Extracto
cáncer de CRC es una de las enfermedades más mortales en los países occidentales. Para el desarrollo de biomarcadores de pronóstico para CRC (cáncer colorrectal) la agresividad, se analizaron retrospectivamente 267 pacientes con CCR a través de una novela, la plataforma de biomarcadores multidimensional. El uso de la tecnología para el análisis qPCR nanofluídico e inmunohistoquímica de fluorescencia cuantitativa para el análisis de proteínas, se evaluaron 33 microRNAs, 124 mRNAs y 9 antígenos proteicos. El análisis se llevó a cabo en cada dimensión individual (microARN, un gen o proteína) utilizando tanto el modelo multivariante de Cox y el método de Kaplan-Meier. A partir de entonces, hemos simplificado los datos de supervivencia censurados en los datos de respuesta binaria (agresivos contra el cáncer no agresivo). Posteriormente, hemos integrado los datos en una puntuación de diagnóstico utilizando regresión inversa en rodajas para una reducción suficiente dimensión. La precisión se evaluó mediante el área bajo la curva ROC (AUC). Análisis sola dimensión llevó al descubrimiento de los factores individuales que eran predictores significativos de resultado. Estos incluyen siete microRNAs específicos, cuatro genes, y una proteína. Cuando estos factores se han cuantificado de forma individual como predictores de enfermedad agresiva, la zona más alta demostrable bajo la curva (AUC) fue de 0,68. Por el contrario, cuando todos los resultados de las dimensiones individuales se combinaron en biomarcadores integrados, AUC se incrementaron dramáticamente con los valores que se acerca e incluso superior a 0,9. Análisis sola dimensión genera predictores estadísticamente significativos, pero sus puntos fuertes son predictivos subóptima de utilidad clínica. Un nuevo enfoque integrado y multidimensional supera estas deficiencias. biomarcadores recién integrados derivados tienen el potencial para guiar de manera significativa la selección de estrategias terapéuticas para los pacientes individuales, mientras que dilucidar los mecanismos moleculares de conducción progresión de la enfermedad
Visto:. Mariani H, He S, M McHugh, Andreoli M, D Pandya, Sieber S, et al. (2014) Análisis integrado multidimensional se requiere para el precisos de pronóstico biomarcadores en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (7): e101065. doi: 10.1371 /journal.pone.0101065
Editor: John Souglakos, Hospital General Universitario de Heraklion y Laboratorio de Biología de Células Tumorales, Escuela de Medicina de la Universidad de Creta, Grecia
Recibido: April 15, 2014; Aceptado: June 3, 2014; Publicado: 2 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Mariani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una subvención del Programa de Investigación del Cáncer Ruth C. Donovan y por una donación liberal del señor y la señora Ruggles . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CRC es una de las enfermedades más mortales en todo el mundo. pacientes caucásicos con exhibición enfermedad local, regional o metastásico una tasa de supervivencia a 5 años del 66%, 44% y 4%, respectivamente [1]. estadio de la enfermedad en el momento de la cirugía está bien establecida como el factor pronóstico más importante en el CCR. En las dos últimas décadas, mediana de supervivencia global se ha incrementado de manera significativa con la introducción de nuevos agentes citotóxicos y terapias biológicas. La respuesta a estos tratamientos depende de determinantes moleculares cuya elucidación ha sido objeto de intensos esfuerzos de investigación y productivos. Ahora sabemos, por ejemplo, que los cánceres que albergan mutaciones activadoras del gen KRAS no responden a la terapia anti-EGFR [2]. Sin embargo, el objetivo de optimizar los protocolos de tratamiento basado en las características moleculares únicas del tumor de un individuo sigue siendo difícil de alcanzar. El desarrollo de nuevos biomarcadores que pueden identificar de forma fiable los pacientes en alto riesgo de progresión de la enfermedad y la muerte sería especialmente útil en la determinación de las circunstancias clínicas en las que se justifica la quimioterapia adyuvante. Considerando que la utilización de la antimetabolito 5-fluorouracilo (5-FU) es el tratamiento estándar para los pacientes con estadio III CRC, sus posibles beneficios en comparación con los riesgos en pacientes en estadio II CRC es un asunto de controversia y debate [3]. En ausencia de un factor de predicción clínica robusta de evolución de la enfermedad, la decisión de tratar o no tratar a pacientes en estadio II con 5FU no puede descansar en criterios objetivos y firmes. biomarcadores predictivos previamente identificados que habían mostrado una gran promesa en este campo incluyendo la telomerasa, factores de crecimiento transformante (TGFa y TGF), factores de crecimiento epidérmico (erbB2 y erbB3) y mucina (MUC1 y MUC2) han decepcionado en los estudios de utilidad clínica [4].
