalme, causada empalme de sitio tenía efecto (Fig. 2D, E, y F). Una mutación que afecta al
LAMB2
gen era sinónimo. Dos evento inclusión pseudo-exón que afecta
THRAP3
y
TSC1
parecía ser provocada por mutaciones somáticas en lo profundo de intrones proximal al nuevo punto de unión de empalme (Fig. 2G, y H). Por otra parte, siete saltos de exón, cuyos genes afectados incluyen varios genes supresores de tumores tales como
IQGAP2
,
ST7
y
TP53
, tenía largas deleciones entre los puntos de unión (Fig. 2I, J, y K). Además, ocho retenciones de intrones tenían reordenamientos dentro de los intrones correspondientes, por ejemplo,
RB1 gratis (Fig. 2L). Indican que varios tipos de aberraciones de empalme son frecuentemente impulsados no sólo por mutaciones en sitios de empalme esenciales, sino también mutaciones en regiones, incluyendo sinónimo mutaciones silenciosas, profundas mutaciones intrónicas, y SVs codificación. Por otro lado, una gran parte de las aberraciones de empalme (239/292 = 81,8%) no tenían mutaciones proximales (dentro de 1 kb) o SVS (a menos de 500 kb). Algunas de ellas se parecía probable que es causada por cambios epigenéticos [14], o los cambios expresivos en las transcripciones antisentido como se señaló anteriormente.
Exonic y las secuencias intrónicas se designan por letras mayúsculas y pequeñas, respectivamente. secuencias rojas son mutaciones somáticas en los HCC. números verdes en el lado de las secuencias de azul y son de edición distancias de adorno del donante de empalme (AG