El enfoque tradicional para el desarrollo de biomarcadores se basa en una sola dimensión (microARN, un gen o proteína) el análisis en un intento de vincular una única entidad molecular para el comportamiento del tumor. Este método parece haber alcanzado su punto máximo que no es óptima para la toma de decisiones clínicas. enfoques multidimensionales previos han demostrado que a través de la combinación de biomarcadores procedentes de diferentes dimensiones un mejor conocimiento de la biología de la CRC se puede lograr [5], [6], [7]. En un intento de proporcionar opciones más personalizadas, hemos desarrollado un nuevo método que avanza aún más la integración e incorpora múltiples entidades moleculares de las tres dimensiones moleculares (microARN, genes y proteínas) al mismo tiempo para generar predictores exactos de los resultados en pacientes con CCR. Nuestros resultados demuestran claramente la superioridad de esta novela, enfoque multidimensional en comparación con las herramientas tradicionales de análisis dimensión única. Tenemos la esperanza de que los biomarcadores multidimensionales recién descubiertos proporcionar una base para la clasificación satisfactoria y la estratificación de los pacientes en ensayos clínicos prospectivos y al mismo tiempo revelar agentes moleculares y las vías que juegan papeles importantes en la progresión de la enfermedad siniestros CRC.
Materiales y Métodos
genes y expresión de micro-ARN evaluado con la tecnología nanofluídico
Una cohorte clínica de 267 pacientes con cáncer de colon se analizó en este estudio retrospectivo. Después de la aprobación de la Junta de Revisión Interna del Hospital de Danbury (DHIRB) y la recogida de la información clínica relevante, FFPE muestras se obtuvieron de los casos de cáncer de colon que habían sido conservados entre 2000 y 2008. De acuerdo con el protocolo del estudio (DH-17/12 ) incluido el pleno de-identificación de la información del paciente, DHIRB renunciado a la necesidad de consentimiento informado. FFPE muestras se cortaron a 10 micras de espesor y dos cortes de tejido fueron puestos en un tubo de 1,5 ml. A cada tubo, se añadió un mililitro de xileno para desparafinación seguido de la mezcla dos veces con un alto vórtice velocidad durante 3 minutos a temperatura ambiente. a continuación, el ARN total se extrajo de forma automática con la QIAcube utilizando el kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El ARN de las células SW837 se extrajo automáticamente con el QIAcube utilizando el kit miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. la cantidad de ARN y la calidad fueron evaluadas por Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El análisis se llevó a cabo utilizando el 48,48 matriz dinámica (Fluidigm Corporation, CA, EE.UU.) y una plataforma Biomark siguiendo el protocolo del fabricante, como se describe anteriormente [8], [9].
cuantitativa fluorescente inmunohistoquímica
inmunohistoquímica de fluorescencia cuantitativo se realizó para el análisis de proteínas. Las muestras de tejido se prepararon en un formato de tejido Micro Array (TMA): áreas representativas del tumor se obtuvieron a partir de formalina parafina fijo (FFPE) muestras de tumor primario incrustados, y hasta tres representativa replican núcleos de 3 mm de varios bloques tumorales fueron tomadas después de revisar y marcado de la hematoxilina y eosina tiñen diapositivas por patólogos certificados por la junta (SS) y PF. En total, se tomaron 630 núcleos y distribuyeron más de 16 diapositivas de 267 pacientes. tejidos FFPE utilizados como controles de la reacción incluyen colon normal, riñón, hígado, cerebro, mama, ganglios linfáticos, la tiroides, la piel, las amígdalas, el músculo esquelético y la vejiga junto con el cáncer de mama y cáncer de pulmón de células no pequeñas.
TMA diapositivas se deparaffinized en xileno y después rehidratar en soluciones de etanol diluido secuencialmente. La recuperación del antígeno se llevó a cabo calentando los portaobjetos en un vapor durante 30 minutos en una solución de Tris-EDTA pH 8,0. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada por el tratamiento de las diapositivas de reactivo Peroxidazed (Biocare Medical, Concord, CA) durante 5 minutos. La unión no específica se redujo por incubación con el fondo de francotirador (Biocare médica, Concord, CA) durante 10 minutos. Los portaobjetos se incubaron con los anticuerpos primarios y anticuerpos diana máscara de células epiteliales y estromales diluidos en diluyente de anticuerpo Da Vinci verde (Biocare médico, Concord, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los detalles de todos los anticuerpos son utilizados en la Tabla S1. Cyanine 5 (Cy5) directamente conjugado con tiramida (Perkin-Elmer, Boston, MA) a una dilución 01:50 fue utilizado como la detección fluorescente para todos los antígenos diana.
Análisis estadístico
Para análisis dimensional sola, la supervivencia global se calcula a partir de la fecha de diagnóstico de la fecha de la muerte o la fecha visto por última vez. Las medianas y las tablas de mortalidad se calcularon utilizando la estimación del producto límite por el método de Kaplan y Meier, y se empleó el test Log Rank sólo para evaluar la significación estadística. El análisis multivariado evaluó el papel clínico de cada factor emparejado con otras variables clínicas (edad, etapa, clasificación, tipo de tumor y de género), después de riesgos proporcionales de Cox. Para simplificar la cuestión de la censura, quitamos los pacientes que fueron censuradas dentro de los 3 años y transformaron los datos de supervivencia en respuesta binaria, ya sea agresivo o no agresivo. Para cada factor demostrado ser significativo en el análisis multivariante (valor de p & lt; 0,05)., El área bajo la curva (AUC) en el receptor característico (ROC) curva de funcionamiento se utilizó para evaluar el poder discriminatorio
Para análisis multidimensional, el conjunto de datos se dividió aleatoriamente en formación y las pruebas subconjuntos, con 125 casos en cada subgrupo. Múltiples biomarcadores se combinaron para producir una puntuación de diagnóstico que se utiliza como un predictor del resultado. Para generar la puntuación, que utilizó por primera regresión inversa en rodajas [10], [11] para hacer lo suficiente reducción de la dimensión mediante el cual existe información acerca de la distribución condicional de resultado se perdió durante la reducción de la dimensión. A continuación, una puntuación de diagnóstico escalar se calcula a partir de los datos de dimensiones inferiores generados en el primer paso por la razón de verosimilitud estadística que se ha demostrado ser óptimo entre todos los posibles funciones de múltiples marcadores para la evolución de la enfermedad binarios [12]. Este enfoque permitió la utilización de información procedente de múltiples marcadores simultáneamente sin la necesidad de hacer suposiciones con respecto a la distribución de los marcadores. Se utilizaron modelos de Cox y Kaplan-Meier para evaluar la significación estadística de biomarcadores multidimensionales en el análisis multivariado como se ha descrito anteriormente.
Resultados
análisis de la expresión de microARN
Los principales parámetros clínicos de los 267 pacientes con CRC incluidos en este análisis retrospectivo se ilustran en la Tabla 1. Todas las muestras fueron recogidas en la primera cirugía antes de cualquier tratamiento. Como era de esperar el factor clínico más importante para predecir el resultado fue la etapa de la enfermedad. Para los pacientes en estadio IV de la progresión fue rápida con una tasa de supervivencia media de 11 meses, mientras que para los pacientes en las primeras etapas, el resultado fue mejor (fig. 1). Todos los pacientes fueron tratados con la mejor atención disponible y este estudio se centrará en los predictores de pronóstico puros y no a factores predictivos de respuesta a tratamientos específicos. Como primer paso, que exhibió una serie de 33 microARN para identificar posibles predictores de resultados en el análisis multivariado incluyendo la edad y la etapa en el modelo de Cox. Los microARN fueron elegidos de acuerdo con el número de citas en PubMed utilizando como palabras clave los términos "cáncer colorrectal" y "microARN". Diez microARN (miR-532-3p, Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, miR-193a-5p, miR-145, miR-375, Mir-29a, miR-18a y miR-200b) fueron estadísticamente significativas con valores de la relación riesgo gama (RR) de menos de 1 para cada uno, lo que significa que la alta expresión se relaciona con un buen resultado (Tabla 2). Para apoyar aún más los resultados de los análisis de Cox, los datos también se evaluaron utilizando el método de Kaplan-Meier. Cinco puntos de corte quintil (25, 33, 50, 67 y 75) fueron utilizados para estratificar a los pacientes para alta y baja expresión de cada uno de microARN y log-rank test sirve para detectar si las diferencias en los resultados fueron significativos. El punto de corte quintil proporcionar el p-valor más bajo en la prueba de log-rank se utilizó como discriminador (Tabla 2). Siete microARNs (Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, miR-375, Mir-29a, miR-18a y miR-200b) se confirmó que eran significativos utilizando el método de Kaplan-Meier y las parcelas correspondientes se muestran en la figura . 2.
En la etapa roja pacientes I-II (n = 176), en fase III verde pacientes (n = 82) y en azul en estadio IV (n = 8).
se realizó un análisis de Kaplan-Maier dividir a los pacientes tan alto (verde) y nivel bajo (rojo). Supervivencia escala de tiempo es en meses. Todas las diferencias fueron significativas y los valores de p se presentan en la Tabla 2 (Log-rank test).
Análisis de la expresión de los genes
La tecnología ofrece la nanofluídico ventaja de permitir el análisis de microRNAs y sus genes diana (targetome) en la misma muestra de ARN debido al bajo volumen de cada análisis individual qPCR. Para realizar este análisis, se emplearon múltiples aplicaciones de software (www.miRbase.org) [13] para preparar una lista de genes que podrían ser blanco de ataque de los 33 microRNAs investigados en este estudio. La lista fue priorizada de acuerdo a una red funcional obtenida con el software DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov) [14] con el fin de enriquecer la piscina con objetivos viables y reguladores maestros de la expresión génica y la apoptosis. Después de un análisis inicial de 180 candidatos, nos hemos centrado en 79 genes cuya expresión es detectable en un gran número de pacientes con cáncer de CRC. Seis genes (MID1, INHBA, OSBPL3, BGN, DICER1 y FAP) fueron predictores en el análisis univariado (datos no presentados), pero sólo MID1 siguieron siendo significativas después de la corrección multivariante y el análisis de Kaplan-Meier (Tabla 3 y Fig. 3). Como segunda medida para aumentar posiblemente el número de genes candidatos, analizamos el conjunto de datos pública GSE14333 informes de análisis del transcriptoma de 290 pacientes con cáncer de CRC [15]. Para cada gen individual, se analizaron los datos y se calcula en un modelo de Cox multivariado como se describe anteriormente (Tabla 4). capacidad de predicción se confirmó mediante análisis de Kaplan-Maier usando un procedimiento de selección múltiple quintil para el corte como se describe anteriormente. Los 45 genes con los p-valores más bajos en el análisis multivariado fueron evaluados en nuestra plataforma de expresión génica nanofluídico. Sólo 3 de los 45 genes (7%) fueron confirmados como predictores de resultados, tanto en GSE14333 y nuestro entorno clínico en la regresión de Cox y el análisis de Kaplan-Meier (ANO1, KANK4 y IGFBP3, la Tabla 4 y Fig. 3).
se realizó un análisis de Kaplan-Maier dividir a los pacientes tan alto (verde) y nivel bajo (rojo). Supervivencia escala de tiempo es en meses. Todas las diferencias fueron significativas y los valores de p se presentan en la Tabla 3 (Log-rank test).
Análisis de la expresión de las proteínas
Para llevar a cabo el análisis en el nivel de proteínas, se optó por 9 factores (TUBB3, Elavl1, OSBPL3, IGFBP3, ANO1, HGF, GLI3, PPP2CA y ARNT2). TMA se preparó a partir de los mismos bloques de parafina empleados para el análisis de genes y microARN. núcleos por triplicado de cada caso se incluyeron en el TMA para capturar la heterogeneidad clonal, y cada TMA se analizó por triplicado mediante inmunohistoquímica fluorescente multiplexado, cuantitativo. Los núcleos se tiñeron con DAPI (canal azul), y del estroma y las células epiteliales se tiñeron con anti-vimentina (canal verde) y anti-citoqueratina (canal amarillo), respectivamente. Antígenos de interés fueron adquiridos en el canal rojo, y una imagen representativa del análisis de IGFBP3 y ANO1 se muestra en la Fig. 4A. Para cada proteína, la expresión se cuantificó con el software AQUA que utiliza un algoritmo no supervisado a cuantificar la expresión en compartimentos subcelulares definidas o "máscaras". En nuestro estudio, se seleccionaron cuatro máscaras: Tumor (citoqueratina +), del estroma (vimentina +), núcleos tumorales (DAPI + /+) y citoqueratina citoplasma de tumores (DAPI- /citoqueratina +). Para cada eje de 3 mm, se analizaron al menos tres subsegmentos electrónicos (histospots). Debido a análisis repetidos, se recogieron hasta 18 puntuaciones AQUA para cada paciente que luego se promediaron. GLI3, ARNT2 y HGF mostraron tinción predominantemente nuclear en algunas células cancerosas, mientras que en otros, la tinción fue predominantemente citoplasmática. Para explotar este fenómeno, se creó un índice dividiendo la nuclear sobre la expresión citoplasmática. Un valor & gt; 1 era típica de una fuerte tinción nuclear, mientras que un valor & lt; 1 indican un patrón predominantemente citoplasmática de expresión. La expresión de todas las proteínas y el índice se analizaron con análisis de regresión de Cox. Sólo expresión de ANO1 (en células de cáncer y en los núcleos de las células cancerosas) fue significativo en el análisis multivariante (tabla 5 y la figura 4B.)
A:. De arriba a abajo se representan las siguientes señales: antígeno de interés (canal rojo), núcleos celulares (DAPI), las células tumorales (citoqueratina), las células del estroma (vimentina) y la imagen resultante de la fusión. B: análisis de Kaplan-Maier de 267 pacientes de acuerdo con la expresión de AQUA decenas de ANO1 dentro de la máscara del tumor (ANO1_AQUA) y en el núcleo de las células cancerosas (ANO1_Nuclear_AQUA). Se realizó un análisis de Kaplan-Maier dividir a los pacientes tan alto (verde) y nivel bajo (rojo). Todas las diferencias fueron significativas y los valores de p se presentan en la Tabla 5 (Log-rank test).
Cálculo de la exactitud de predicción
dividió a los pacientes en dos clínicas grupos de interés para permitir la simplificación de los datos censurados en una respuesta binaria. Aquellos que sobreviven menos de tres años a partir del diagnóstico se marcaron como tener una enfermedad agresiva, mientras que los que sobreviven durante más de tres años se considera que tienen la enfermedad más indolente, no agresivo. Cada uno de los factores individuales de las tres dimensiones anteriores (micro ARN, genes o proteínas) se ensayó como un predictor de la agresividad de la enfermedad mediante curvas ROC con cálculo del AUC. Aunque algunos factores fueron estadísticamente significativas en el análisis multivariante, el AUC máximo obtenido a partir de un solo biomarcador en una sola dimensión sólo fue 0,68 (ADAMTS5). Utilizando un predictor tan débil para el cuidado del paciente sería inaceptable, ya que es inexacta (ya sea un falso positivo o falso negativo) en aproximadamente un tercio de los casos.
Generación de biomarcadores multidimensionales
especula que , mediante la combinación de la información de diferentes dimensiones (micro ARN, genes y proteínas), que podría aumentar considerablemente la precisión de predicción. Sin embargo, la multidimensionalidad engendra complejidades y retos computacionales significativos. Mientras que en el análisis de la dimensión única del número de variables consideradas en nuestro caso es relativamente limitada en 188, análisis multidimensional de dos y tres variables produce 17.578 y combinaciones 1,089,836, respectivamente. El control de tipo 1 errores utilizando la validación cruzada se vuelve críticamente importante como el número de variables se eleva. Por esta razón, después de excluir 17 pacientes debido a datos incompletos, se asignó aleatoriamente a los restantes 250 pacientes a una formación o conjunto de pruebas (. Tab 1). Como primer paso, elegimos al azar dos o tres variables de todos los microRNAs, los genes y las proteínas que hemos considerado. Después de una reducción suficiente dimensión, las variables se combinaron en una nueva puntuación de diagnóstico, que incluye toda la información de los factores parentales. Cálculo demostró claramente que al aumentar la cantidad de datos de diferentes dimensiones, las AUC aumentó calculados en el conjunto de entrenamiento (Fig. 5A). Después de cálculo de todos los predictores 1,089,836 multidimensionales, se seleccionaron las combinaciones con la más alta clasificación de las AUC. A continuación, añade un biomarcador adicional a la vez, un microARN, gen o proteína, en las combinaciones existentes teniendo en cuenta todas las combinaciones posibles, y se calcularon los valores de AUC de nuevo en el conjunto de entrenamiento (Fig. 5B). Este proceso se repitió hasta que los AUCs alcanzó un máximo y no aumentó significativamente mediante la adición de predictores adicionales en las combinaciones existentes. se alcanzaron los valores máximos cuando el número de variables dentro de cada combinación llegó a 10 en el conjunto de entrenamiento (Fig. 5B). A partir de entonces, se analizaron los mejores combinaciones en el conjunto de pruebas y encontramos 15 biomarcadores multidimensionales (MB) que mostraron valores de AUC & gt; 0,83 en la formación y las pruebas de ajuste (composición se presenta en la Tabla 6, 7 y 8) el apoyo a la idea de que multidimensional biomarcadores son más precisos que cualquier predictor dimensión solo individuo. De esta lista, se seleccionaron los 4 marcadores biológicos más precisos multidimensionales (MB1 a MB4), cada uno con AUC de aproximadamente 0,9 en ambos conjuntos de entrenamiento y prueba (Fig. 6A). Su composición se muestra gráficamente en la Fig. 6B. Estos biomarcadores también fueron predictores pendientes del resultado en los análisis de Kaplan-Meier (Fig. 6C).
En el diagrama de caja, de abajo hacia arriba, que son Q1-1.5 * IQR, Q1, la mediana, Q3 y Q3 + 1,5 * Q3 donde Q1 es el primer cuartil (25
percentil), Q3 es el tercer cuartil (75
percentil), y RIC es el intercuartil (es decir, Q3-Q1). En A, el análisis se realiza con una sola variable, con toda la combinación posible de dos (n = 17 578) y tres variables (n = 1,089,836). En B, el análisis se realiza mediante la adición de una nueva variable (gen, micro ARN o proteína) para las combinaciones anteriores superiores.
carta gráfica de la composición de MB1-4 (B). En la proteína azul, verde y rojo, se reportan los genes y microARN. El análisis de Kaplan-Maier de la formación y las pruebas que figuran, según la expresión de los mejores 4 MB (C). Todas las diferencias fueron muy significativas (prueba de log-rank) y se presentan en la Tabla 7 y 8 para la formación y el conjunto de prueba, respectivamente.
Discusión
cáncer CRC sigue siendo una de las neoplasias más mortales. Para la gestión clínica, particularmente en la etapa II y III de la enfermedad, múltiples opciones terapéuticas están ahora disponibles. Como se ha observado también en nuestro estudio clínico del resultado se debe principalmente a la etapa clínica en el diagnóstico con pacientes en estadio IV que presentan un pronóstico grave. Sin embargo, incluso en pacientes con las etapas anteriores, el resultado no sólo es favorable con una tasa de recaída significativa. El descubrimiento de biomarcadores eficaces que pueden guiar las decisiones terapéuticas se buscan con ambición, con la esperanza de lograr los mejores resultados posibles, no minimiza los procedimientos necesarios y tóxicos. Una gran cantidad de estudios se han realizado con este fin [2], [16], [17]. El marcador ideal para conducir tratamientos clínicos debe ser significativo en el análisis multivariante mientras que la exactitud de predicción robusta, con pocos resultados positivos falsos y negativos falsos. Algunos éxitos limitados se han obtenido con respecto a la selección de los regímenes terapéuticos específicos de acuerdo a la toxicidad y la eficacia [2]. Sin embargo, la mayoría de estos prometedores biomarcadores individuales se han quedado cortos en los ensayos clínicos [18]. biomarcadores más complejos se han creado, aunque de una sola dimensión. Un panel de 12 genes fue eficaz en la predicción del riesgo de recurrencia y respuesta al tratamiento en un gran estudio clínico de 1436 pacientes de la fase II y III de pacientes con CRC [19]. Sin embargo, más tarde los estudios de validación no se reproducían los mismos resultados [20], ya que el talón de esta tecnología de Aquiles sigue siendo la falta de precisión en los estudios de validación independientes. En nuestro estudio pretendemos dimensión que la naturaleza de la variable, siendo microRNA, un gen o una proteína. Creemos que la falta de exactitud debería depender al menos en parte del hecho de que la firma 12-gen se obtuvo sólo en la dimensión de genes, la reducción de este modo el posible papel que otros factores tales como microARN y proteínas pueden tener en la capacidad de predicción de genes. Esta experiencia pasada nos llevó a revisar la manera en biomarcadores predictivos se construyen. la agresividad del cáncer es un rasgo complejo en la mayoría de los casos. Es como una ecuación multifactorial. Para hacer que el patrón más complejo, tales factores múltiples vienen de diferentes dimensiones, tales como genes, proteínas, secuencias de ADN y diferentes subconjunto de células (cáncer y del estroma). Nuestra idea fue el centrado de la predicción en un método integrado de análisis incluyendo más dimensiones y más factores al mismo tiempo. Creemos que sólo un enfoque integrado puede estar más cerca de la solución de una ecuación multifactorial. Los resultados que presentamos en este estudio apoyan nuestra hipótesis. En nuestra cohorte de pacientes con CRC, se analizaron en primer lugar un gran panel de posibles predictores individuales procedentes de cada una de las tres dimensiones individuales (micro ARN, genes o proteínas). Estábamos hecho capaz de identificar predictores estadísticamente significativos de resultado como se determina mediante análisis multivariante de Cox y el método de Kaplan-Meier. Algunos de estos factores predictivos no han sido ampliamente investigados en el CCR hasta la fecha. A modo de ejemplo, se encontró que la expresión de ANO1 (anoctamine 1) para ser estadísticamente significativa en el nivel de genes y proteínas, que se refuerzan los últimos datos procedentes del análisis del conjunto de datos GSE14333 [15]. Sin embargo, el AUC de ANO1 en nuestro análisis no fue mayor que 0,65, lo que significa que como motor de las decisiones clínicas, ANO1 sería clasificar erróneamente un número considerable de pacientes. Por lo tanto, la significación estadística no se traduce necesariamente en la utilidad clínica. El no reconocer este hecho puede dar cuenta de gran parte de la decepción con biomarcadores individuales procedentes de una única dimensión [4], [20].
No satisfecho con las AUC por debajo de 0,7 y con la esperanza de desarrollar predictores más robustos, hemos tratado de combinar nuestros datos en formas novedosas. En este manuscrito, proporcionamos los detalles de una plataforma multidimensional que combina la tecnología nanofluídico con inmunohistoquímica cuantitativa fluorescente para crear biomarcadores con AUC se acerca e incluso superior a 0,9. Mientras que el número de variables que deben ser analizados es inmenso, esta potente conjunto de herramientas puede recoger datos multidimensionales, a un costo de reactivos razonable para muestras FFPE ($ 0.20 para el análisis de genes /microARN, $ 0,85 por proteína).
Más allá de la predicción clínica resultado, nuestro ensayo puede resaltar los conductores moleculares de agresividad. Por ejemplo, IGFBP3 aparece en todos los cuatro primeros biomarcadores multidimensionales. Este antígeno es bien conocido por los investigadores en el CCR, aunque están presentes en la literatura en relación con sus efectos [21] datos contradictorios. A nivel de la expresión génica en tanto GSE14333 y nuestro conjunto de datos, alta expresión de IGFBP3 se relaciona con un peor pronóstico. Esto está en consonancia con otros estudios anteriores [21], [22], [23]. El peso de la evidencia seguramente implica a este gen como conductor prominente de la agresividad del cáncer de CRC a pesar de encontrarse en desacuerdo con los estudios más antiguos que conectan IGFBP3 expresión de un efecto antiproliferativo sobre el crecimiento de células de cáncer de colon (revisado en [24]).
Sólo dos variables que estuvieron presentes en 3 de los 4 principales biomarcadores multidimensionales: ADAMTS5 y el índice de HGF. ADAMTS5 es un miembro de los ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina) familia de proteínas. La enzima codificada por este gen contiene dos TS motivos y funciones C-terminal como agrecanasa para escindir aggrecan, un proteoglicano principal del cartílago [25]. Como factor único, en el conjunto de datos GSE14333, alta expresión se asocia con un mal resultado en múltiples sondas. Sin embargo, en nuestro análisis, este factor no mostró una tendencia significativa en el análisis multivariante tan solo elemento. La literatura sobre ADAMTS5 en el cáncer de CRC es limitada con un único estudio que informó este gen como uno de los más hypermethylated en el tumor en comparación con la mucosa colónica normal circundante [26]. La otra variable, HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) de índice, representa una vía que se conoce para ser activado en agresivo CRC. HGF se ha investigado extensamente como una nueva diana potencial (revisado en [27]). Aunque la expresión de HGF en la tinción de inmunoperoxidasa aparece con un patrón citoplasmático claro en células de cáncer de CRC [28], nuestro ensayo de inmunofluorescencia demostró un patrón nuclear que era de significación clínica. Una localización nuclear similar del receptor de HGF c-Met se ha reportado en las células del cáncer de mama, siempre que la sobreexpresión se relaciona con el aumento potencial de la enfermedad metastásica y agresivo [29]
En resumen., La agresividad del cáncer de CRC es una rasgo complejo que no se puede predecir con precisión adecuada mediante el uso de un factor individual, única dimensional (microARN, gen o proteína). Por el contrario, un enfoque integrado multidimensional que utiliza datos de microARN, genes y el análisis de proteínas puede generar predictores precisos de comportamiento biológico, promover un mejor manejo clínico de la CRC, y volcar la atención sobre las moléculas y las vías moleculares que están asociados con y pueden dar origen un mal resultado.
Apoyo a la Información sobre Table S1. List de anticuerpos, proveedores y concentración final utilizados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101065.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Este trabajo está dedicado a la memoria de Renato Andreoli, quien falleció de cáncer colorrectal a la edad de 57.